Name: generation of knock-out primary and expanded human nk cells using cas9 ribonucleoproteins
Uploaded: 2018-06-14T15:00:00
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우리는 원고 편집에 그의 친절 한 도움에 대 한 브라이언 툴 리를 인정 합니다.

건강 한 기증자 버 피 코트에서 중앙 오하이오 지역 미국 적십자 소스 자료로 얻은 했다. 이 연구는 제도적 검토 보드의 전국 어린이 병원으로 면제 연구 될 결정 했다.
1. 인간 NK 세포 정화 및 확장
<ol><li>버 피 코트12에서 PBMCs를 격리 합니다.<ol>
<li>35 mL Ficoll-Paque의 15 mL에 버 피 코트 샘플의 레이어.</li>
		<li>브레이크 없이 20 분에 대 한 400 x g에서 centrifuge 고 ?...

<ol>
	<li>Guven, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+primary+human+natural+killer+cells+by+retroviral+transduction.">Efficient gene transfer into primary human natural killer cells by retroviral transduction.</a> Experimental Hematology. 33 (11), 1320-1328 (2005).</li><li>Alici, E., Sutlu, T., Sirac Dilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+gene+transfer+into+primary+human+natural+killer+cells.">Retroviral gene transfer into primary human natural killer cells.</a> Methods in Molecular Biology. 508, 127-137 (2009).</li><li>Carlsten, M., Childs, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Manipulation+of+NK+Cells+for+Cancer+Immunotherapy:+Techniques+and+Clinical+Implications.">Genetic Manipulation of NK Cells for Cancer Immunotherapy: Techniques and Clinical Implications.</a> Frontiers in Immunology. 6, 266 (2015).</li><li>Mehta, R. S., Rezvani, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+Antigen+Receptor+Expressing+Natural+Killer+Cells+for+the+Immunotherapy+of+Cancer.">Chimeric Antigen Receptor Expressing Natural Killer Cells for the Immunotherapy of Cancer.</a> Frontiers in Immunology. 283, 9 (2018).</li><li>Zuris, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+lipid-mediated+delivery+of+proteins+enables+efficient+protein-based+genome+editing+in+vitro+and+in+vivo.">Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo.</a> Nature Biotechnology. 33 (1), 73-80 (2015).</li><li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+delivery+of+genome-editing+proteins+using+bioreducible+lipid+nanoparticles.">Efficient delivery of genome-editing proteins using bioreducible lipid nanoparticles.</a> PNAS. 113 (11), 2868-2873 (2016).</li><li>Liang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+DNA-free+genome+editing+of+bread+wheat+using+CRISPR/Cas9+ribonucleoprotein+complexes.">Efficient DNA-free genome editing of bread wheat using CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein complexes.</a> Nature Communications. 8, 14261 (2017).</li><li>DeWitt, M. A., Corn, J. E., Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+via+delivery+of+Cas9+ribonucleoprotein.">Genome editing via delivery of Cas9 ribonucleoprotein.</a> Methods. , 9-15 (2017).</li><li>Rezvani, K., Rouce, R., Liu, E., Shpall, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+Natural+Killer+Cells+for+Cancer+Immunotherapy.">Engineering Natural Killer Cells for Cancer Immunotherapy.</a> Molecular Therapy. 25 (8), 1769-1781 (2017).</li><li>Sutlu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+intracellular+antiviral+defense+mechanisms+augments+lentiviral+transduction+of+human+natural+killer+cells:+implications+for+gene+therapy.">Inhibition of intracellular antiviral defense mechanisms augments lentiviral transduction of human natural killer cells: implications for gene therapy.</a> Human Gene Therapy. 23 (10), 1090-1100 (2012).</li><li>Viel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+inhibits+the+activation+and+functions+of+NK+cells+by+repressing+the+mTOR+pathway.">TGF-beta inhibits the activation and functions of NK cells by repressing the mTOR pathway.</a> Science Signaling. 9 (415), (2016).</li><li>Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion,+purification,+and+functional+assessment+of+human+peripheral+blood+NK+cells.">Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells.</a> JoVE. (48), (2011).</li><li>Lee, D. A., Verneris, M. R., Campana, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquisition,+preparation,+and+functional+assessment+of+human+NK+cells+for+adoptive+immunotherapy.">Acquisition, preparation, and functional assessment of human NK cells for adoptive immunotherapy.</a> Methods in Molecular Biology. , 61-77 (2010).</li><li>Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+T7E1+and+surveyor+mismatch+cleavage+assays+to+detect+mutations+triggered+by+engineered+nucleases.">Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases.</a> G3. 5 (3), 407-415 (2015).</li><li>Eyquem, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+a+CAR+to+the+TRAC+locus+with+CRISPR/Cas9+enhances+tumour+rejection.">Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection.</a> Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).</li><li>Liang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+highly+efficient+mammalian+cell+engineering+via+Cas9+protein+transfection.">Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection.</a> Journal of Biotechnology. 208, 44-53 (2015).</li><li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins.">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li><li>Chmielecki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+Profiling+of+a+Large+Set+of+Diverse+Pediatric+Cancers+Identifies+Known+and+Novel+Mutations+across+Tumor+Spectra.">Genomic Profiling of a Large Set of Diverse Pediatric Cancers Identifies Known and Novel Mutations across Tumor Spectra.</a> Cancer Research. 77 (2), 509-519 (2017).</li><li>Schultz, L. M., Majzner, R., Davis, K. L., Mackall, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+developments+in+immunotherapy+for+pediatric+solid+tumors.">New developments in immunotherapy for pediatric solid tumors.</a> Current Opinion in Pediatrics. 30 (1), 30-39 (2018).</li></ol>

NK 세포의 DNA-종속 수정4,9도전 하고있다. 우리는, 따라서, 도입 직접 종합적으로 미리 형성한 ribonucleoprotein (RNPs) 복잡 하 고 Cas9 단백질 순화 된 단백질으로 기본 및 확장 된 NK 세포8로. 이 방법은 미행, 상한, 제거를 허용 하 고 다른 transcriptional 및 변환 프로세스는 RNA 중 합 효소 II는 DNA 의존 변환 메서드에 연결 된 NK 세포 apoptosis를 발생...

암 immunotherapy 최근 몇 년 동안에서 고급 되었습니다. 유전자 변형 공상 항 원 수용 체 (자동차) T 세포는 암 immunotherapy에 성공적으로 배포 하는 설계 된 면역 세포의 훌륭한 예입니다. 이 셀 최근에 대 한 처리를 위한 FDA에 의해 승인 되었다 CD19 + B 세포 악성 종양, 하지만 성공 지금까지 몇 대상 항, 베어링 질병에 국한 되었으며 같은 제한 된 항 원 레파토리를 대상으로 하는 것은 면역 탈출 하 여 실패 하는 경향이. 또한, 자동차 T 세포 이식-비교-호스트 질병 수용자 T 세포에 의해 발생의 헌 T 세포의 사용에 집중 되었습니다 했다. 반면, NK 세포는 종양 표적 항 원 독립적인 방식으로 죽 일 수 있으며 GvHD, 그들에 게 암 immunotherapy6,7,,89에 대 한 좋은 후보를 발생 하지 않습니다.
CRISPR/Cas9 기술 최근 엔지니어링 면역 세포에서 사용 되었습니다 하지만 NK 세포는 플라스 미드 유전자 재프로그래밍 항상 도전 하고있다. 이것은 lentiviral 및 retroviral 변환 상당한 절차 관련 된 NK 세포 apoptosis와 유전자 조작된 NK 세포4 의 제한 된 생산 유발 등 DNA 의존 방식에서 transgene 배달에 어려움으로 인해 되었습니다. , 9.
많은 타고 난 면역 세포 표현 병원 체 관련 된 분자 패턴에 대 한 수용 체의 상부와 같은 Retinoic 산을 유도할 수 있는 유전자 나 (장비-난), 어떤 외국 DNA의 과장 된 인식의 사용. 유전 수정10DNA 기반 방법을 사용 하 여 때 이러한 통로의 억제 NK 세포에 더 높은 변환 효율을 수 있게 되었습니다.
여기는 DNA 무료 게놈의 편집 기본 및 확장 된 인간 NK 세포 Cas9 ribonucleoprotein 복합물 (Cas9/RNPs)를 활용 하 여 사용 하기 위한 방법을 설명 합니다. Cas9/RNPs는 세 가지 구성 요소, 재조합 Cas9 단백질에 complexed 합성 단일 가이드 RNA complexed crRNA와 tracerRNA의 구성으로 이루어져 있습니다. 이러한 Cas9/RNPs 기능 복합물으로 그들의 배달으로 인해 외국 DNA 종속 접근 높은 효율으로 게놈 목표를 고착 할 수 있다. 또한, Cas9/RNPs 세포에서의 신속한 통관 apoptosis 유도 등 대상 오프 효과 줄일 수 있습니다. 따라서, 그들은 노크-아웃, 또는 동종 재결합6,7에 대 한 DNA와 결합 될 때 노크 기능 생성을 사용할 수 있습니다. 우리는 Cas9/RNPs의 그 electroporation 보였다 NK 세포에서 유전자 조작의 이전 제약을 극복 하는 간단 하 고 비교적 효율적인 방법입니다.
TGFβ는 활성화 및 NK 세포의 기능을 억제 하는 주요 면역 억제 사이토카인 이다. 그것은 TGFβ 통로 대상으로 면역 세포 기능을 높일 수 있습니다 제안 되었습니다. 우리 TGBR2 ectodomain TGFβ11. 을 바인딩하는 인코딩 지역 대상 대표 결과이 유전자의 mRNA 발현의 수준에 상당한 감소를 표시 하 고 추가 수정 된 NK 세포가 TGFβ에 저항력이 될 입증. 또한, 수정 된 셀 유지 생존 및 증식 잠재력, 그들은 확장 된 게시물 electroporation에 비친된 피더 세포. 을 사용 하 여 될 수 있다 따라서, 다음 메서드는 유전자에 대 한 NK 세포를 조작 하는 유망한 접근 방식을 추가 임상 또는 연구 목적.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RosetteSep&#8482; Human NK Cell Enrichment Cocktail</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>15065</td>
			<td>The RosetteSep&#8482; Human NK Cell Enrichment Cocktail is designed to isolate NK cells from whole blood by negative selection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque&#174; PLUS</td>
			<td>GE Healthcare - Life Sciences</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R&#174; CRISPR-Cas9 tracrRNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>1072532</td>
			<td>TracrRNA that contains proprietary chemical modifications conferring increased nuclease resistance. Hybridizes to crRNA to activate the Cas9 enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R&#174; CRISPR-Cas9 crRNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Synthetically produced as Alt-R&#174; CRISPR-Cas9 crRNA, based on the sequence of designed gRNA targeting the gene of intrest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R&#174; Genome Editing Detection Kit</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>1075931</td>
			<td>Each kit contains T7EI endonuclease, T7EI reaction buffer, and T7EI assay controls.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum&#174; Taq DNA Polymerase High Fidelity</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11304-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4D-Nucleofector&#8482; System</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAF-1002B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant IL-2 Protein</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>65483-0116-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P3 Primary Cell 4D-Nucleofector&#8482; X Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>V4XP-3032</td>
			<td>Contains pmaxGFP&#8482; Vector, Nucleofector&#8482; Solution, Supplement, 16-well Nucleocuvette&#8482; Strips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-targeting: Custom siRNA, Standard 0.05 2mol ON-TARGETplus</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>CTM-360019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R&#174; S.p. Cas9 Nuclease 3NLS</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>1074181</td>
			<td>Cas9 Nuclease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy&#174; Blood &#38; Tissue Handbook</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C3099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF&#946;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>580706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R&#174; CRISPR-Cas9 Control Kit, Human</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>1072554</td>
			<td>Includes tracrRNA, HPRT positive control crRNA, negative control crRNA#1, HPRT Primer Mix, and Nuclease-Free Duplex Buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDTE pH 7.5 (1X TE Solution)</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>11-01-02-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R&#174; Cas9 Electroporation Enhancer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>1075915</td>
			<td>Cas9 Electroporation Enhancer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of knock-out primary and expanded human nk cells using cas9 ribonucleoproteins

CRISPR/Cas9 기술 많은 세포 유형, 하지만 지금까지 유전자 배달에 게놈 엔지니어링 가속 되 고 안정적인 유전자 수정 기본 NK 세포에 도전 되었습니다. 예를 들어 transgene 배달 lentiviral 또는 retroviral 변환을 사용 하 여 실질적인 절차 관련 된 NK 세포 apoptosis 때문 NK 세포 유전자 조작의 제한 된 수율 결과. 여기 Cas9 ribonucleoprotein 복합물 (Cas9/RNPs)를 사용 하 여 인간의 기본 및 확장 된 NK 세포의 게놈 편집용 DNA 무료 방법을 설명 합니다. 이 메서드는 TGFBR2 와 의 효율적인 녹아웃 NK 세포에 HPRT1 유전자 허용. RT-PCR 데이터 유전자 식 수준에 중요 한 감소 그리고 대표적인 셀 제품의 세포 독성 분석 실험 제안 RNP 수정 NK 세포 TGFβ에 덜 민감한 되었다. 유전자 변형된 세포 조사 mbIL21 표현 된 자극에 의해 확장 된 게시물 electroporation 수 지류 세포.

Electroporation 효율
Cas9/RNPs의 electroporation 최적화, GFP 비 대상으로 siRNA와 DNA 플라스 미드의 NK 세포로 변환 된 16 가지 프로그램 테스트. 교류 cytometry 분석 결과 엉-138 셀 생존 및 변환 효율 (35% 라이브 GFP 긍정적인 세포) (그림 1 및 그림 2) 두 입자의 높은 비율을 했다 보여주었?...

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Generation of Knock-out Primary and Expanded Human NK Cells Using Cas9 Ribonucleoproteins

여기, 선물이 유전자 Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs)를 사용 하 여 기본 또는 확장 된 인간의 자연 킬러 (NK) 세포를 수정 하는 프로토콜. 이 프로토콜을 사용 하 여 인간 NK 세포 성장 인자-b 수용 체 2를 변형 (TGFBR2) 및 hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1)에 대 한 결핍을 생성 했습니다.

Cas9 Ribonucleoproteins를 사용 하 여 노크 아웃 기본 및 확장 된 인간 NK 세포의 생성

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

확장, 정화, 그리고 사람 말초혈 NK 세포 기능 평가

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

연구

면역학 및 감염병학

Generation of Organotypic Raft Cultures from Primary Human Keratinocytes

기본 인적 Keratinocytes에서 Organotypic 뗏목 문화의 생성

The development of organotypic epithelial raft cultures has provided researchers with an efficient in vitro system that faithfully recapitulates ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve and Memory T Cells

기본 인적 나이브 및 메모리 T의 세포로부터 유도된 규제 T 세포의 생성

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

기본 인간 T 세포 piggyBac Transposon 시스템 변경

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

말초 혈액에서 인간 Alloantigen 특정 T 세포의 생성

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

정렬 된 불멸화 된 B 세포로부터 재조합 인간 IgG 단일 클론 항체의 생성

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

전혈로부터 인간 단핵구 유래 수지상 세포의 생성

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

Dextran Murine 및 인간의 기본 NK 세포의 Lentiviral 변환 효율 향상

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

차세대 일렉트로 차 인간 Th17 세포 작은 RNA 형질

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

인간 NK 세포 활동의 평가 대 한 흐름 Cytometry 기반 세포 독성 분석 실험

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...