Name: generation of knock-out primary and expanded human nk cells using cas9 ribonucleoproteins
Uploaded: 2018-06-14T15:00:00
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Riconosciamo Brian Tullius per il suo gentile aiuto nella redazione del manoscritto.

Buffy coats donatore sano sono stati ottenuti come materiale di partenza da Central Ohio regione American Red Cross. Questa ricerca è stata determinata per essere esentato ricerca ospedale pediatrico Nationwide di Board Review istituzionale.
1. espansione e purificazione delle cellule NK umana
<ol><li>Isolare i PBMCs da Buffy-Coat12.<ol>
<li>Livello 35 mL di campione di buffy-coat su 15 mL di Ficoll-Paque.</li>
		<li>Centrifugare a 400 x g per 20 minuti senza freno e...

<ol>
	<li>Guven, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+primary+human+natural+killer+cells+by+retroviral+transduction.">Efficient gene transfer into primary human natural killer cells by retroviral transduction.</a> Experimental Hematology. 33 (11), 1320-1328 (2005).</li><li>Alici, E., Sutlu, T., Sirac Dilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+gene+transfer+into+primary+human+natural+killer+cells.">Retroviral gene transfer into primary human natural killer cells.</a> Methods in Molecular Biology. 508, 127-137 (2009).</li><li>Carlsten, M., Childs, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Manipulation+of+NK+Cells+for+Cancer+Immunotherapy:+Techniques+and+Clinical+Implications.">Genetic Manipulation of NK Cells for Cancer Immunotherapy: Techniques and Clinical Implications.</a> Frontiers in Immunology. 6, 266 (2015).</li><li>Mehta, R. S., Rezvani, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+Antigen+Receptor+Expressing+Natural+Killer+Cells+for+the+Immunotherapy+of+Cancer.">Chimeric Antigen Receptor Expressing Natural Killer Cells for the Immunotherapy of Cancer.</a> Frontiers in Immunology. 283, 9 (2018).</li><li>Zuris, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+lipid-mediated+delivery+of+proteins+enables+efficient+protein-based+genome+editing+in+vitro+and+in+vivo.">Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo.</a> Nature Biotechnology. 33 (1), 73-80 (2015).</li><li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+delivery+of+genome-editing+proteins+using+bioreducible+lipid+nanoparticles.">Efficient delivery of genome-editing proteins using bioreducible lipid nanoparticles.</a> PNAS. 113 (11), 2868-2873 (2016).</li><li>Liang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+DNA-free+genome+editing+of+bread+wheat+using+CRISPR/Cas9+ribonucleoprotein+complexes.">Efficient DNA-free genome editing of bread wheat using CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein complexes.</a> Nature Communications. 8, 14261 (2017).</li><li>DeWitt, M. A., Corn, J. E., Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+via+delivery+of+Cas9+ribonucleoprotein.">Genome editing via delivery of Cas9 ribonucleoprotein.</a> Methods. , 9-15 (2017).</li><li>Rezvani, K., Rouce, R., Liu, E., Shpall, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+Natural+Killer+Cells+for+Cancer+Immunotherapy.">Engineering Natural Killer Cells for Cancer Immunotherapy.</a> Molecular Therapy. 25 (8), 1769-1781 (2017).</li><li>Sutlu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+intracellular+antiviral+defense+mechanisms+augments+lentiviral+transduction+of+human+natural+killer+cells:+implications+for+gene+therapy.">Inhibition of intracellular antiviral defense mechanisms augments lentiviral transduction of human natural killer cells: implications for gene therapy.</a> Human Gene Therapy. 23 (10), 1090-1100 (2012).</li><li>Viel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+inhibits+the+activation+and+functions+of+NK+cells+by+repressing+the+mTOR+pathway.">TGF-beta inhibits the activation and functions of NK cells by repressing the mTOR pathway.</a> Science Signaling. 9 (415), (2016).</li><li>Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion,+purification,+and+functional+assessment+of+human+peripheral+blood+NK+cells.">Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells.</a> JoVE. (48), (2011).</li><li>Lee, D. A., Verneris, M. R., Campana, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquisition,+preparation,+and+functional+assessment+of+human+NK+cells+for+adoptive+immunotherapy.">Acquisition, preparation, and functional assessment of human NK cells for adoptive immunotherapy.</a> Methods in Molecular Biology. , 61-77 (2010).</li><li>Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+T7E1+and+surveyor+mismatch+cleavage+assays+to+detect+mutations+triggered+by+engineered+nucleases.">Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases.</a> G3. 5 (3), 407-415 (2015).</li><li>Eyquem, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+a+CAR+to+the+TRAC+locus+with+CRISPR/Cas9+enhances+tumour+rejection.">Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection.</a> Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).</li><li>Liang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+highly+efficient+mammalian+cell+engineering+via+Cas9+protein+transfection.">Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection.</a> Journal of Biotechnology. 208, 44-53 (2015).</li><li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins.">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li><li>Chmielecki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+Profiling+of+a+Large+Set+of+Diverse+Pediatric+Cancers+Identifies+Known+and+Novel+Mutations+across+Tumor+Spectra.">Genomic Profiling of a Large Set of Diverse Pediatric Cancers Identifies Known and Novel Mutations across Tumor Spectra.</a> Cancer Research. 77 (2), 509-519 (2017).</li><li>Schultz, L. M., Majzner, R., Davis, K. L., Mackall, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+developments+in+immunotherapy+for+pediatric+solid+tumors.">New developments in immunotherapy for pediatric solid tumors.</a> Current Opinion in Pediatrics. 30 (1), 30-39 (2018).</li></ol>

Modificazione del DNA-dipendente delle cellule di NK è stato impegnativo4,9. Abbiamo, pertanto, introdotto direttamente un complesso ribonucleoproteico sinteticamente preformati (RNP) e la proteina Cas9 come proteina purificata nel primario ed espansa di cellule NK8. Questo metodo ci ha permesso di eliminare la tappatura, alle costole, e altri processi trascrizionali e traslazionali iniziato dalla RNA polimerasi II, che può causare l'apo...

Immunoterapia del cancro è stato avanzato negli ultimi anni. Le cellule di T del recettore (auto) antigene chimerica geneticamente modificati sono un ottimo esempio di cellule immuni ingegnerizzate distribuito correttamente nell'immunoterapia del cancro. Queste cellule sono stati recentemente approvate dalla FDA per il trattamento contro CD19 + B delle cellule maligne, ma successo finora è stata limitata a malattie cuscinetto alcuni antigeni indirizzabile e targeting tale limitato repertorio antigenico è incline al fallimento di fuga immune. Inoltre, le cellule di T di auto sono state concentrate sull'uso di cellule T autologhe a causa del rischio di malattia dell'innesto - contro - ospite causata da cellule T allogeniche. Al contrario, le cellule NK sono in grado di uccidere il tumore obiettivi in maniera antigene-indipendente e non causano GvHD, che li rende un buon candidato per l'immunoterapia del cancro6,7,8,9.
CRISPR/Cas9 tecnologia è stata usata recentemente in ingegneria cellule immuni, ma geneticamente riprogrammazione delle cellule NK con plasmidi è sempre stato impegnativo. Questo è stato a causa di difficoltà nella consegna del transgene in un modo dipendente dalla DNA come trasduzione retrovirali e lentivirali causando sostanziale procedura-collegata di apoptosi di cellule NK e la produzione limitata di geneticamente le cellule NK4 , 9.
Molte cellule immuni innate esprimono alti livelli di recettori per pattern molecolari associati come Retinoic acid inducible gene ho (RIG-io), che consentono maggiore riconoscimento di DNA estraneo. Soppressione di queste vie ha permesso una maggiore efficienza di trasduzione in cellule di NK quando si utilizzano metodi basati sul DNA per modificazione genetica10.
Qui descriviamo il metodo per l'utilizzo di un editing genomico privo di DNA di cellule NK primarie ed espanse utilizzando complessi di ribonucleoproteina Cas9 (Cas9/RNP). Cas9/RNP è composto da tre componenti, ricombinante Cas9 proteina complessata con RNA di singolo-guida sintetico composto da complessato crRNA, tracerRNA. Questi Cas9/RNP sono capaci di scissione target genomici con maggiore efficienza rispetto agli approcci di DNA-dipendente stranieri a causa della loro consegna come funzionali complessi. Inoltre, uno sdoganamento rapido di Cas9/RNP dalle cellule può ridurre gli effetti di fuori bersaglio come induzione di apoptosi. Così, essi può essere utilizzati per generare il knock-out o knock-in quando combinato con il DNA per ricombinazione omologa6,7. Abbiamo mostrato che l'elettroporazione di Cas9/RNP è un metodo facile e relativamente efficiente che consente di superare i vincoli precedenti di modificazione genetica in cellule di NK.
TGFβ è una citochina immunosoppressiva principale, che inibisce l'attivazione e le funzioni delle cellule NK. È stato suggerito che il pathway TGFβ di targeting può aumentare le funzioni delle cellule immuni. Siamo presi di mira la regione codifica ectodomain di TGBR2 che lega TGFβ11. I risultati rappresentativi mostrano una diminuzione significativa del livello di espressione di mRNA di questo gene e dimostrano ulteriormente che le cellule NK modificate diventano resistenti a TGFβ. Inoltre, le celle modificate mantenere vitalità e potenziale proliferativo, come essi sono in grado di essere espanso post-elettroporazione utilizzando cellule di alimentatore irradiati. Di conseguenza, il metodo seguente è un promettente approccio per manipolare geneticamente le cellule NK per qualsiasi ulteriore clinico o scopi di ricerca.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RosetteSep&#8482; Human NK Cell Enrichment Cocktail</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>15065</td>
			<td>The RosetteSep&#8482; Human NK Cell Enrichment Cocktail is designed to isolate NK cells from whole blood by negative selection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque&#174; PLUS</td>
			<td>GE Healthcare - Life Sciences</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R&#174; CRISPR-Cas9 tracrRNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>1072532</td>
			<td>TracrRNA that contains proprietary chemical modifications conferring increased nuclease resistance. Hybridizes to crRNA to activate the Cas9 enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R&#174; CRISPR-Cas9 crRNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Synthetically produced as Alt-R&#174; CRISPR-Cas9 crRNA, based on the sequence of designed gRNA targeting the gene of intrest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R&#174; Genome Editing Detection Kit</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>1075931</td>
			<td>Each kit contains T7EI endonuclease, T7EI reaction buffer, and T7EI assay controls.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum&#174; Taq DNA Polymerase High Fidelity</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11304-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4D-Nucleofector&#8482; System</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAF-1002B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant IL-2 Protein</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>65483-0116-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P3 Primary Cell 4D-Nucleofector&#8482; X Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>V4XP-3032</td>
			<td>Contains pmaxGFP&#8482; Vector, Nucleofector&#8482; Solution, Supplement, 16-well Nucleocuvette&#8482; Strips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-targeting: Custom siRNA, Standard 0.05 2mol ON-TARGETplus</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>CTM-360019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R&#174; S.p. Cas9 Nuclease 3NLS</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>1074181</td>
			<td>Cas9 Nuclease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy&#174; Blood &#38; Tissue Handbook</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C3099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF&#946;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>580706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R&#174; CRISPR-Cas9 Control Kit, Human</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>1072554</td>
			<td>Includes tracrRNA, HPRT positive control crRNA, negative control crRNA#1, HPRT Primer Mix, and Nuclease-Free Duplex Buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDTE pH 7.5 (1X TE Solution)</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>11-01-02-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R&#174; Cas9 Electroporation Enhancer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>1075915</td>
			<td>Cas9 Electroporation Enhancer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of knock-out primary and expanded human nk cells using cas9 ribonucleoproteins

CRISPR/Cas9 tecnologia sta accelerando ingegneria genoma in molti tipi cellulari, ma finora, consegna del gene e modificazione genetica stabile sono stati impegnativi in cellule primarie di NK. Ad esempio, consegna di transgene mediante trasduzione lentivirale o retrovirali ha provocato una resa limitata delle cellule NK geneticamente a causa della sostanziale procedura-collegata di apoptosi di cellule NK. Descriviamo qui un metodo privo di DNA per l'editing genomico umane primarie e ampliate delle cellule di NK utilizzando complessi di ribonucleoproteina Cas9 (Cas9/RNP). Questo metodo ha permesso efficiente knockout del TGFBR2 e HPRT1 geni in cellule di NK. Dati di RT-PCR ha mostrato una diminuzione significativa nel livello di espressione genica, e un'analisi di citotossicità di un prodotto rappresentativo delle cellule ha suggerito che le cellule NK RNP-modificato è diventato meno sensibile di TGFβ. Cellule geneticamente modificate potrebbero essere espansa post-elettroporazione dalla stimolazione con irradiato mbIL21-esprimendo le cellule di alimentatore.

Efficienza di elettroporazione
Per ottimizzare l'elettroporazione di Cas9/RNP, abbiamo testato 16 programmi diversi con trasduzione di GFP non-targeting siRNA e plasmide del DNA in cellule NK. Analisi di citometria a flusso ha mostrato che l' EN-138 aveva la più alta percentuale di efficienza attuabilità e la trasduzione delle cellule (35% GFP positive cellule vive) per entrambe le particelle (<strong class="xfig...

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Generation of Knock-out Primary and Expanded Human NK Cells Using Cas9 Ribonucleoproteins

Qui, presentiamo un protocollo per modificare geneticamente le cellule primarie o espanso umana naturale dell'assassino (NK) utilizzando Cas9 ribonucleoproteine (Cas9/RNP). Utilizzando questo protocollo, abbiamo generato le cellule NK umane carenti per trasformare il recettore del fattore di crescita – b 2 (TGFBR2) e ipoxantina fosforibosiltransferasi 1 (HPRT1).

Generazione di cellule Knock-out NK umano primario ed espansa utilizzando Cas9 ribonucleoproteine

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Espansione, di purificazione, e la valutazione funzionale delle cellule del sangue umano periferico NK

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Ricerca

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Generazione di culture Raft organotipiche da cheratinociti umani primari

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piggyBac Transposon modifica del sistema di cellule primarie umane T

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Piccolo RNA trasfezione in cellule primarie Th17 Human Next Generation elettroporazione

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A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Un'analisi di citotossicità di base di citometria a flusso per la valutazione dell'attività delle cellule NK umane

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