Name: generation of knock-out primary and expanded human nk cells using cas9 ribonucleoproteins
Uploaded: 2018-06-14T15:00:00
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Wir erkennen Brian Tullius für seine freundliche Hilfe bei der Bearbeitung der Handschrift.

Gesunden Spenders buffy Coats wurden als Quellenmaterial aus dem Central Ohio Region amerikanischen Roten Kreuz erhalten. Diese Forschung war entschlossen, ausgenommen Forschung werden durch die institutionelle Review Board der bundesweit Kinderkrankenhaus.
1. menschliche NK Zelle Reinigung und Ausbau
<ol><li>PBMCs von Buffy Coat12isolieren.<ol>
<li>35 mL buffy Coat Probe auf 15 mL Ficoll-Paque Schicht.</li>
		<li>Zentrifugieren bei 400 X g für 20 Minuten ohne Bremse...

<ol>
	<li>Guven, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+primary+human+natural+killer+cells+by+retroviral+transduction.">Efficient gene transfer into primary human natural killer cells by retroviral transduction.</a> Experimental Hematology. 33 (11), 1320-1328 (2005).</li><li>Alici, E., Sutlu, T., Sirac Dilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+gene+transfer+into+primary+human+natural+killer+cells.">Retroviral gene transfer into primary human natural killer cells.</a> Methods in Molecular Biology. 508, 127-137 (2009).</li><li>Carlsten, M., Childs, R. 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W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins.">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li><li>Chmielecki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+Profiling+of+a+Large+Set+of+Diverse+Pediatric+Cancers+Identifies+Known+and+Novel+Mutations+across+Tumor+Spectra.">Genomic Profiling of a Large Set of Diverse Pediatric Cancers Identifies Known and Novel Mutations across Tumor Spectra.</a> Cancer Research. 77 (2), 509-519 (2017).</li><li>Schultz, L. M., Majzner, R., Davis, K. L., Mackall, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+developments+in+immunotherapy+for+pediatric+solid+tumors.">New developments in immunotherapy for pediatric solid tumors.</a> Current Opinion in Pediatrics. 30 (1), 30-39 (2018).</li></ol>

DNA-abhängige Änderung der NK-Zellen hat4,9streitig gemacht. Wir, stellten daher direkt eine synthetisch vorgeformten Ribonucleoprotein (RNPs) Komplex und Cas9 Protein als gereinigtes Protein in Grund- und erweiterten NK Zellen8. Diese Methode erlaubte uns, Deckelung, zu beseitigen, Beschatten, und andere transkriptionelle und translationalen Prozesse gestartet durch RNA-Polymerase II, die NK Zelle Apoptose DNA-abhängige Signaltransdukt...

Krebs-Immuntherapie wurde in den letzten Jahren vorgebracht worden. Genetisch veränderte chimeric Antigen-Rezeptor (Auto)-T-Zellen sind ein hervorragendes Beispiel von veränderter Immunzellen erfolgreich in Krebsimmuntherapie eingesetzt. Diese Zellen wurden vor kurzem genehmigt durch die FDA für die Behandlung gegen CD19 + B-Zell-Tumoren, aber Erfolg ist bisher beschränkt sich auf Krankheiten, die mit ein paar Aktionsleisten Antigene und targeting so begrenzten Antigen Repertoire ist anfällig für Fehler durch immun Flucht. Darüber hinaus haben Auto-T-Zellen auf die Verwendung von autologen T-Zellen wegen der Gefahr der Graft - Versus - Host-Seuche verursacht durch allogenen T-Zellen konzentriert. Im Gegensatz dazu, NK-Zellen sind in der Lage, Tumor Zielen auf ein Antigen-unabhängige Weise zu töten und verursachen keine GvHD, wodurch sie einen guten Kandidat für Krebs Immuntherapie6,7,8,9.
CRISPR/Cas9 Technologie wurde vor kurzem in engineering Immunzellen verwendet, aber genetisch Umprogrammierung NK-Zellen mit Plasmiden seit jeher schwierig. Dies wurde aufgrund von Schwierigkeiten bei Transgen Lieferung in einer DNA-abhängigen Weise wie Lentivirale und retrovirale Transduktion verursacht erhebliche Verfahren verbundenen NK Zelle Apoptosis und der begrenzten Produktion gentechnisch NK-Zellen-4 , 9.
Viele angeborene immune Zellen express hohes Maß an Rezeptoren für Pathogen-assoziierte molekulare Muster wie Retinoic Säure-induzierbaren gen ich (RIG-ich), die es ermöglichen erhöhte Anerkennung von Fremd-DNA. Unterdrückung dieser Wege hat höhere Effizienz der Transduktion in NK-Zellen aktiviert, bei Verwendung von DNA-basierten Methoden für gentechnische Veränderung10.
Hier beschreiben wir die Methode für die Verwendung einer DNA-freie-Genom-Bearbeitung von primären und erweiterten menschlichen NK-Zellen unter Verwendung Cas9 Ribonucleoprotein komplexe (Cas9/RNPs). Cas9/RNPs besteht aus drei Komponenten, rekombinante Cas9 Protein komplexiert mit synthetischen Single-Guide RNA, bestehend aus einem komplexierten CrRNA und TracerRNA. Diese Cas9/RNPs sind in der Lage Spalten genomische Ziele mit einem höheren Wirkungsgrad im Vergleich zu ausländischen DNA-abhängige Ansätze aufgrund ihrer Lieferung als funktionelle komplexe. Darüber hinaus kann schnelle Abfertigung von Cas9/RNPs aus den Zellen der Ziel-Effekte wie Induktion der Apoptose reduzieren. So dienen sie Durchbrüche oder Knock-ins für homologe Rekombination6,7in Kombination mit DNA zu erzeugen. Wir haben gezeigt, dass Elektroporation von Cas9/RNPs ist eine einfache und relativ effiziente Methode, die die bisherigen Einschränkungen der gentechnischen Veränderung in NK-Zellen überwindet.
TGFβ ist eine große immunsuppressive Cytokine, die die Aktivierung und Funktionen von NK-Zellen hemmt. Es wurde vermutet, dass targeting TGFβ Weg Immunzelle Funktionen erhöhen kann. Wir gezielt die Region Codierung TGBR2 ektodomäne die bindet TGFβ11. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen einen deutlichen Rückgang der Ebene der mRNA Expression dieses Gens und weiteren zeigen, dass die veränderten NK-Zellen gegen TGFβ resistent geworden. Darüber hinaus behalten die veränderten Zellen Lebensfähigkeit und proliferative Potential, wie sie in der Lage, erweiterte Post-Elektroporation mit bestrahlten Feeder-Zellen. Daher die folgende Methode ist ein vielversprechender Ansatz zur NK-Zellen genetisch manipulieren, für jeden weiteren klinischen oder wissenschaftliche Zwecke.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RosetteSep&#8482; Human NK Cell Enrichment Cocktail</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>15065</td>
			<td>The RosetteSep&#8482; Human NK Cell Enrichment Cocktail is designed to isolate NK cells from whole blood by negative selection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque&#174; PLUS</td>
			<td>GE Healthcare - Life Sciences</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R&#174; CRISPR-Cas9 tracrRNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>1072532</td>
			<td>TracrRNA that contains proprietary chemical modifications conferring increased nuclease resistance. Hybridizes to crRNA to activate the Cas9 enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R&#174; CRISPR-Cas9 crRNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Synthetically produced as Alt-R&#174; CRISPR-Cas9 crRNA, based on the sequence of designed gRNA targeting the gene of intrest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R&#174; Genome Editing Detection Kit</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>1075931</td>
			<td>Each kit contains T7EI endonuclease, T7EI reaction buffer, and T7EI assay controls.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum&#174; Taq DNA Polymerase High Fidelity</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11304-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4D-Nucleofector&#8482; System</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAF-1002B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant IL-2 Protein</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>65483-0116-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P3 Primary Cell 4D-Nucleofector&#8482; X Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>V4XP-3032</td>
			<td>Contains pmaxGFP&#8482; Vector, Nucleofector&#8482; Solution, Supplement, 16-well Nucleocuvette&#8482; Strips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-targeting: Custom siRNA, Standard 0.05 2mol ON-TARGETplus</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>CTM-360019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R&#174; S.p. Cas9 Nuclease 3NLS</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>1074181</td>
			<td>Cas9 Nuclease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy&#174; Blood &#38; Tissue Handbook</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C3099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF&#946;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>580706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R&#174; CRISPR-Cas9 Control Kit, Human</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>1072554</td>
			<td>Includes tracrRNA, HPRT positive control crRNA, negative control crRNA#1, HPRT Primer Mix, and Nuclease-Free Duplex Buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDTE pH 7.5 (1X TE Solution)</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>11-01-02-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R&#174; Cas9 Electroporation Enhancer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>1075915</td>
			<td>Cas9 Electroporation Enhancer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of knock-out primary and expanded human nk cells using cas9 ribonucleoproteins

CRISPR/Cas9 Technologie beschleunigt sich Genom-Technik in vielen Zelltypen, aber so weit gen Lieferung und stabile gentechnische Veränderung im primären NK-Zellen herausfordernd gewesen. Transgen-Lieferung mit Lentivirale oder retrovirale Transduktion führte beispielsweise in einer begrenzten Ausbeute von gentechnisch NK-Zellen durch erhebliche Verfahren verbundenen NK Zelle Apoptose. Wir beschreiben hier eine DNA-freie Methode für Genom-Bearbeitung von menschlichen Grund- und erweiterten NK-Zellen mit Cas9 Ribonucleoprotein komplexe (Cas9/RNPs). Diese Methode erlaubt effiziente ko von TGFBR2 und HPRT1 Gene in NK-Zellen. RT-PCR-Daten zeigten eine signifikante Abnahme der Gen-Expression-Ebene, und ein Zytotoxizität Assay eines repräsentativen Zelle Produkts vorgeschlagen, dass die RNP-modifizierte NK-Zellen weniger empfindlich auf TGFβ wurde. Genetisch veränderte Zellen möglicherweise erweiterte Post-Elektroporation durch Stimulation mit bestrahlten mbIL21 exprimierenden Feeder-Zellen.

Elektroporation Effizienz
Zur Optimierung der Elektroporation von Cas9/RNPs haben wir 16 verschiedene Programme mit Transduktion von GFP-targeting SiRNA und DNA Plasmid in NK-Zellen getestet. Flow Cytometry Test zeigte, dass die EN-138 den höchsten Anteil an Lebensfähigkeit und Transduktion Zelleffizienz (35 % lebenden GFP positive Zellen) für beide Teilchen (Abbildung 1 und <strong...

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Generation of Knock-out Primary and Expanded Human NK Cells Using Cas9 Ribonucleoproteins

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur primären oder erweiterten menschlichen natürlichen (NK) Killerzellen mit Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs) genetisch zu verändern. Mithilfe dieses Protokolls erzielten wir menschliche NK-Zellen für Umwandlung Wachstumsfaktor-b-Rezeptor 2 (TGFBR2) und Hypoxanthin-Phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) mangelhaft.

Generation von Knock-out-Grund- und erweiterten menschlichen NK-Zellen mit Cas9 Ribonucleoproteins

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Expansion, Reinigung und Functional Assessment of Human peripheren Blut NK-Zellen

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Generation of Organotypic Raft Cultures from Primary Human Keratinocytes

Generierung von Organotypische Floßkulturen aus primären humanen Keratinozyten

The development of organotypic epithelial raft cultures has provided researchers with an efficient in vitro system that faithfully recapitulates ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve and Memory T Cells

Generation der induzierte regulatorische T-Zellen aus primären humanen naiven und Gedächtnis-T-Zellen

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon-System Modifikation von primären menschlichen T-Zellen

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

Generation of Human Alloantigen-spezifischen T-Zellen aus peripherem Blut

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Erzeugung von rekombinanten humanen IgG monoklonalen Antikörpern aus Immortalisierte Sortiert B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Herstellung von menschlichen Monozyten abgeleiteten Dendritischen Zellen aus Vollblut

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

Dextran erhöht die Effizienz der Lentivirale Transduktion von murinen und menschliche primäre NK-Zellen

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

Kleine RNA Transfektion in primären humanen Th17-Zellen durch Next Generation Elektroporation

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Ein Flow Cytometry-basierte Zytotoxizität Assay für die Beurteilung der menschlichen NK-Zell-Aktivität

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...