Name: use of high-throughput automated microbioreactor system for production of model igg1 in cho cells
Uploaded: 2018-09-28T13:00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells at JoVE.com

Yazarlar Scott Lute verilen analitik destek için teşekkür etmek istiyorum. Kısmi iç finansman ve destek bu iş için sağlanan CDER kritik yolu Program tarafından (CA #1-13). Bu projenin kısmen bir randevu için staj/araştırma katılım programı Office biyoteknoloji ürünleri, ABD Gıda ve İlaç İdaresi, bilim ve eğitim yoluyla Oak Ridge Enstitüsü tarafından yönetilen tarafından desteklenen bir ABD Enerji Bakanlığı ve FDA arasında kurumlararası anlaşma.

<ol>
	<li>K&#246;hler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity.">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> Nature. 256, 495-497 (1975).</li><li>Buss, N. A., Henderson, S. J., McFarlane, M., Shenton, J. M., de Haan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibody+therapeutics:+history+and+future.">Monoclonal antibody therapeutics: history and future.</a> Current Opinion in Pharmacology. 12 (5), 615-622 (2012).</li><li>Jakobovits, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+fully+human+antibodies+by+transgenic+mice.">Production of fully human antibodies by transgenic mice.</a> Current Opinion in Biotechnology. 6 (5), 561-566 (1995).</li><li>Maksimenko, O. G., Deykin, A. V., Khodarovich, Y. M., Georgiev, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Transgenic+Animals+in+Biotechnology:+Prospects+and+Problems.">Use of Transgenic Animals in Biotechnology: Prospects and Problems.</a> Acta Naturae. 5 (1), 33-46 (2013).</li><li>Jayapal, K. P., Wlaschin, K. F., Hu, W., Yap, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+therapeutics+from+CHO+cells-20+years+and+counting.">Recombinant protein therapeutics from CHO cells-20 years and counting.</a> Chemical Engineering Progress. 103 (10), 40 (2007).</li><li>Velugula-Yellela, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+media+and+antifoam+selection+on+monoclonal+antibody+production+and+quality+using+a+high+throughput+micro-bioreactor+system.">Impact of media and antifoam selection on monoclonal antibody production and quality using a high throughput micro-bioreactor system.</a> Biotechnology Progress. , (2017).</li><li>Foltz, I. N., Karow, M., Wasserman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+Emergence+of+Therapeutic+Monoclonal+Antibodies.">Evolution and Emergence of Therapeutic Monoclonal Antibodies.</a> Circulation. 127 (22), 2222-2230 (2013).</li><li>Kondragunta, B., Drew, J. L., Brorson, K. A., Moreira, A. R., Rao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+clone+selection+using+high-throughput+bioreactors.">Advances in clone selection using high-throughput bioreactors.</a> Biotechnology Progress. 26 (4), 1095-1103 (2010).</li><li>Altamirano, C., Paredes, C., Cairo, J., Godia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+CHO+cell+culture+medium+formulation:+simultaneous+substitution+of+glucose+and+glutamine.">Improvement of CHO cell culture medium formulation: simultaneous substitution of glucose and glutamine.</a> Biotechnology Progress. 16 (1), 69-75 (2000).</li><li>Selvarasu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+in+silico+modeling+and+metabolomics+analysis+to+characterize+fed-batch+CHO+cell+culture.">Combined in silico modeling and metabolomics analysis to characterize fed-batch CHO cell culture.</a> Biotechnology and Bioengineering. 109 (6), 1415-1429 (2012).</li><li>Seth, G., Ozturk, S., Zhang, C., Hu, W. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell Culture Bioprocess Engineering. , 97-126 (2012).</li><li>McKeehan, W. M. K., Ham, R., Ham, R., Waymouth, C., Chapple, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Growth Requirements of Vertebrate Cells In vitro. , 223-243 (1981).</li><li>Jordan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+medium+improvement+by+rigorous+shuffling+of+components+using+media+blending.">Cell culture medium improvement by rigorous shuffling of components using media blending.</a> Cytotechnology. 65 (1), 31-40 (2013).</li><li>Castro, P. M. L., Hayter, P. M., Ison, A. P., Bull, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+statistical+design+to+the+optimization+of+culture+medium+for+recombinant+interferon-gamma+production+by+Chinese+hamster+ovary+cells.">Application of a statistical design to the optimization of culture medium for recombinant interferon-gamma production by Chinese hamster ovary cells.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 38 (1), 84-90 (1992).</li><li>Liu, C. -. H., Chu, I. M., Hwang, S. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factorial+designs+combined+with+the+steepest+ascent+method+to+optimize+serum-free+media+for+CHO+cells.">Factorial designs combined with the steepest ascent method to optimize serum-free media for CHO cells.</a> Enzyme and Microbial Technology. 28 (4-5), 314-321 (2001).</li><li>Parampalli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developement+of+serum-free+media+in+CHO-DG44+cells+using+a+central+composite+statistical+design.">Developement of serum-free media in CHO-DG44 cells using a central composite statistical design.</a> Cytotechnology. 54 (1), 57-68 (2007).</li><li>Hsu, W. -. T., Aulakh, R. P., Traul, D. L., Yuk, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+microscale+bioreactor+system:+a+representative+scale-down+model+for+bench-top+bioreactors.">Advanced microscale bioreactor system: a representative scale-down model for bench-top bioreactors.</a> Cytotechnology. 64 (6), 667-678 (2012).</li><li>Janakiraman, V., Kwiatkowski, C., Kshirsagar, R., Ryll, T., Huang, Y. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+high-throughput+mini-bioreactor+system+for+systematic+scale-down+modeling,+process+characterization,+and+control+strategy+development.">Application of high-throughput mini-bioreactor system for systematic scale-down modeling, process characterization, and control strategy development.</a> Biotechnology Progress. 31 (6), 1623-1632 (2015).</li><li>Kim, B. J., Diao, J., Shuler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mini-scale+bioprocessing+systems+for+highly+parallel+animal+cell+cultures.">Mini-scale bioprocessing systems for highly parallel animal cell cultures.</a> Biotechnology Progress. 28 (3), 595-607 (2012).</li><li>Legmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+predictive+high-throughput+scale-down+model+of+monoclonal+antibody+production+in+CHO+cells.">A predictive high-throughput scale-down model of monoclonal antibody production in CHO cells.</a> Biotechnology and Bioengineering. 104 (6), 1107-1120 (2009).</li><li>Sch&#228;pper, D., Alam, M. N. H. Z., Szita, N., Lantz, A. E., Gernaey, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+microbioreactors+in+fermentation+process+development:+a+review.">Application of microbioreactors in fermentation process development: a review.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 395 (3), 679-695 (2009).</li><li>Hegab, H. M., ElMekawy, A., Stakenborg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+microfluidic+microbioreactor+technology+for+high-throughput+submerged+microbiological+cultivation.">Review of microfluidic microbioreactor technology for high-throughput submerged microbiological cultivation.</a> Biomicrofluidics. 7 (2), 021502 (2013).</li><li>Rameez, S., Mostafa, S. S., Miller, C., Shukla, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+miniaturized+bioreactors+for+cell+culture+process+development:+Reproducibility,+scalability,+and+control.">High-throughput miniaturized bioreactors for cell culture process development: Reproducibility, scalability, and control.</a> Biotechnology Progress. 30 (3), 718-727 (2014).</li><li>Xu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+TAP+Ambr+250+disposable+bioreactors,+as+a+reliable+scale-down+model+for+biologics+process+development.">Characterization of TAP Ambr 250 disposable bioreactors, as a reliable scale-down model for biologics process development.</a> Biotechnology Progress. 33 (2), 478-489 (2017).</li><li>Delouvroy, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+advanced+micro-scale+bioreactor+(ambr&#8482;)+as+a+highthroughput+tool+for+cell+culture+process+development.">Evaluation of the advanced micro-scale bioreactor (ambr&#8482;) as a highthroughput tool for cell culture process development.</a> BMC Proceedings. 7 (6), 1-3 (2013).</li><li>Kelly, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+performance+of+semi-continuous+cell+culture+in+an+ambr15+microbioreactor+using+dynamic+flux+balance+modeling.">Optimizing performance of semi-continuous cell culture in an ambr15 microbioreactor using dynamic flux balance modeling.</a> Biotechnology Progress. , (2017).</li></ol>

Yasal Uyarı: Bu yayın yazarın görüşlerini yansıtan ve FDA'ın sayısı veya ilkeleri gösterecek yorumlanmamalıdır.

Otomatik mikro biyoreaktör sistemi düzgün çalışan ve verimli bir şekilde zamanında yürütülmesini birden çok otomatik adımları içerir. Sistem çalışan en önemli parçalarından biri yazılım programlama nedir. Program yazarken herhangi bir hata varsa orada-ecek var olmak ciddi hatalar denemede bu strateji, örnekleme strateji veya çalışma bulguları geçersiz kılabilir nihai ürün kalitesini besleme işleminin beklenmedik değişiklikler neden olabilir. Sistem çalışan bir başka önemli yönü yerleştirin ve kelepçe plaka doğru düzgün yapmak kontrolü sağlamak için sıkın etmektir. Kelepçe plaka düzensiz sıkılır en yaygın göstergesidir tekneler 1, 6, 7 ve 12 (köşe reaktör gemiler) için ölçümlerde oluşabilecek beklenmeyen değişiklikleri. Genel olarak istikrarsızlık contalar kelepçe tabak gaz giriş satırlarında, gevşeme gösterir. Bu senaryo ayar noktası ulaşan engelleyebilir. Bir deney başlangıç hücreleri izin veriyor önlemek için başka bir ortak hatadır aşı adım sırasında çok uzun süre onları çözmek neden, otur. Hücreleri oturma, harcama daha az zaman daha az şansı olduğunu giderek daha düşük inoculum hücre sayımları hangi önemli önyargı bu farkında olmadan tetikleyebilir reaktör gemiler kronolojik olarak eklenen çalışma sonuçları zarar verir. Birden çok aşamalı olarak aşılamak iyidir, yani aşılamak her kültür istasyonla birbiri ardına Duraklat adımları arasında hücreleri aşılama plaka 15 dakika daha uzun süre oturmuş değil bu yüzden.
Günlük kullanım, kısırlık Bakımı ile ilgili hayati önem taşımaktadır. Biyolojik Emanet kabine sistemi olmasına rağmen kısırlık başlık içinde ve dışında sık hareketi nedeniyle garanti edilmez. Sonuç olarak, mahallede her şeyi % 70 IPA ile püskürtülür gerekir. İkinci olarak, en az köpük kültür sırasında gerçekleşmesini sağlamak için önemlidir; Medya gazlama yapışmasına neden olabilir ve kelepçe plaka ve hatta çekirdek bileşenleri aşağıdaki zarar vermek için önde gelen satırları, egzoz. Koruyucu anti-köpük ek herhangi bir mikro biyoreaktör program tasarımında önemli adımlardır. Bir "köpük" durumunda bu protokolü temizlik üreticileri takip etmek faydalı olacağını ve kelepçe plakaların kalıcı hasar engel olabilir. Alternatif olarak, hacim oranı daha yüksek yüzeye düz bir sparger eksikliği ile verimli oksijen sağlar gibi toplu modunda çalışırken sigara sparged damarları kullanımı veya daha düşük cep yoğunlukları için yararlı olabilir. Baş alan oksijen tüketimi artan kültürler ile yetişmek yetersiz olarak ancak, Sigara sparged gemiler yüksek hücre yoğunluğu veya perfüzyon kültürleri için yararlı olabilir.
Şişeler sallamak daha fazla kontrol ile küçük bir ölçekte paralel olarak çalıştırılacak birden çok kontrollü kültürü kullanmasına olanak tanır microbioreactor sistem tarafından sağlanan çok sayıda avantajı vardır. 17 bu nedenle, tarama çalışmaları, mu, yüksek işlem hacmi klon çalışmaları ve transfection çalışmalar yürütme sistemi kolaylaştırır. Otomatik sıvı işleme da aynı anda sıkıcı ve zaman yoğun emek için eğitimli personel en aza indirerek analisti analisti değişkenliği azaltır. Sisteme çeşitli yararları olmakla birlikte, düşünülmesi gereken birkaç önemli dezavantajları vardır. İlk olarak, 15 mL kültür hacmi önemli ölçüde işlem dışı örnekleme ve son hasat malzeme ve birden fazla alternatif küçük ölçekli Biyoreaktörler sınırlar (ilâ 500 mL) son zamanlarda kullanılabilir hale gelmiştir. Bir son gelişme sisteme otomatik microscale biyoreaktör Nova biyomedikal, hücre yoğunluğu ve besin analiz için numune hacmi azaltarak içinde işlem örnekleme sorunu azaltır BioProfile FLEX 2 Çözümleyicisi ile bütünleşmesidir . Satınalma birimleri yeniden kullanılabilir geleneksel sistemleri daha costlier olabilir gibi tek kullanımlık birim maliyetini uzun vadeli projeler için düşünülmesi gereken ancak faydaları hızlı kurulum ve operasyonel tasarruf için hemen hemen hiçbir temizlik önde gelen dahil edebilirsiniz.
Bu yazıda ele yöntemi öncelikle toplu iş modu hücre kültürü için uygundur, ancak kullanıcı gereksinimlerine bağlı olarak değiştirilebilir. Her kültür İstasyonu, sıcaklık, bağımsız denetim sahipken ve pH bireysel reaktör gemiler düzeyinde çeşitlendirilebilir. Sartorius özellikle deneyler izin vermek için tasarlanmış yazılım planlama DoE olabilir uyarlanmış için mikro biyoreaktör sistemi sunuyor. Büyük ölçekli DoE çalışmalar yeni DoE yazılım üreticisi tarafından sağlanan kullanarak medya yardım ve en iyi duruma getirme ek. Burada kullanılmaz, ancak microbioreactor sistem beslenen-toplu çalışmalar da sağlar. Sistem henüz perfüzyon hücre kültürleri için optimize edilmiş değil. Ancak, sınırlı çalışmaları ve perfüzyon hücre kültür işlemi geçerli mikro biyoreaktör sistemini taklit etmek için denemeler olmuştur. 26 yüksek yoğunluklu perfüzyon kültürler yerleşme hücre tarafından taklit etmek için bu yöntemi değiştirilebilir. Hangi reaktöre damlalıklı eklenir yükseklik değişen ve halledilmesi zaman en iyi duruma getirme, medya kaldırıldı ve kültür ayna bolluk moduna doldurulan. Perfüzyon modu kültürünün isteniyorsa burada sunulan sistem daha iyi çalışabilir bu gelişmekte olan alanda yeni ürün bulunmaktadır.
Özet olarak, bu çalışmada üretmek ve bir modeli Igg1 monoklonal antikor karakterize CHO hücre kültür işlemleri için analitik ilgili ve otomatik mikro-Biyoreaktörler kullanımını gösterir. Bu rol küçük ölçekli mikro-Biyoreaktörler Biyoproses imalat ve hücre kültür gelişimi ve medya tarama üzerindeki etkilerini vurgulamaktadır. Bir otomatik küçük ölçekli sistem kullanarak pek çok avantajı olmakla birlikte, tam olarak gerçekleştirmek için kendi yararları anlama süreci ve analitik karakterizasyonu zorunludur. Bu çalışmada geliştirilen ve bireysel araştırma ihtiyaçlarını gelişmiş bir otomatik microscale reaktör sistemiyle için bir kılavuz ile kullanıcıya sunar.

Monoklonal antikor (mAbs) ilk 19751fare Hibridoma hücrelerde üretildi. O zamandan beri Rekombinant protein üretim geliştirme bir artış artış vivo içinde güvenliği ve etkinliği2,3,4mAbs insancıllaştırmaya yerini almıştır. Rekombinant protein üretim süreçleri çoğu Çin Hamster Over (CHO) hücreleri ile hangi onlar serum boş ortam, doğuştan gelen bir insan için benzer translasyonel modifikasyonlar ile proteinleri üretmek için yeteneklerini için adapte edilebilir kolaylaştırmak için istihdam protein ve onların güvenilirlik ana hücreleri5,6.
Daha hızlı ve tutarlı kalitesi ile daha büyük hasta nüfus için ürün sunmak için artan talebi. Ekonomik faydaları yanı sıra, mAbs tarafından tedavi hastalıkları repertuar, artan şimdi otoimmün hastalıklar, transplantasyon sonrası komplikasyonlar, artrit ve kanser7içerir. Modern ticari mAb üretim hatları için Ortalama verimleri genellikle 5-6 g/L aralığında olan ve5yükselmeye devam ediyor. Kısmen, bu CHO hücre mühendislik ve yüksek üretilen iş Biyoreaktörler8kullanılarak geliştirilmiş üretim hattı tarama tamamlandıktan. Ancak, çoğu protein üretim artış medya optimizasyon, hücre kültür koşulları, gelişmeler de dahil olmak üzere ve stratejileri7,9,10besleme gelişmiş geliştirmeleri, işlemek için isnat. Besin takviyesi sadece uygun hücre büyüme yüksek kaliteli protein verimli üretim için de gereklidir. Ayrıca, hücreleri strateji en iyi duruma getirme6,11beslenmesi için ek anlayış gerektiren belirli besin stokiometrik eklenmesi gerektirir. Geleneksel en iyi duruma getirme yöntemleri tek tek ortam bileşeni titrasyon ve medya karışımı tasarımları ile karıştırma içerir. Ancak, bu yöntemler zaman alıcı, emek yoğun olarak kullanan ve insan hatası12,13ile ilgili riskler içerir.
Medya optimizasyon çalışmaları daha önce sallamak şişeler ve hammadde ve insan sermayesi açısından çok pahalı olabilir 1-2 L Biyoreaktörler dayanıyordu. Mikroplaka da kullanılmıştır ama bu yöntemleri sınırlı ölçeklenebilirlik sağlar. Ayrıca, bu hala neden medya kompozisyon ve beslenme stratejisi14,15,16CQA değişkenlik gizlemektedir toplu iş toplu iş değişkenlik tanıtmak birden çok zaman alıcı çalıştırma gerektirebilir. Böylece, gerek yüksek üretilen iş ve son derece tutarlı paralel biyoreaktör sistemleri ortaya çıktı için17,18,19,20.
Geleneksel tezgah ölçekli Biyoreaktörler çalışması ile ilgili önemli masraf ile (0,5-5 M), microbioreactors uyuşturucu türetilmiş üretimi biyolojik olarak değerlendirilmesi için bir maliyet azaltma alternatif sunuyoruz. 21 tezgah ölçekli karıştırılır-tank Biyoreaktörler güvenilir ve duyusal dizileri ile yoğun veri sağlar. Geribildirim kontrol sistemleri kolay işlem gözetimi için izin verir. Ancak, derleme, kalibrasyon, temizlik, işçilik maliyetleri, substrat maliyeti ve sterilizasyon gereksinimleri tezgah ölçekli karıştırılır-tank Biyoreaktörler pahalı ve emek yoğun çalışmasına olun. Shake şişeler ve microtiter plakaları maliyeti azaltın ve daha büyük ölçekli Biyoreaktörler ile ilgili sorunları emek ama bu alternatifleri işleme koşulları zayıf denetim sağlayan ve düşük yoğunluklu veri, genellikle sadece noktalardan ölçümleri üretmek. 22
Alternatif olarak, microbioreactors hücre kültürünü ve ters yönde süreç geliştirme için bir ölçek aşağı yaklaşım sağlamak için küçük bir çalışma birimi kullanmak. Microbioreactor deneyler ölçeğini daha düşük güç, substrat, işçilik, uzay ve yardımcı programları kullanımı ile maliyet hesaplamasını önemli ölçüde düşürebilir. 23 sallamak şişeler onlar onların büyüklüğü nedeniyle kolay, ama onlar geleneksel tezgah ölçekli Biyoreaktörler pH, sıcaklık, onların online geribildirim kontrol avantajları korumak o çözünmüş oksijen ve asit/baz gibi Microbioreactors vardır tüketimi hem de kalite parametrelerini gaz bileşimi gibi onların gerçek zamanlı veri çıkışını. Microbioreactor ölçek klon seçimi ve süreç gelişimi için yararlı olabilir yüksek üretilen iş tarama yeteneği sağlar. 24
Gelişmiş Microscale biyoreaktör CHO hücre kültür işlem karakterizasyonu ve geliştirme18için etkili bir araç olarak gösterilmiştir. Burada, bir otomatik ambr15 sistemi, klasik için karşılaştırılabilir olduğu gösterilmiştir 48 microbioreactors paralel, oluşan tank reaktörler ölçeğinde çalışmalar kadar karıştırılır,25 medya en iyi duruma getirilmiş ön çalışma için benzer bir şekilde kullanılmıştır kompozisyon bir modeli chimeric Igg16üreten bir CHO-DG44 hücre satırı için. Büyüme ve titresi değişen medya şartlar etkileri karşılaştırıldığında ve analiz. Bu yazıda microbioreactor sistemi ve analiz ham medya örnekleri çalıştırmak için genel bir kılavuz sunmuştur.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:899px;" width="898">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:373px;">CHO DG44 Cell Line</td>
			<td style="width:191px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:157px;">A1100001</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ambr 15 automated microbioreactor system</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>001-2804</td>
			<td>automated micro bioreactor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ambr 15 Cell Culture 24 Disposable Bioreactors - Sparged</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>001-2B80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 mL disposable pipette tips, sterilized</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>A-0040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5 mL disposable pipette tips, sterilized</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>A-0039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">24 Well deep well plates</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>A-0038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 Well plates</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>A-0068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vi-Cell XR cell counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>731050</td>
			<td>automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EX-CELL&#160;Antifoam (gamma irradiated)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59920C-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CD OptiCHO AGT Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1122205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">200 mM L-glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-005-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">100X Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-001-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">125 mL F-Bottom Shake Flasks (Sterile, Vented)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PBV12-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">125 mL glass Spinner Flasks</td>
			<td>Corning Life Sciences Glass</td>
			<td>4500-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">250 mL PP Conical Centrifuge Tubes (Sterile)</td>
			<td>Nalgene (Thermo Scientific)</td>
			<td>376814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TC20 Automated Cell Counter</td>
			<td>BioRad Laboratories, Inc.</td>
			<td>1450103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypan Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10x PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BioProfile FLEX Analyzer</td>
			<td>Nova Biomedical</td>
			<td>49418</td>
			<td>Nutrient Analyzer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Octet Red 96</td>
			<td>Pall Fort&#233;Bio&#160;</td>
			<td>99-0042</td>
			<td>Protein A Biosensor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Protein A Dip and Read Biosensors</td>
			<td>Pall Fort&#233;Bio&#160;</td>
			<td>18-5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polypropylene 96-well Microplate, F-bottom, Chimney-style, Black</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655209</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of high-throughput automated microbioreactor system for production of model igg1 in cho cells

Otomatik microscale Biyoreaktörler (15 mL) hücre kültür mühendisleri için yararlı bir araç olabilir. Onlar potansiyel işlem değişkenlik en aza indirirken çok çeşitli deneysel koşullar eşzamanlı yürütülmesi kolaylaştırmak. Bu yaklaşımın uygulamaları: clone tarama, sıcaklık ve pH vardiya, medya ve ek en iyi duruma getirme. Ayrıca, küçük reaktör birimleri büyük tasarım, çok çeşitli koşulları araştırmak deneyleri için elverişli. Böylece ters yönde süreçleri önemli ölçüde ölçek-up önce optimize nerede deneme daha kapsam zaman ve ekonomik kısıtlamaları nedeniyle sınırlıdır. Otomatik microscale biyoreaktör sistemleri sallamak şişeler veya spinner şişeler gibi hücre kültür birimleri geleneksel küçük ölçekli çeşitli avantajlar sunuyor. Ancak, sırasında pilot ölçek süreç geliştirme önemli bu avantajları gerçekleştirilmektedir sağlamak için özen göstermelidir. Bakım ile çalıştırdığınızda, sistem yüksek düzey Otomasyon etkinleştirebilirsiniz, DOE'nun değişkenleri daha yüksek bir sayı ile çalıştırmak için programlanmış ve örnekleme zamanı azaltabilirsiniz bir besin Analyzer'ı veya hücre sayaç ile entegre. Burada, geçerli otomatik microscale biyoreaktör deneyler ile sunulan uzman kaynaklı heuristics entegrasyonunu anlamlı sonuçlar engel ortak tuzaklar en aza indirebilirsiniz. Aşırı, aksi takdirde burada ortaya konulan ilkelerine uygun pahalı onarım gerektiren ekipman hasar neden olabilir. Ayrıca, microbioreactor sistemleri karakterizasyonu hücre kültür koşulların zorlaştıran küçük kültür birimleri var. Alınan örnekler işlem içi toplu iş modu kültür miktarı ve numarası işletim birimleri 10 mL dalamıyorum gibi sınırlıdır. Bu yöntemin avantajları ve dezavantajları microscale biyoreaktör sistemleri ele alınacak.

Kritik süreç parametreleri ve diğer hücre kültür parametreleri hücre kültürleri işlemi boyunca izleme bioprocessing içinde önemli bir yönüdür. Hücre sayaç ve besin analyzer hücre büyümesi, besin tüketimi ve yan ürün oluşumu karakterize beş öznitelikleri ölçmek için kullanılmıştır. Hücre sayısı her gün için tüm kültür koşulları elde edilmiştir. Ortalama canlı hücre yoğunluğu ve viabilities onların ±1 SD aralığı ile birlikte Şekil 3 ' te görüldüğü gibi vardır. Besin ve yan ürünü profilleri de ±1 SD aralığı kültürlerin sabit faz üzerinden ile gösterilir. Bu profil eğimi ortalama glikoz ve glutamin tüketim ve laktat üretim oranları temsil eder. Genel olarak, bu sonuçlar bu öznitelikleri microbioreactor sistemi izleme fizibilite göstermek; Bu parametreler dar bir Aralık içinde korumak yeteneği microbioreactor sisteminin yanı sıra.
Hücre kültürleri toplam verimlilik hasat hücre kültür medya 0,22 mikronluk PVDF filtreden geçtikten sonra proteinA biyoalgılayıcı sistemini kullanarak sayısal. 1.15 pg/hücre- Şekil 4' te görüldüğü gibi d 0,87 pg/hücre-d değişmekteydi hücre başına belirli verimlilik. Bu sonuçlara koşulları geniş bir dizi medya kompozisyon seçmek için soruşturma olması ve deneysel prosedürler minimal bir yatırım için üretilen protein miktarı en üst düzeye çıkarmak stratejileri besleme.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58231/58231fig1.jpg"> Resim 1 : Microbioreactor sistemi ile 12 reaktör gemiler sahip 4 kültür istasyonları (CS) yerleşimini. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58231/58231fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58231/58231fig2.jpg"> Resim 2 : Örnek örnek plaka koymak-yukarıya rejenerasyon deney proteinA biyoalgılayıcı sistemi ile temel bir Nefelometri için. satır 1 (kırmızı "R") örneği (yani matris analit yok); için ayrılmıştır satır 2 (aquamarine) (konsantrasyonları µg/mL) standartları kümesidir; satır 3 ve 4 (turuncu) düşük ve yüksek pozitif denetimleri kümesi vardır ("PL" ve "PH" sırasıyla); satır 5 ile 10 (mor) bilinmeyen örnekleri içeriyor; satırlar 11 ve 12 (gri) rejenerasyon ("R") ve nötralizasyon ("N") arabellekleri programı varsayılan konumları edilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58231/58231fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58231/58231fig3.jpg"> Şekil 3 : bir) bir toplu iş yaş üzerinde ortalama canlı hücre yoğunluğu ve canlılığı profilleri. ± 1 SD de hücre büyümesini sıkı kontrolü microbioreactor sistemlerinde belirtmek için gösterilir. b) glikoz ve glutamin aynı zamanda ortalama yan ürünü profil için laktat ortalama besin profili. ± 1 SD de medya kompozisyon üzerinde sıkı kontrol microbioreactor sistemlerinde belirtmek için gösterilir. (N = 3, tüm koşulları nüsha çalıştırılan). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58231/58231fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58231/58231fig4.jpg"> Şekil 4 : Çeşitli medya koşullardan ortalama belirli verimlilik temsilcisi kutu arsa. (N = 3, tüm koşulları nüsha çalıştırılan) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58231/58231fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells at JoVE.com

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Yüksek üretilen iş kullanımı otomatik Microbioreactor sistemi modeli Igg1 CHO hücrelerdeki imalatı için

Detaylı bir protokol 48 paralel hücre kültürlerinde bir microbioreactor sisteminde çeşitli koşullar altında eşzamanlı işlem için sunulmaktadır. Hücre kültür süreci, hasat ve sonraki antikor titresi analiz anlatılmıştır.

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Bu yöntem, hücre hattı karakterizasyonu ve arabuluculuk ve süreç optimizasyonu yönleri ile ilgili Bio proses üretim alanında bazı önemli soruların cevaplanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin avantajları, sallama şişelerinde daha fazla kontrol sağlaması ve hızlı veri üretimi için çok sayıda küçük ölçekli çalışmanın otomasyona ve performansa olanak sağlamasıdır. Prosedürü gösteren, Sai Rashmika Velugula ve Casey Kohnhorst, benim laboratuvarda araştırma görevlisi olacak.37 derece santigrat su banyosunda dondurucu ortamın mililitre başına 7.gösteri hücrelerine üç kez 10'luk bir hisse senedi pisliği batırarak başlayın. Sadece küçük bir buz parçası kaldığında, hızla çözülmüş hücre süspansiyonuna birkaç kez boru tonu ekleyin ve bir mililitre hücreyi 29 mililitre OptiCHO ortamı içeren steril 125 mililitrelik havalandırmalı sallama şişesine aktarın. Şişeyi 37 santigrat derece ve %8 CO2'de bir hücre kültürü kuluçka makinesine yerleştirin ve 130 RPM sallayarak.100 mililitre taze 37 santigrat derecede 72 saat sonra hücreleri subculturing bir 125 mililitre spinner şişesi başka bir 72 saat kuluçka için 37 derece santigrat ve 8% CO2 70 RPM de karıştırma ile. Alt kültürün üçüncü gününde, son 24 saatlik kültür için hücreleri en az %90 canlılıkta tutmak için spinner şişesine önceden ısıtılmış taze ortam ekleyin. Ertesi sabah, uzak masaüstü simgesine tıklayın ve bağlan'ı tıklatın.Uzak masaüstü bağlı olduğunda, hücre sayacı yazılımını açın ve yeni bir Reagent Pak yükleyin. Sonra, Trypan Mavi atık boş ve sistem asal. Ardından, uzak bağlantıyı en aza indirin ve yeni bir deneme oluşturmak için mevcut bir denemeyi şablon olarak kullanarak mikro biyo reaktör yazılımını açın.Koşmaya başlamadan önce, yazılımın taklit bölümünde çalışma sırasında kullanılan plakaları tanımlayın ve her kültür istasyonuna 12 steril kültür gemisi yerleştirin. Otoklavlı kelepçe plakalarını damarların üzerine yerleştirin ve karıştırma plakalarını her bir pimin güvenli bir şekilde takılı olduğundan emin olmak için kelepçe plakalarının üzerine yerleştirin. Daha sonra, kelepçe plakalarını verilen vida ve nob'larla sabitlayın.Sistemi başlatmak için her kültür gemisi ile sağlanan barkod taz. Sistem, uygun gemilerin varlığını niçin önleyecek ve kontrol edecektir. Sıcaklık kontrolünü 37 dereceye, karıştırmayı da 1.000 RPM'ye ayarlayın ve çözünmüş oksijen PH monitörünü açın.Ardından, orta şarj programını çalıştırın. Tüm ortam yüklendiğinde, Antiköpük plakadan kültür damarlarına 35 mikrolitre EX-CELL Antifoam eklenecektir. 30 dakika sonra çözünmüş oksijen ve PH kültür medya içinde kayıt başlar, çözünmüş oksijen% 50 bir setpoint ulaşmak için izin çözünmüş oksijen dengesonra, tüm kültür damarları için 7.1 ph setpoint ulaşmak için arka plan baz eklemeler açın.Ertesi sabah, duraklatılmış PH adımını uygulayın ve spinner şişesinin tüm içeriğini santrifüj için steril 250 mililitrelik konik tüpe aktarın. Son yoğunluğu kültür damarlarına inokül ekledikten sonra mililitre başına altıncı CHO hücreleri bir kez 10 olacak yeterli taze ortamda pelet resuspend ve steril kapaklı uygun kuyulara askıya hücreleri ekleyin 24 iyi plaka. Her kuyuya üç mililitre inokül ekleyin ve kaputun içindeki belirlenen masaya inokül plakasını yerleştirin.Daha sonra, kültür damarları en az bir saat boyunca denge ve programda beş EX-CELL sayısı adımı başlatın. Günlük besin ve metabolit analizi için ikinci gün örnek tüp tutucu plakaları belirlenen güvertelere yerleştirin ve açık mikrosantrifüj tüplerini uygun tutuculara yükleyin. Daha sonra, besin analizigerçekleştirmek için, analiz tepsisine örnekleri yerleştirin.Çalıştırmayı sonlandırmak için ilk olarak sıcaklık kontrolünü kapatın ve ardından ajitasyon. Çözünmüş oksijen PH kontrolünü ve arka plan taban eklemelerini, diğer tüm kontrolleri ve sistem monitörünü durdurun. Kelepçeyi sökün ve plakaları karıştırın, kültür kaplarını çıkarın ve kurutma plakalarını kültür istasyonuna vidalayın.Daha sonra, program üzerinde iki saatlik kurutma döngüsünü yürütmek;kurutma döngüsü bittikten sonra biyoreaktör yazılımında dur'a tıklayarak. Hücreleri hasat etmek için hücre kültürü sıvısını reaktör damarlarından santrifüj için ilgili konik tüplere aktarır ve süpernatantları steril 0,22 mikrometre PVDH filtreleri ile filtreler. Daha sonra, her steril hücre kültürünün bir mililitresini titre analizine kadar negatif 20 santigrat depolama için 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplere aktarın.Örneklerin IgG titrelerini ölçmek için önce protein yardımı biyosensör sistemini açın. Lamba en az bir saat ısındıktan sonra, numunelerin oda sıcaklığına kadar dengede durmasını ve taze hücreli ortamda numune başına en az 30 dakika protein yardımı ucunu önceden emmesine izin verin. Daha sonra plaka sıcaklığını 26 dereceye ayarlayın.Örnekleri sisteme yükleyin ve veri toplama yazılımında rejenerasyon la varsayılan yüksek duyarlılık testini kullanarak tayı çalıştırın. Entegre hücre sayacı kullanılarak, tüm kültür koşulları için her gün ortalama canlı hücre yoğunlukları ve uygunlukları elde edilebilir. Besin analizörünü kullanarak mikrobiyo reaktör sisteminde bu özellikleriizlemenin fizibilitesini gösteren besin ve yan ürün profillerini de elde edebiliriz.Ayrıca, ilgi çeşitli kültür koşulları altında hücre kültürlerinin toplam verimlilik gösterildiği gibi protein yardımı biyosensör sistemi kullanılarak ölçülebilir. Bu yordamı denerken, protokolün yalnızca programlama doğru yapılırsa çalıştığını unutmamak önemlidir;protokol adımlarının en az hatayla zamanında yürütülmesini sağlamak gerekir. Bu prosedürün ardından üretilen ürünün fiziksel ve kimyasal özellikleri ile ilgili ek soruları cevaplamak için sıvı kromatografisi, kütle spektrometresi ve çok açılı ışık saçılımı gibi diğer yöntemler de yapılabilir.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

Biyomalzemelerin Yüksek Verimli Discovery için Polimer Mikroarray&#39;ler

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Tek kullanımlık Pnömatik Biyoreaktör Sistemi kullanılarak memeli hücrelerinde yetiştirme

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Yüksek verimli bir kullanımı<em&gt; İn Vitro</em&gt; Mikroakışkan Sistemi Ağız Çok türler biyofilm Geliştirmek İçin

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

3D Doku mühendisliği İnsan Özofagus Mukozal Modeli Üretimi, Karakterizasyonu ve Potansiyel Kullanımları

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Tomoauto kullanma: Bir Protokol Yüksek verim Otomatik Cryo-elektron Tomografi için

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Otomatik Microbioreactor teknolojisini kullanarak Contegra Protein üretim duruma getirilmesi için genel iletişim kuralı

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Otomatik bir Mikrobioreactor sistemi kullanılarak Çin hamster yumurtlama hücrelerinden bir monoklonal antikor arıtma ve analitik

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation

Çin Hamster Yumurtalık Hücre Yetiştiriciliğinde Yüksek İş-İş BulaMetli Otomatik Mikro-Biyoreaktörler Kullanılarak Proses Optimizasyonu

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain ...

High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing

Damlacık Tabanlı RNA Sıralamaile Yüksek EldeLi Maya Zorlanma Fenotilik

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Yüksek Verimli Mikroakışkan Cihaz Kullanarak Dinamik ÇevreSel Koşulların Üretilmesi

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...