Name: use of high-throughput automated microbioreactor system for production of model igg1 in cho cells
Uploaded: 2018-09-28T13:00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells at JoVE.com

著者は、スコット リュートの分析の支援を感謝したいです。内部資金の一部とこの仕事のためのサポートは、品評クリティカル パス プログラム (CA #1-13) によって提供されました。このプロジェクトは、バイオ テクノロジー製品のオフィス、米国食品医薬品局、科学および教育のオークリッジ国立研究所によって管理でインターンシップ/研究参加プログラムに予約制で一部サポートされていた、米国エネルギー省と FDA の省庁間の契約。

<ol>
	<li>K&#246;hler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity.">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> Nature. 256, 495-497 (1975).</li><li>Buss, N. A., Henderson, S. J., McFarlane, M., Shenton, J. M., de Haan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibody+therapeutics:+history+and+future.">Monoclonal antibody therapeutics: history and future.</a> Current Opinion in Pharmacology. 12 (5), 615-622 (2012).</li><li>Jakobovits, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+fully+human+antibodies+by+transgenic+mice.">Production of fully human antibodies by transgenic mice.</a> Current Opinion in Biotechnology. 6 (5), 561-566 (1995).</li><li>Maksimenko, O. G., Deykin, A. V., Khodarovich, Y. M., Georgiev, P. 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免責事項: この出版物は著者の見解を反映しているし、FDA のビューまたはポリシーを表す解釈すべきではないです。

自動マイクロ バイオリアクター システムを正しく実行して効率的にタイムリーに複数の自動化された手順の実行が含まれます。ソフトウェアのプログラミング システムを実行する最も重要な部分の 1 つです。プログラムの書き込み中にエラーがある場合、戦略、サンプリング戦略や、研究の調査結果が無効になる最終製品の品質を供給プロセスで予期しない変更があります実験で重大なエラーがあるなります。システムを実行する別の重要な側面は、配置し適切な DO 制御を確実にクランプ プレートを正しく締です。そのクランプ プレートが厳しくない均等に最も一般的な徴候は容器 1、6、7、12 (角容器) は測定で予期しないバリエーションです。全体的には不安定性は、クランプ プレートのガス入口行でガスケットの緩みを示します。このシナリオは、かセット ポイントに到達を妨げる可能性があります。細胞実験を開始させる、ときを避けるためにもう一つの一般的な落とし穴は、接種手順では、それらを解決するための原因の中にあまりにも長い座っています。セルを座って過ごす時間が短く、少ないチャンスに徐々 に低い菌細胞数が、無意識のうちに重要なバイアスを引き起こすことができる容器に年代順に追加検討結果に害を与えます。すなわち細胞が 15 分以上接種プレートに座っていないので、一時停止の手順を 1 つの別の後各文化ステーションの接種を間に、複数の段階で接種することをお勧めです。
に関する日常的な使用、無菌性を維持することが重要です。システムは、生物学的安全キャビネットでは、フード、頻繁な出入りのため不妊は保証されません。その結果、70% の IPA でフードに行くすべて散布されること。第二に、それはカルチャーの中に最小限の泡が発生するようになってメディアは、毒ガス攻撃を詰まらせるし、クランプ プレートともコア コンポーネント下の損傷につながるラインを排気できます。予防対策フォーム追加の手順、あらゆるマイクロ バイオリアクター プログラム設計で重要です。うちの「泡」が発生した場合それはプロトコルを洗浄メーカーに有益であろうし、クランプ プレートの永久的な損傷を防ぐことができます。また、容積の比率に高い表面により、ほとんどの欠如とも効率的な酸素をバッチ モードで実行しているとき、非通気の容器の使用が細胞密度が低い、または有益な可能性があります。ヘッド スペースは成長する酸素の消費文化に追いつくために十分なしかし、非散布しました船は高細胞密度または灌流培養の役に立ちません。
それにより、フラスコを振るよりもより詳細に制御で小規模で並列に実行する複数の制御された文化として microbioreactor システムによって提供される多くの利点があります。17したがって、システム スクリーニングは、高スループットのクローン研究・遺伝子研究の実行を容易にします。自動液体ハンドリングも同時に訓練された人員のための退屈な時間のかかる労働を最小限に抑えながらアナリストのアナリストの変動が減少します。システムにいくつかの利点がありますが、考慮すべきいくつかの重要な欠点があります。15 mL の培養量最初に、プロセスでサンプリングと最後の収穫材料と複数の代替小規模バイオリアクターが大幅に制限 (最大 500 mL) 最近利用可能になっています。システムに 1 つの最近の進歩はノヴァ生物医学、細胞密度や栄養分析のための試料量を減らしてのプロセス サンプリング問題が緩和されるから BioProfile FLEX 2 アナライザー自動マイクロ バイオリアクターの統合.利点は、再利用可能な従来のシステムよりもユニットを購入するより高価なことがありますよう、長期的なプロジェクトのため使い捨てのユニットのコストを考慮する必要があります迅速なセットアップと運用コスト削減を事実上クリーニング先頭を含めることができます。
本稿で説明する方法は主にバッチ モード細胞培養に適していますが、ユーザーのニーズに応じて変更することができます。各文化ステーションと pH は、個々 の容器のレベルで変えることができる間、温度を独立に制御しています。縫は、マイクロ バイオリアクター システムに応じて変更する DoE 計画実験をできるように特別に設計されたソフトウェアを提供しています。製造元によって提供される新しい DoE のソフトウェアを使用して大規模な DoE 研究や最適化を補うメディアのに役立ちます。ここで使用していませんが、microbioreactor システムは、フェッド バッチ研究もできます。システムが灌流培養に最適化されていません。しかし、限られた研究と現在のマイクロ バイオリアクター システムで灌流細胞培養操作を模倣する試みがあった。26細胞沈降によって高密度灌流文化を模倣するようにこのメソッドを変更できます。原子炉にピペットを挿入されている高さを変化させることで、整定時間を最適化することにより、メディアを削除し、文化の豊富さミラーモードに補充することができます。文化の灌流モードが必要な場合ここで紹介システムより動作がありますこの発展途上地域に新製品があります。
要約すると、この自動マイクロ バイオリアクターの使用に示しますとの関連を生成し、モデル IgG1 モノクローナル抗体を特徴付ける町細胞培養操作の分析。ロールプレイ小規模マイクロ バイオリアクター バイオ製造とその細胞培養技術開発とメディア審査への影響を強調しています。自動化された小規模なシステムを使用する多くの利点がありますが、その利点プロセスに関する理解を完全に実現するために、分析特性が不可欠です。本研究は、開発および個々 の研究ニーズごとに改善できる自動マイクロ原子炉システムを使用するためのガイドラインとユーザーを提供します。

モノクローナル抗体 (Mab) は、マウス 1975年1ハイブリドーマ細胞で初めて作られました。それ以来、組換えタンパク質の生産の開発の増加は増加のvivo で安全および有効性2,3,4に Mab を人間的に開催をされています。組換え蛋白質生産プロセスのほとんどを採用、彼らは血清自由なメディア、生来の人間のそれと同じような翻訳後修飾蛋白質を作り出す能力に合わせることができる容易さのため中国のハムスター卵巣 (CHO) 細胞タンパク質とホスト細胞5,6としてその信頼性。
速くと一貫した品質を持つ大規模患者集団のために製品を提供する需要が高まっています。経済的利益だけでなく自己免疫疾患、移植後合併症、関節炎、癌の7を含む今 Mab で扱われる疾患のレパートリーは増えています。現代商業 mAb 生産ラインの平均収量は 5 6 g/L の範囲で通常、5を上昇し続けます。一部、これが町細胞工学と高スループット バイオリアクター8を使用して改善された生産ラインのスクリーニングを通じて達成されました。ただし、蛋白質の生産の増加はほとんどは、プロセスの改善、メディアの最適化、細胞培養条件の進歩を含むと強化戦略7,9,10を餌に起因しています。高品質の蛋白質の効率的な生産のためにも適切な細胞の成長だけでなく、栄養補給は欠かせません。さらに、細胞化学量論的戦略最適化6,11を供給するために付加的な理解を必要とする特定の栄養素添加が必要です。伝統的な手法には、個々 のメディア コンポーネントの滴定および混合物設計とブレンドするとメディアが含まれます。ただし、これらのメソッドは時間のかかる、労働集約型であり、ヒューマン エラーの12,13に関連するリスクを伴います。
メディア最適化研究は、シェイク フラスコおよび原料および人的資本の点で価があります 1-2 L バイオリアクターの以前していました。マイクロ プレートにも使用されているが、これらのメソッドは、制限された拡張性を提供します。さらに、このメディア組成と供給戦略14,,1516によるみ変動を不明瞭にするバッチ間の可変性を導入する複数の時間のかかる実行必要があります。したがって、高スループットおよび非常に一貫した並列型バイオリアクター システム登場17,18,19,20の必要はありません。
伝統的なベンチ スケール バイオリアクターの操作に関連付けられた重要な費用で (0.5-5 L)、microbioreactors 得られた薬剤の生産の生物学的評価のためにコスト削減の代替を提供しています。21ベンチ スケール撹拌槽バイオリアクターは信頼性の高い感覚アレイ経由で緻密なデータを提供しています。フィードバック制御システム操作の簡単な監視を可能にします。ただし、アセンブリ、校正、洗浄、人件費、基板のコスト、および滅菌要件は高価なベンチ スケール撹拌槽バイオリアクターと動作するように労働集約的にします。シェイク フラスコ、マイクロタイター プレート コストの一部を削除、労働問題より大きいスケール バイオリアクターに関連付けられているが、これらの選択肢弱い制御加工条件を提供し、頻繁にただエンドポイント測定低密度データが生成されます。22
また、microbioreactors は細胞と上流工程の開発にスケール ダウン アプローチを提供する小さな作業ボリュームを利用します。Microbioreactor 実験の規模は、電源、基板、労働、スペース、およびユーティリティの利用率の低下によるランニング コストを減らすことができます。23 Microbioreactors、シェイク フラスコ彼らは彼らのサイズのため扱いやすいが、彼らは pH、温度、そのオンラインのフィードバック制御による伝統的なベンチ スケール バイオリアクターの利点を保持という点で溶存酸素と酸/塩基のような消費だけでなく、ガス組成を含む品質パラメーターのリアルタイム データ出力。Microbioreactor スケールは高スループット スクリーニング機能として、クローンの選択とプロセスの開発に役立つことができることができます。24
高度なマイクロ スケール バイオリアクターは、町細胞培養プロセス特性評価および開発18の効果的なツールであること示されています。ここで、古典に匹敵することが示されている並行して、48 の microbioreactors から成る自動 ambr15 システムは、スケール アップの研究でタンク炉を攪拌、25がメディアに最適化された事前作業と同様の方法で使用されていた生産モデル キメラ IgG16町 DG44 セルラインの組成物。価と成長に及ぼすさまざまなメディア条件は比較され、分析されました。本稿では、microbioreactor システムと原油メディア サンプルの解析を実行する一般的なガイドラインが提示されています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:899px;" width="898">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:373px;">CHO DG44 Cell Line</td>
			<td style="width:191px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:157px;">A1100001</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ambr 15 automated microbioreactor system</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>001-2804</td>
			<td>automated micro bioreactor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ambr 15 Cell Culture 24 Disposable Bioreactors - Sparged</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>001-2B80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 mL disposable pipette tips, sterilized</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>A-0040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5 mL disposable pipette tips, sterilized</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>A-0039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">24 Well deep well plates</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>A-0038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 Well plates</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>A-0068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vi-Cell XR cell counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>731050</td>
			<td>automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EX-CELL&#160;Antifoam (gamma irradiated)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59920C-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CD OptiCHO AGT Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1122205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">200 mM L-glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-005-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">100X Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-001-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">125 mL F-Bottom Shake Flasks (Sterile, Vented)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PBV12-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">125 mL glass Spinner Flasks</td>
			<td>Corning Life Sciences Glass</td>
			<td>4500-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">250 mL PP Conical Centrifuge Tubes (Sterile)</td>
			<td>Nalgene (Thermo Scientific)</td>
			<td>376814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TC20 Automated Cell Counter</td>
			<td>BioRad Laboratories, Inc.</td>
			<td>1450103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypan Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10x PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BioProfile FLEX Analyzer</td>
			<td>Nova Biomedical</td>
			<td>49418</td>
			<td>Nutrient Analyzer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Octet Red 96</td>
			<td>Pall Fort&#233;Bio&#160;</td>
			<td>99-0042</td>
			<td>Protein A Biosensor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Protein A Dip and Read Biosensors</td>
			<td>Pall Fort&#233;Bio&#160;</td>
			<td>18-5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polypropylene 96-well Microplate, F-bottom, Chimney-style, Black</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655209</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of high-throughput automated microbioreactor system for production of model igg1 in cho cells

自動マイクロ バイオリアクター (15 mL) は、細胞培養技術者のための便利なツールをすることができます。彼らは、潜在的なプロセスの変動を最小限に抑えながら、さまざまな実験条件の同時実行を促進します。このアプローチのアプリケーションが含まれます: 選考、温度や pH の変化、メディア、補足の最適化のクローンを作成します。さらに、小型原子炉ボリュームが条件の広い範囲を調査実験の大きなデザインを助長します。これにより大幅にスケール アップする前に最適化する上流工程、時間と経済的な制約のせいで実験がより限られています。自動マイクロ バイオリアクター システムは従来の小規模で様々 な利点にシェイク フラスコやスピナー フラスコなどの携帯文化単位を提供します。ただし、パイロット スケールの中にプロセス開発重要な注意が必要これらの利点を実現することを確認します。ケアで実行された場合、システム高レベルの自動化を有効にすることができます、変数のより高い数と DOE を実行するようにプログラムできます、サンプリング時間を減らすことができます栄養アナライザーまたは細胞カウンターと統合します。現在自動マイクロ スケール バイオリアクター実験で紹介の専門家から派生したヒューリスティックの統合は、意味のある結果を妨げる共通の落とし穴を最小化できます。極端にここでのレイアウトの原則に従わない場合は高価な修理を必要とする機器の損傷につながることができます。さらに、microbioreactor システムは、培養条件の評価を困難にする小さい文化ボリュームを持ちます。数とバッチ モード文化のプロセスのサンプルの量は、限られた運用ボリュームが 10 mL 以下に落ちることはできません。このメソッドは利点とマイクロ バイオリアクター システムの欠点を説明します。

重要なプロセス パラメーターと細胞培養の操作を通して他の携帯文化のパラメーターを監視する条件で重要な側面です。細胞カウンターと栄養のアナライザーは、細胞の成長、栄養の消費と副産物の形成を特徴付ける属性を 5 つを定量化する使用されました。細胞数は、培養条件を毎日得られました。平均実行可能なセル密度と目が、± 1 SD 間隔と共に図 3に見られるようにです。栄養物および副産物のプロファイルも文化の固定相を ± 1 SD の間隔で示されます。このプロファイルの斜面は、平均ブドウ糖とグルタミンの消費量と乳酸生産率を表します。全体的にみて、これらの結果は、microbioreactor システムのこれらの属性を監視の可能性を実証します。タイトな範囲内でこれらのパラメーターを維持する microbioreactor システムの機能だけでなく、
細胞培養の総合的な生産性収穫の細胞培養媒体は 0.22 ミクロン PVDF フィルターを通して渡された後、proteinA バイオ センサー システムを用いて定量化。0.87 pg/ニ 〜 1.15 pg/セル-d図 4に見られるようにセルごとの特定の生産性。基づくこれらの結果、メディア構成を選択する条件の広い配列を調べることができます、実験手順の最小限の投資の生産供給の蛋白質の量を最大化する戦略。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58231/58231fig1.jpg"> 図 1:4 文化局 (CS) 各 12 の原子炉容器を持つ microbioreactor システムのレイアウト。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58231/58231fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58231/58231fig2.jpg"> 図 2:ProteinA バイオ センサー システムの再生実験と基本的な定量分析の例サンプル プレート設定します。参照サンプル (検体欠席、すなわち行列); 行 1 (赤"R") を予約します。基準 (濃度が μ g/mL) のセットは、行 2 (アクアマリン)行 3 と 4 (オレンジ)、低、高のポジティブ コントロールのセット ("の PL"と"PH"それぞれ);行 5 ~ 10 (紫) を含む不明なサンプルです。行 11 および 12 (グレー) は、("R") の再生と ("N") の中和バッファー プログラム デフォルトの位置です。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58231/58231fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58231/58231fig3.jpg"> 図 3:は) 歳以上バッチの実行可能な細胞の密度と生存率のプロファイルの平均します。± 1 SD も、microbioreactor 系における細胞増殖のタイトなコントロールを示すに表示されます。ブドウ糖とグルタミンと乳酸の平均副産物プロファイル b) 平均栄養プロファイル。± 1 SD も、microbioreactor システムのメディア組成を厳密に制御を示すに表示されます。(N = 3、すべて条件実行された 3 通)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58231/58231fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58231/58231fig4.jpg"> 図 4:種々 のメディア条件の平均特定の生産性の代表的なボックス プロットします。(N = 3、すべて条件実行された 3 通)<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58231/58231fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

高スループットの自動モデル IgG1 CHO 細胞での生産のための Microbioreactor システム

Microbioreactor システムの様々 な条件下での 48 の並列細胞培養の同時操作の詳細なプロトコルが表示されます。細胞培養プロセス、収穫、その後抗体価分析を説明します。

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

この方法は、細胞ラインの特性評価および仲介およびプロセス最適化の側面に関するバイオプロセス製造の分野における重要な質問のいくつかに答える助けとなる。この技術の利点は、揺れフラスコの制御を強化し、迅速なデータ生成のための多数の小規模研究の自動化とパフォーマンスを可能にすることです。この手順を実証する,サイ・ラシュミカ・ヴェリューグラとケイシー・コーンホルスト,私の研究室の研究員。37°Cの水浴で凍結培地のミリリットル当たり3倍の10倍の在庫vileを浸すことから始めます。氷の小さな断片だけが残っているとき、急速に解凍した細胞懸濁液を数回穏やかにピペットし、29ミリリットルのOptiCHO培地を含む無菌125ミリリットルのベントシェイクフラスコに1ミリリットルの細胞を移す。フラスコを細胞培養インキュベーターに摂氏37度、8%CO2に入れ、130RPMで振ります。125ミリリットルのスピナーフラスコで新鮮な37度の培地の100ミリリットルで72ミリリットル後に細胞を下塗りし、摂氏37度でさらに72時間、70 RPMで攪拌して8%CO2を培養する。サブカルチャーの3日目に、新鮮な事前温め培地をスピナーフラスコに加えて、細胞を少なくとも90%の生存率で維持し、最後の24時間培養を行う。翌朝、リモートデスクトップアイコンをクリックし、[接続]をクリックします。リモートデスクトップが接続されたら、セルカウンタソフトウェアを開き、新しい試薬Pakをインストールします。その後、トリパンブルー廃棄物を空にし、システムをプライミングします。次に、リモート接続を最小限に抑え、既存の実験をテンプレートとして使用してマイクロバイオリアクターソフトウェアを開き、新しい実験を作成します。実行を開始する前に、ソフトウェアの模倣セクションで実行中に使用されるプレートを定義し、各培養ステーションに12の無菌培養容器を配置します。容器の上にオートクレーブクランププレートを置き、各ピンがしっかりと挿入されていることを確認するためにクランププレートの上に攪拌プレートを置きます。次に、クランププレートをネジとノブで固定します。システムを起動するには、各培養容器に備えたバーコードをスキャンします。システムは、適切な容器の存在を初期化し、チェックします。温度制御を摂氏37度に設定し、撹拌を1,000RPMに設定し、溶存酸素PHモニタをオンにします。次に、中程度の充電プログラムを実行します。すべての培地がロードされると、35マイクロリットルのEX-CELL消泡体が消泡プレートから培養容器に添加されます。30分後に、培養培地内で溶存酸素とPHを記録し始め、溶存酸素が50%の設定点に達することを可能にし、すべての培養容器に対して7.1のPHセットポイントを達成するために背景ベースの添加をオンにする。翌朝、一時停止したPHステップを実行し、スピナーフラスコの内容物全体を無菌250ミリリットルの円錐管に移して遠心分離します。培養容器に接種液を加えた後、最終密度がミリリットル当たり6番目のCHO細胞に10倍となるほど新鮮な培地でペレットを再懸濁し、浮遊細胞を滅菌蓋付き24ウェルプレートの適切なウェルに加える。各井戸に3ミリリットルの接種を加え、フード内の指定された机の上に接種プレートを置きます。次に、培養容器を少なくとも1時間平衡化させ、プログラム内の5つのEX-CELLカウントステップを開始します。2日目の毎日の栄養素と代謝産物の分析のために、サンプルチューブホルダープレートを指定されたデッキに置き、開いたマイクロ遠心チューブを適切なホルダーにロードします。次いで、検体を分析トレイに入れ、栄養分析を行う。ランを終了するには、まず温度制御をオフにし、その後に攪拌を行います。溶存酸素PHコントロールとバックグラウンドベースの追加、その他すべてのコントロール、およびシステムモニタを停止します。クランプを緩めてプレートをかき混ぜ、培養容器を取り外し、乾燥プレートを培養ステーションにねじ込みます。次に、プログラム上で2時間の乾燥サイクルを実行し、乾燥サイクルが終了したらバイオリアクターソフトウェアで停止をクリックします。細胞を収穫するために、細胞培養液を原子炉容器から遠心分離のための対応する円錐形の管に移し、無菌0.22マイクロメートルPVDHフィルターを介して上清をろ過する。次いで、各滅菌細胞培養上清の1ミリリットルを、価価分析までマイナス20°Cの貯蔵用の個々の1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に移す。サンプルのIgGの上昇を測定するには、まずタンパク質補助バイオセンサーシステムをオンにします。ランプが少なくとも1時間温まった後、サンプルを室温まで平衡化し、サンプルごとに1つのタンパク質補助チップを少なくとも30分間新鮮な細胞媒体にプレソースします。その後、プレート温度を摂氏26度に設定します。サンプルをシステムにロードし、データ取得ソフトウェアで再生成されたデフォルトの高感度アッセイを使用してアッセイを実行します。統合細胞カウンターを使用して、平均生存細胞密度および生存率は、すべての培養条件について毎日得ることができる。栄養分析装置を用いて、マイクロバイオリアクターシステムにおけるこれらの属性のモニタリングの実現可能性を示す栄養素および副産物プロファイルを得ることもできます。また、目的とする種々の培養条件下での細胞培養の総生産性は、実証したタンパク質補助バイオセンサシステムを用いて定量することができる。この手順を試みる際は、プログラミングが正しく行われた場合にのみプロトコルが機能し、最小限のエラーでプロトコルステップをタイムリーに実行することを忘れないでください。この手順に従って、液体クロマトグラフィー、質量分析、および多角光散乱は、製造された製品の物理的および化学的特性に関する追加の質問に答えるために実行することができます。

Research

JoVE Journal

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