Name: generation of knock-out primary and expanded human nk cells using cas9 ribonucleoproteins
Uploaded: 2018-06-14T15:00:00
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Reconhecemos o Brian Tullius por sua gentil ajuda em editar o manuscrito.

Casacos de buffy de doadores saudáveis foram obtidos como fonte de materiais de Central Ohio região Cruz Vermelha americana. Esta pesquisa foi determinada como sendo pesquisa isenta por Review Board Nationwide Hospital infantil da institucional.
1. expansão e purificação de célula NK humana
<ol><li>Isole PBMCs do Buffy Coat12.<ol>
<li>35 mL de amostra de buffy coat em 15 mL de Ficoll-Paque de camada.</li>
		<li>Centrifugar a 400 x g por 20 minutos sem freio e co...

<ol>
	<li>Guven, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+primary+human+natural+killer+cells+by+retroviral+transduction.">Efficient gene transfer into primary human natural killer cells by retroviral transduction.</a> Experimental Hematology. 33 (11), 1320-1328 (2005).</li><li>Alici, E., Sutlu, T., Sirac Dilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+gene+transfer+into+primary+human+natural+killer+cells.">Retroviral gene transfer into primary human natural killer cells.</a> Methods in Molecular Biology. 508, 127-137 (2009).</li><li>Carlsten, M., Childs, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Manipulation+of+NK+Cells+for+Cancer+Immunotherapy:+Techniques+and+Clinical+Implications.">Genetic Manipulation of NK Cells for Cancer Immunotherapy: Techniques and Clinical Implications.</a> Frontiers in Immunology. 6, 266 (2015).</li><li>Mehta, R. S., Rezvani, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+Antigen+Receptor+Expressing+Natural+Killer+Cells+for+the+Immunotherapy+of+Cancer.">Chimeric Antigen Receptor Expressing Natural Killer Cells for the Immunotherapy of Cancer.</a> Frontiers in Immunology. 283, 9 (2018).</li><li>Zuris, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+lipid-mediated+delivery+of+proteins+enables+efficient+protein-based+genome+editing+in+vitro+and+in+vivo.">Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo.</a> Nature Biotechnology. 33 (1), 73-80 (2015).</li><li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+delivery+of+genome-editing+proteins+using+bioreducible+lipid+nanoparticles.">Efficient delivery of genome-editing proteins using bioreducible lipid nanoparticles.</a> PNAS. 113 (11), 2868-2873 (2016).</li><li>Liang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+DNA-free+genome+editing+of+bread+wheat+using+CRISPR/Cas9+ribonucleoprotein+complexes.">Efficient DNA-free genome editing of bread wheat using CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein complexes.</a> Nature Communications. 8, 14261 (2017).</li><li>DeWitt, M. A., Corn, J. E., Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+via+delivery+of+Cas9+ribonucleoprotein.">Genome editing via delivery of Cas9 ribonucleoprotein.</a> Methods. , 9-15 (2017).</li><li>Rezvani, K., Rouce, R., Liu, E., Shpall, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+Natural+Killer+Cells+for+Cancer+Immunotherapy.">Engineering Natural Killer Cells for Cancer Immunotherapy.</a> Molecular Therapy. 25 (8), 1769-1781 (2017).</li><li>Sutlu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+intracellular+antiviral+defense+mechanisms+augments+lentiviral+transduction+of+human+natural+killer+cells:+implications+for+gene+therapy.">Inhibition of intracellular antiviral defense mechanisms augments lentiviral transduction of human natural killer cells: implications for gene therapy.</a> Human Gene Therapy. 23 (10), 1090-1100 (2012).</li><li>Viel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+inhibits+the+activation+and+functions+of+NK+cells+by+repressing+the+mTOR+pathway.">TGF-beta inhibits the activation and functions of NK cells by repressing the mTOR pathway.</a> Science Signaling. 9 (415), (2016).</li><li>Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion,+purification,+and+functional+assessment+of+human+peripheral+blood+NK+cells.">Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells.</a> JoVE. (48), (2011).</li><li>Lee, D. A., Verneris, M. R., Campana, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquisition,+preparation,+and+functional+assessment+of+human+NK+cells+for+adoptive+immunotherapy.">Acquisition, preparation, and functional assessment of human NK cells for adoptive immunotherapy.</a> Methods in Molecular Biology. , 61-77 (2010).</li><li>Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+T7E1+and+surveyor+mismatch+cleavage+assays+to+detect+mutations+triggered+by+engineered+nucleases.">Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases.</a> G3. 5 (3), 407-415 (2015).</li><li>Eyquem, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+a+CAR+to+the+TRAC+locus+with+CRISPR/Cas9+enhances+tumour+rejection.">Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection.</a> Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).</li><li>Liang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+highly+efficient+mammalian+cell+engineering+via+Cas9+protein+transfection.">Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection.</a> Journal of Biotechnology. 208, 44-53 (2015).</li><li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins.">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li><li>Chmielecki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+Profiling+of+a+Large+Set+of+Diverse+Pediatric+Cancers+Identifies+Known+and+Novel+Mutations+across+Tumor+Spectra.">Genomic Profiling of a Large Set of Diverse Pediatric Cancers Identifies Known and Novel Mutations across Tumor Spectra.</a> Cancer Research. 77 (2), 509-519 (2017).</li><li>Schultz, L. M., Majzner, R., Davis, K. L., Mackall, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+developments+in+immunotherapy+for+pediatric+solid+tumors.">New developments in immunotherapy for pediatric solid tumors.</a> Current Opinion in Pediatrics. 30 (1), 30-39 (2018).</li></ol>

Modificação de dependente de DNA das células NK tem sido desafiador4,9. Portanto, introduzimos diretamente um complexo ribonucleoprotein sinteticamente pré-formadas (RNPs) e proteína Cas9 como proteína purificada no de células NK primárias e expandida8. Este método permitiu-na eliminar tampando, seguindo, e outros processos transcricionais e translacionais começaram pela RNA polimerase II, que pode causar apoptose de células NK ...

Imunoterapia tem sido avançada nos últimos anos. As pilhas de T do receptor (carro) de antígeno quimérico geneticamente modificados são um excelente exemplo de células do sistema imunológico engenharia implantado com sucesso em imunoterapia. Estas células foram recentemente aprovadas pelo FDA para o tratamento contra CD19 + B de células malignas, mas sucesso até agora tem sido limitado a doenças tendo alguns antígenos targetable e direcionamento de tais repertórios antigênicos limitados é propenso ao fracasso pela fuga imune. Além disso, as células T de carro foi centraram-se sobre o uso de células autólogas T devido ao risco de enxerto versus doença-- host causada por pilhas de T alogênico. Em contraste, as células NK são capazes de matar alvos de tumor de forma independente de antigénio e não causam GvHD, que os torna um bom candidato para câncer imunoterapia6,7,8,9.
CRISPR/Cas9 tecnologia tem sido usada recentemente em engenharia células do sistema imune, mas geneticamente reprogramar células NK com plasmídeos sempre foi um desafio. Isto foi devido a dificuldades na entrega do transgene em uma maneira dependente de DNA como transdução de Lentivirus e retroviral causando substancial associada a procedimento NK apoptose celular e a produção limitada da engenharia genética de células NK4 , 9.
Muitas células do sistema imune inatas expressam altos níveis de receptores para padrões moleculares associados patógeno como gene induzida em ácido retinoico eu (RIG-eu), que permitem maior reconhecimento de DNA estranho. Supressão destas vias permitiu maior eficiência de transdução em células NK quando usando métodos baseados em DNA por modificação genética10.
Descrevemos aqui o método para usar um genoma DNA livre edição de primárias e expandidas NK células humanas utilizando complexos de ribonucleoprotein Cas9 (Cas9/RNPs). Cas9/RNPs é composto de três componentes, recombinante Cas9 proteína complexada com RNA de single-guia sintético composto de um complexado crRNA e tracerRNA. Estes Cas9/RNPs são capazes de clivagem genômicos alvos com maior eficiência em comparação com abordagens de DNA-dependente estrangeiras devido a sua entrega como complexos funcionais. Além disso, liberação rápida de Cas9/RNPs das células pode reduzir os efeitos de fora do alvo como a indução da apoptose. Assim, eles podem ser usados para gerar nocautes, ou bater-ins quando combinado com o DNA para o recombination homologous6,7. Nós mostramos que eletroporação de Cas9/RNPs é um método fácil e relativamente eficiente que supera as limitações anteriores de modificação genética em células NK.
TGFβ é uma principais citocinas imunossupressoras, que inibe a ativação e funções das células NK. Tem sido sugerido que o direcionamento da via TGFβ pode aumentar funções de células imunes. Escolhemos a região de codificação TGBR2 ectodomínio que vincula TGFβ11. Os resultados representativos mostram uma diminuição significativa no nível de expressão de RNAm de um gene e ainda demonstram que as células NK modificadas se tornam resistentes aos TGFβ. Além disso, as células modificadas mantém viabilidade e potencial proliferativo, como eles são capazes de ser expandido post-electroporation usando células irradiadas alimentador. Portanto, o método a seguir é uma abordagem promissora para manipular geneticamente células NK para qualquer mais clínico ou fins de investigação.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RosetteSep&#8482; Human NK Cell Enrichment Cocktail</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>15065</td>
			<td>The RosetteSep&#8482; Human NK Cell Enrichment Cocktail is designed to isolate NK cells from whole blood by negative selection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque&#174; PLUS</td>
			<td>GE Healthcare - Life Sciences</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R&#174; CRISPR-Cas9 tracrRNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>1072532</td>
			<td>TracrRNA that contains proprietary chemical modifications conferring increased nuclease resistance. Hybridizes to crRNA to activate the Cas9 enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R&#174; CRISPR-Cas9 crRNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Synthetically produced as Alt-R&#174; CRISPR-Cas9 crRNA, based on the sequence of designed gRNA targeting the gene of intrest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R&#174; Genome Editing Detection Kit</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>1075931</td>
			<td>Each kit contains T7EI endonuclease, T7EI reaction buffer, and T7EI assay controls.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum&#174; Taq DNA Polymerase High Fidelity</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11304-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4D-Nucleofector&#8482; System</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAF-1002B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant IL-2 Protein</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>65483-0116-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P3 Primary Cell 4D-Nucleofector&#8482; X Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>V4XP-3032</td>
			<td>Contains pmaxGFP&#8482; Vector, Nucleofector&#8482; Solution, Supplement, 16-well Nucleocuvette&#8482; Strips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-targeting: Custom siRNA, Standard 0.05 2mol ON-TARGETplus</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>CTM-360019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R&#174; S.p. Cas9 Nuclease 3NLS</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>1074181</td>
			<td>Cas9 Nuclease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy&#174; Blood &#38; Tissue Handbook</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C3099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF&#946;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>580706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R&#174; CRISPR-Cas9 Control Kit, Human</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>1072554</td>
			<td>Includes tracrRNA, HPRT positive control crRNA, negative control crRNA#1, HPRT Primer Mix, and Nuclease-Free Duplex Buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDTE pH 7.5 (1X TE Solution)</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>11-01-02-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R&#174; Cas9 Electroporation Enhancer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>1075915</td>
			<td>Cas9 Electroporation Enhancer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of knock-out primary and expanded human nk cells using cas9 ribonucleoproteins

CRISPR/Cas9 tecnologia está acelerando a engenharia do genoma em muitos tipos de células, mas até agora, entrega do gene e modificação genética estável ter sido desafiador no primárias células NK. Por exemplo, entrega de transgene usando transdução Lentivirus ou retroviral resultou em um rendimento limitado de geneticamente modificadas as células NK devido a apoptose celular NK substancial procedimento associado. Descrevemos aqui um método livre de DNA para edição de genoma de células humanas primárias e expandidas NK usando complexos de ribonucleoprotein Cas9 (Cas9/RNPs). Este método permitiu eficiente nocaute do TGFBR2 e HPRT1 de genes em células NK. Dados de RT-PCR mostram uma diminuição significativa no nível de expressão do gene, e um ensaio de citotoxicidade de um produto representativo da célula sugeriu que as células NK RNP-modificado tornou-se menos sensíveis a TGFβ. Células geneticamente modificadas podem ser expandido post-eletroporação por estimulação com mbIL21-expressando irradiado células do alimentador.

Eficiência de eletroporação
Para otimizar a eletroporação de Cas9/RNPs, testamos 16 programas diferentes com transdução de siRNA de direcionamento-GFP e plasmídeo de DNA em células NK. Ensaio de citometria de fluxo mostrou que o pt-138 teve a maior porcentagem de viabilidade e transdução eficiência da célula (35% GFP positivas células vivas) para ambas as partículas (Figura 1</st...

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Generation of Knock-out Primary and Expanded Human NK Cells Using Cas9 Ribonucleoproteins

Aqui, apresentamos um protocolo para modificar geneticamente as células assassinas naturais humano primário ou expandido (NK) usando Cas9 ribonucleoproteínas (Cas9/RNPs). Usando este protocolo, geramos humanas células NK deficientes para transformar o receptor 2 do fator de crescimento – b (TGFBR2) e hipoxantina Fosforibosiltransferase 1 (HPRT1).

Geração de células NK humana primárias e expandida de Knock-out usando ribonucleoproteínas Cas9

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Expansão, Purificação e Avaliação Funcional de Células NK do sangue periférico

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Imunologia e Infecção

Generation of Organotypic Raft Cultures from Primary Human Keratinocytes

Geração de Culturas Raft organotípicas de queratinócitos humanos primários

The development of organotypic epithelial raft cultures has provided researchers with an efficient in vitro system that faithfully recapitulates ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve and Memory T Cells

Geração de Células T reguladoras induzidas a partir de células T humanas primárias Naïve e Memória

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac modificação do sistema Transposon de células T primárias Humanos

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

Geração de Células T humanas alo-específicos a partir de Sangue Periférico

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Geração de IgG Humana Recombinante de Anticorpos Monoclonais As células seleccionadas a partir de B imortalizadas

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Geração de células dendríticas derivadas de monócitos humanos a partir de sangue inteiro

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

Dextran aumenta a eficiência de Lentivirus transdução das células NK primário murino e humano

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

RNA pequeno Transfecção em células primárias Th17 humano por Next Generation electroporação

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Um ensaio de citotoxicidade baseados em citometria de fluxo para a avaliação da atividade das células NK humana

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...