Name: generation of knock-out primary and expanded human nk cells using cas9 ribonucleoproteins
Uploaded: 2018-06-14T15:00:00
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原稿を編集で彼の親切な助けのブライアン ・ トゥッリウス ・を認めます。

健康なドナー バフィー コート素材としてから中央オハイオ州地域米国赤十字社が得られました。この研究は、制度検討委員会の全国小児病院によって免除の研究に決定されました。
1. ヒト NK 細胞精製と拡大
<ol><li>バフィー コート12から PBMCs を分離します。<ol>
<li>レイヤー Ficoll Paque の 15 mL のバフィー コート サンプルの 35 mL。</li>
		<li>ブレーキなし...

<ol>
	<li>Guven, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+primary+human+natural+killer+cells+by+retroviral+transduction.">Efficient gene transfer into primary human natural killer cells by retroviral transduction.</a> Experimental Hematology. 33 (11), 1320-1328 (2005).</li><li>Alici, E., Sutlu, T., Sirac Dilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+gene+transfer+into+primary+human+natural+killer+cells.">Retroviral gene transfer into primary human natural killer cells.</a> Methods in Molecular Biology. 508, 127-137 (2009).</li><li>Carlsten, M., Childs, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Manipulation+of+NK+Cells+for+Cancer+Immunotherapy:+Techniques+and+Clinical+Implications.">Genetic Manipulation of NK Cells for Cancer Immunotherapy: Techniques and Clinical Implications.</a> Frontiers in Immunology. 6, 266 (2015).</li><li>Mehta, R. S., Rezvani, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+Antigen+Receptor+Expressing+Natural+Killer+Cells+for+the+Immunotherapy+of+Cancer.">Chimeric Antigen Receptor Expressing Natural Killer Cells for the Immunotherapy of Cancer.</a> Frontiers in Immunology. 283, 9 (2018).</li><li>Zuris, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+lipid-mediated+delivery+of+proteins+enables+efficient+protein-based+genome+editing+in+vitro+and+in+vivo.">Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo.</a> Nature Biotechnology. 33 (1), 73-80 (2015).</li><li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+delivery+of+genome-editing+proteins+using+bioreducible+lipid+nanoparticles.">Efficient delivery of genome-editing proteins using bioreducible lipid nanoparticles.</a> PNAS. 113 (11), 2868-2873 (2016).</li><li>Liang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+DNA-free+genome+editing+of+bread+wheat+using+CRISPR/Cas9+ribonucleoprotein+complexes.">Efficient DNA-free genome editing of bread wheat using CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein complexes.</a> Nature Communications. 8, 14261 (2017).</li><li>DeWitt, M. A., Corn, J. E., Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+via+delivery+of+Cas9+ribonucleoprotein.">Genome editing via delivery of Cas9 ribonucleoprotein.</a> Methods. , 9-15 (2017).</li><li>Rezvani, K., Rouce, R., Liu, E., Shpall, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+Natural+Killer+Cells+for+Cancer+Immunotherapy.">Engineering Natural Killer Cells for Cancer Immunotherapy.</a> Molecular Therapy. 25 (8), 1769-1781 (2017).</li><li>Sutlu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+intracellular+antiviral+defense+mechanisms+augments+lentiviral+transduction+of+human+natural+killer+cells:+implications+for+gene+therapy.">Inhibition of intracellular antiviral defense mechanisms augments lentiviral transduction of human natural killer cells: implications for gene therapy.</a> Human Gene Therapy. 23 (10), 1090-1100 (2012).</li><li>Viel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+inhibits+the+activation+and+functions+of+NK+cells+by+repressing+the+mTOR+pathway.">TGF-beta inhibits the activation and functions of NK cells by repressing the mTOR pathway.</a> Science Signaling. 9 (415), (2016).</li><li>Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion,+purification,+and+functional+assessment+of+human+peripheral+blood+NK+cells.">Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells.</a> JoVE. (48), (2011).</li><li>Lee, D. A., Verneris, M. R., Campana, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquisition,+preparation,+and+functional+assessment+of+human+NK+cells+for+adoptive+immunotherapy.">Acquisition, preparation, and functional assessment of human NK cells for adoptive immunotherapy.</a> Methods in Molecular Biology. , 61-77 (2010).</li><li>Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+T7E1+and+surveyor+mismatch+cleavage+assays+to+detect+mutations+triggered+by+engineered+nucleases.">Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases.</a> G3. 5 (3), 407-415 (2015).</li><li>Eyquem, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+a+CAR+to+the+TRAC+locus+with+CRISPR/Cas9+enhances+tumour+rejection.">Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection.</a> Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).</li><li>Liang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+highly+efficient+mammalian+cell+engineering+via+Cas9+protein+transfection.">Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection.</a> Journal of Biotechnology. 208, 44-53 (2015).</li><li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins.">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li><li>Chmielecki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+Profiling+of+a+Large+Set+of+Diverse+Pediatric+Cancers+Identifies+Known+and+Novel+Mutations+across+Tumor+Spectra.">Genomic Profiling of a Large Set of Diverse Pediatric Cancers Identifies Known and Novel Mutations across Tumor Spectra.</a> Cancer Research. 77 (2), 509-519 (2017).</li><li>Schultz, L. M., Majzner, R., Davis, K. L., Mackall, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+developments+in+immunotherapy+for+pediatric+solid+tumors.">New developments in immunotherapy for pediatric solid tumors.</a> Current Opinion in Pediatrics. 30 (1), 30-39 (2018).</li></ol>

4,9NK 細胞の DNA 依存した変更にチャレンジしております。我々 は、したがって、直接総合的前もって形成されたリボ核タンパク質 (結合) 複合体と Cas9 タンパク質精製タンパク質としてに導入プライマリおよび拡張された NK 細胞8。このメソッドを使用すると、キャップを排除するために実行できましたが、尾行と他の転写と翻訳?...

がん免疫療法は、近年進められています。遺伝子組み換えキメラ抗原受容体 (車) T 細胞は、癌免疫療法に正常に展開設計の免疫細胞の優れた例です。これらの細胞は最近に対する治療薬として FDA によって承認された CD19 + B 細胞悪性腫瘍、しかし、成功のいくつかの対象抗原を軸受の病気に限られているところし、免疫の脱出によって故障しやすいがこのような限られた抗原のレパートリーを対象とします。さらに、車の T 細胞は移植片対宿主病同種 T 細胞によって引き起こされるの危険のため自己の T 細胞の使用に注目されています。対照的に、NK 細胞は、抗原非依存性に腫瘍ターゲットを殺すことやがん免疫療法6,7,8,9の良い候補になる GvHD が発生しません。
CRISPR/Cas9 技術は、エンジニア リングの免疫細胞で最近使用されていますが、遺伝子組み換えプラスミドを持つ NK 細胞をリプログラミング常に挑戦されています。これは実質的な手順による NK 細胞のアポトーシスと遺伝子組み換え NK 細胞4の限定生産を引き起こすレンチ ウイルス、レトロ ウイルスの伝達など DNA 依存的遺伝子配信の難しさによるずっと,9。
多くの自然免疫系細胞、病原体関連分子パターンの受容体の高レベルを表現レチノイン酸誘導性遺伝子私(リグ-私)、外来 DNA の高められた認識を有効にします。遺伝子組み換え10の DNA ベースのメソッドを使用する場合、これらの経路の抑制が NK 細胞の情報伝達効率を有効に。
プライマリと拡張のヒト NK 細胞 Cas9 リボ核蛋白質複合体 (Cas9/結合) を利用の編集無料の DNA ゲノムを使用する方法をご紹介します。Cas9/結合組換え Cas9 蛋白質複合体 crRNA と tracerRNA から成る合成の単一ガイド RNA との複合体の 3 つのコンポーネントで構成されます。これらの Cas9/結合機能性錯体としての配信のための外国の DNA 依存性アプローチと比較して高効率なゲノムのターゲットを切断が可能です。また、Cas9/結合セルからの迅速なクリアランスは、アポトーシスの誘導などのターゲットをオフの効果を減らす可能性があります。したがって、彼らは、ノックアウト、またはノックを相同組換え6、7の DNA と組み合わせた場合を生成する使用できます。Cas9/結合のエレクトロポレーションを示した NK 細胞で遺伝子組み換えの前の制約を克服する簡単で比較的効率的な方法です。
TGFβ は、主要な免疫サイトカイン、活性化、NK 細胞の機能を阻害します。TGFβ 経路をターゲットで免疫細胞の機能を高めることができると言われています。我々 は TGFβ11.にバインドする TGBR2 外部ドメインをエンコーディング地域を対象と代表の結果は、この遺伝子の発現レベルが大幅に低下を示し、さらに変更された NK 細胞なる TGFβ に耐性を示します。さらに、変更されたセルに保持の生存率、増殖能拡張ポスト エレクトロポレーション照射フィーダー細胞.を使用することは、したがって、次のメソッドがいずれかの NK 細胞を遺伝子操作する有望なアプローチさらに臨床や研究の目的。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RosetteSep&#8482; Human NK Cell Enrichment Cocktail</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>15065</td>
			<td>The RosetteSep&#8482; Human NK Cell Enrichment Cocktail is designed to isolate NK cells from whole blood by negative selection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque&#174; PLUS</td>
			<td>GE Healthcare - Life Sciences</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R&#174; CRISPR-Cas9 tracrRNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>1072532</td>
			<td>TracrRNA that contains proprietary chemical modifications conferring increased nuclease resistance. Hybridizes to crRNA to activate the Cas9 enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R&#174; CRISPR-Cas9 crRNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Synthetically produced as Alt-R&#174; CRISPR-Cas9 crRNA, based on the sequence of designed gRNA targeting the gene of intrest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R&#174; Genome Editing Detection Kit</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>1075931</td>
			<td>Each kit contains T7EI endonuclease, T7EI reaction buffer, and T7EI assay controls.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum&#174; Taq DNA Polymerase High Fidelity</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11304-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4D-Nucleofector&#8482; System</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAF-1002B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant IL-2 Protein</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>65483-0116-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P3 Primary Cell 4D-Nucleofector&#8482; X Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>V4XP-3032</td>
			<td>Contains pmaxGFP&#8482; Vector, Nucleofector&#8482; Solution, Supplement, 16-well Nucleocuvette&#8482; Strips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-targeting: Custom siRNA, Standard 0.05 2mol ON-TARGETplus</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>CTM-360019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R&#174; S.p. Cas9 Nuclease 3NLS</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>1074181</td>
			<td>Cas9 Nuclease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy&#174; Blood &#38; Tissue Handbook</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C3099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF&#946;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>580706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R&#174; CRISPR-Cas9 Control Kit, Human</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>1072554</td>
			<td>Includes tracrRNA, HPRT positive control crRNA, negative control crRNA#1, HPRT Primer Mix, and Nuclease-Free Duplex Buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDTE pH 7.5 (1X TE Solution)</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>11-01-02-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R&#174; Cas9 Electroporation Enhancer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>1075915</td>
			<td>Cas9 Electroporation Enhancer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of knock-out primary and expanded human nk cells using cas9 ribonucleoproteins

CRISPR/Cas9 技術が多くの細胞の種類が今のところ、遺伝子デリバリーのゲノム工学を加速し、安定した遺伝子の改変は、NK 細胞の挑戦されています。たとえば、レンチ ウイルスやレトロ ウイルスの伝達の使用 transgene 配信実質的な手順による NK 細胞のアポトーシスにより NK 細胞を遺伝子組み換えの限られた収量結果になったCas9 リボ核蛋白質複合体 (Cas9/結合) を使用してプライマリおよび拡張の NK 細胞を人間のゲノムの編集を DNA 法をご紹介します。このメソッドは、NK 細胞における HPRT1 遺伝子 TGFBR2と効率的なノックアウトをできました。RT-PCR のデータを示した遺伝子発現レベルが大幅に低下、代表的な細胞製品の細胞毒性の試金は RNP 変更 NK 細胞 TGFβ により少なく敏感になったことを提案しました。遺伝子組み換え細胞ことができる照射 mbIL21 発現刺激による拡張されたポスト エレクトロポレーション フィーダー細胞。

エレクトロポレーション効率
Cas9/結合へのエレクトロポレーションを最適化するため、我々 は NK 細胞に GFP を対象とした siRNA とプラスミドの伝達で 16 の異なるプログラムをテストしました。流れの cytometry の試金を認めたEN 138細胞生存率および伝達効率 (35% ライブ GFP 陽性細胞) (図 1 ・<st...

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Generation of Knock-out Primary and Expanded Human NK Cells Using Cas9 Ribonucleoproteins

ここでは、 Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/結合) を使用してプライマリまたは拡張された人間の自然なキラー (NK) 細胞を遺伝的に変更するためのプロトコルを提案する.このプロトコルを使用して、我々 はヒト NK 細胞 (TGFBR2) -b の成長因子受容体 2 の変換のし、ヒポキサンチン phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) の欠乏を生成されます。

Cas9 Ribonucleoproteins を使用してノックアウト プライマリおよび拡張された人間の NK 細胞の生成

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

拡大、精製、及びヒト末梢血NK細胞の機能的評価

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Generation of Organotypic Raft Cultures from Primary Human Keratinocytes

初代ヒトケラチノサイトからカドヘリン文化の生成

The development of organotypic epithelial raft cultures has provided researchers with an efficient in vitro system that faithfully recapitulates ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve and Memory T Cells

初代ヒトナイーブおよびメモリーT細胞から誘導した調節性T細胞の生成

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

プライマリーヒトT細胞のpiggyBacトランスポゾンシステムの変更

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

末梢血からのヒトアロ抗原特異的T細胞の生成

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

不死化ソートB細胞からの組換えヒトIgGモノクローナル抗体の作製

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

全血からのヒト単球由来樹状細胞の生成

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

デキストランは、マウスとヒト NK 細胞のレンチ ウイルスの伝達効率を向上します。

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

次世代エレクトロポレーションによって初代ヒトTh17細胞の小さなRNAのトランスフェクション

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

ヒト NK 細胞活性の評価の流れのフローサイトメトリーを用いた細胞毒性の試金

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

Cas9 Ribonucleoproteins を使用してノックアウト プライマリおよび拡張された人間の NK 細胞の生成

Cas9 Ribonucleoproteins を使用してノックアウトプライマリおよび拡張された人間の NK 細胞の生成