Name: generation of knock-out primary and expanded human nk cells using cas9 ribonucleoproteins
Uploaded: 2018-06-14T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Knock-out Primary and Expanded Human NK Cells Using Cas9 Ribonucleoproteins at JoVE.com

Vi erkänner Brian Tullius för hans vänliga hjälp i redigering manuskriptet.

Friska givare buffy rockar erhölls som källmaterial från Central Ohio regionen amerikanska Röda korset. Denna forskning fastställdes vara undantagna forskning av institutionella i styrelsen av rikstäckande barnsjukhuset.
1. mänskliga NK Cell rening och Expansion
<ol><li>Isolera PBMC från Buffy Coat12.<ol>
<li>Lager 35 mL buffy coat prov på 15 mL Ficoll-Paque.</li>
		<li>Centrifugera 400 x g i 20 minuter utan broms och samla PBMC från gränssnittet.</li>
		<l...

<ol>
	<li>Guven, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+primary+human+natural+killer+cells+by+retroviral+transduction.">Efficient gene transfer into primary human natural killer cells by retroviral transduction.</a> Experimental Hematology. 33 (11), 1320-1328 (2005).</li><li>Alici, E., Sutlu, T., Sirac Dilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+gene+transfer+into+primary+human+natural+killer+cells.">Retroviral gene transfer into primary human natural killer cells.</a> Methods in Molecular Biology. 508, 127-137 (2009).</li><li>Carlsten, M., Childs, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Manipulation+of+NK+Cells+for+Cancer+Immunotherapy:+Techniques+and+Clinical+Implications.">Genetic Manipulation of NK Cells for Cancer Immunotherapy: Techniques and Clinical Implications.</a> Frontiers in Immunology. 6, 266 (2015).</li><li>Mehta, R. S., Rezvani, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+Antigen+Receptor+Expressing+Natural+Killer+Cells+for+the+Immunotherapy+of+Cancer.">Chimeric Antigen Receptor Expressing Natural Killer Cells for the Immunotherapy of Cancer.</a> Frontiers in Immunology. 283, 9 (2018).</li><li>Zuris, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+lipid-mediated+delivery+of+proteins+enables+efficient+protein-based+genome+editing+in+vitro+and+in+vivo.">Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo.</a> Nature Biotechnology. 33 (1), 73-80 (2015).</li><li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+delivery+of+genome-editing+proteins+using+bioreducible+lipid+nanoparticles.">Efficient delivery of genome-editing proteins using bioreducible lipid nanoparticles.</a> PNAS. 113 (11), 2868-2873 (2016).</li><li>Liang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+DNA-free+genome+editing+of+bread+wheat+using+CRISPR/Cas9+ribonucleoprotein+complexes.">Efficient DNA-free genome editing of bread wheat using CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein complexes.</a> Nature Communications. 8, 14261 (2017).</li><li>DeWitt, M. A., Corn, J. E., Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+via+delivery+of+Cas9+ribonucleoprotein.">Genome editing via delivery of Cas9 ribonucleoprotein.</a> Methods. , 9-15 (2017).</li><li>Rezvani, K., Rouce, R., Liu, E., Shpall, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+Natural+Killer+Cells+for+Cancer+Immunotherapy.">Engineering Natural Killer Cells for Cancer Immunotherapy.</a> Molecular Therapy. 25 (8), 1769-1781 (2017).</li><li>Sutlu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+intracellular+antiviral+defense+mechanisms+augments+lentiviral+transduction+of+human+natural+killer+cells:+implications+for+gene+therapy.">Inhibition of intracellular antiviral defense mechanisms augments lentiviral transduction of human natural killer cells: implications for gene therapy.</a> Human Gene Therapy. 23 (10), 1090-1100 (2012).</li><li>Viel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+inhibits+the+activation+and+functions+of+NK+cells+by+repressing+the+mTOR+pathway.">TGF-beta inhibits the activation and functions of NK cells by repressing the mTOR pathway.</a> Science Signaling. 9 (415), (2016).</li><li>Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion,+purification,+and+functional+assessment+of+human+peripheral+blood+NK+cells.">Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells.</a> JoVE. (48), (2011).</li><li>Lee, D. A., Verneris, M. R., Campana, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquisition,+preparation,+and+functional+assessment+of+human+NK+cells+for+adoptive+immunotherapy.">Acquisition, preparation, and functional assessment of human NK cells for adoptive immunotherapy.</a> Methods in Molecular Biology. , 61-77 (2010).</li><li>Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+T7E1+and+surveyor+mismatch+cleavage+assays+to+detect+mutations+triggered+by+engineered+nucleases.">Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases.</a> G3. 5 (3), 407-415 (2015).</li><li>Eyquem, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+a+CAR+to+the+TRAC+locus+with+CRISPR/Cas9+enhances+tumour+rejection.">Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection.</a> Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).</li><li>Liang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+highly+efficient+mammalian+cell+engineering+via+Cas9+protein+transfection.">Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection.</a> Journal of Biotechnology. 208, 44-53 (2015).</li><li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins.">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li><li>Chmielecki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+Profiling+of+a+Large+Set+of+Diverse+Pediatric+Cancers+Identifies+Known+and+Novel+Mutations+across+Tumor+Spectra.">Genomic Profiling of a Large Set of Diverse Pediatric Cancers Identifies Known and Novel Mutations across Tumor Spectra.</a> Cancer Research. 77 (2), 509-519 (2017).</li><li>Schultz, L. M., Majzner, R., Davis, K. L., Mackall, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+developments+in+immunotherapy+for+pediatric+solid+tumors.">New developments in immunotherapy for pediatric solid tumors.</a> Current Opinion in Pediatrics. 30 (1), 30-39 (2018).</li></ol>

DNA-beroende modifiering av NK-celler har utmanande4,9. Vi, därför infört direkt ett syntetiskt förformade ribonukleoprotein (RNPs) komplex och Cas9 protein som renat protein in i primära och utökade NK celler8. Denna metod tillät oss att eliminera tak, förföljer, och andra transkriptionell och translationell processer Startat av RNA-polymeras II, vilket kan orsaka NK cell apoptos är associerad med DNA-beroende transduktion metod...

Immunterapi mot cancer har varit avancerade under de senaste åren. Genetiskt modifierade chimära antigen receptorn (bil) T-celler är ett utmärkt exempel på modifierade immunceller som distribuerats i cancer immunoterapi. Dessa celler har nyligen godkänts av FDA för behandling mot CD19 + B cell maligniteter, men framgången har hittills begränsats till sjukdomar med några targetable antigener, och inriktning på sådan begränsad antigena repertoarer är benägna att misslyckas immun flykten. Dessutom har CAR T-celler varit inriktad på användningen av autologa T-celler på grund av graft - versus - host sjukdom orsakas av allogena T-celler. I kontrast, NK-celler kan döda tumör mål på ett antigen-oberoende sätt och orsakar inte GvHD, vilket gör dem en bra kandidat för cancer immunoterapi6,7,8,9.
CRISPR/Cas9-teknik har använts nyligen i engineering immunceller, men genetiskt omprogrammering NK-celler med plasmider har alltid varit en utmaning. Detta har varit på grund av svårigheter i transgenens leverans på ett DNA beroende sätt såsom lentiviral och retrovirala transduktion orsakar betydande förfarande-associerade NK cell apoptos och begränsad produktion av genmanipulerade NK celler4 , 9.
Många medfödda immunceller uttrycka höga nivåer av receptorer för patogen-associerade molekylära mönster såsom Retinoic acid-inducerbara gen jag (RIG-jag), som gör det möjligt för förhöjd erkännande av främmande DNA. Dämpning av dessa vägar har aktiverat högre transduktion effektivitet i NK-celler när du använder DNA-baserade metoder för genetisk modifiering10.
Här beskriver vi metoden för att använda en DNA-fria gen editering av primära och utökade mänskliga NK celler utnyttja Cas9 ribonukleoprotein komplex (Cas9/RNPs). Cas9/RNPs består av tre komponenter, rekombinanta Cas9 protein komplex med syntetiska singel-guide RNA består av en komplex crRNA och tracerRNA. Dessa Cas9/RNPs klarar av att klyva genomisk mål med högre effektivitet jämfört med utländska DNA-beroende tillvägagångssätt på grund av deras leverans som funktionella komplex. Snabb clearance av Cas9/RNPs från cellerna kan dessutom minska de off-target effekterna såsom induktion av apoptos. De kan således användas för att generera knock-outs eller knock-ins när de kombineras med DNA för homolog rekombination6,7. Vi visade att elektroporation av Cas9/RNPs är en enkel och relativt effektiv metod som övervinner de tidigare begränsningarna av genetisk modifiering i NK-celler.
TGFβ är en större immunsuppressiva cytokin, som hämmar aktivering och funktioner av NK-celler. Det har föreslagits att inriktning TGFβ vägen kan öka immunceller funktioner. Vi riktade regionen kodning TGBR2 ectodomain som binder TGFβ11. De representativa resultat visar en signifikant minskning i nivån av mRNA-uttryck av denna gen och vidare Visa att de modifierade NK-cellerna bli resistenta mot TGFβ. Dessutom behålla modifierade cellerna livskraft och proliferativ potential, eftersom de kan vara utökade post-elektroporation använder bestrålat feeder celler. Därför följande metod är en lovande strategi att genetiskt manipulera NK-celler för någon ytterligare klinisk eller forskningsändamål.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RosetteSep&#8482; Human NK Cell Enrichment Cocktail</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>15065</td>
			<td>The RosetteSep&#8482; Human NK Cell Enrichment Cocktail is designed to isolate NK cells from whole blood by negative selection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque&#174; PLUS</td>
			<td>GE Healthcare - Life Sciences</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R&#174; CRISPR-Cas9 tracrRNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>1072532</td>
			<td>TracrRNA that contains proprietary chemical modifications conferring increased nuclease resistance. Hybridizes to crRNA to activate the Cas9 enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R&#174; CRISPR-Cas9 crRNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Synthetically produced as Alt-R&#174; CRISPR-Cas9 crRNA, based on the sequence of designed gRNA targeting the gene of intrest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R&#174; Genome Editing Detection Kit</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>1075931</td>
			<td>Each kit contains T7EI endonuclease, T7EI reaction buffer, and T7EI assay controls.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum&#174; Taq DNA Polymerase High Fidelity</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11304-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4D-Nucleofector&#8482; System</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAF-1002B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant IL-2 Protein</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>65483-0116-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P3 Primary Cell 4D-Nucleofector&#8482; X Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>V4XP-3032</td>
			<td>Contains pmaxGFP&#8482; Vector, Nucleofector&#8482; Solution, Supplement, 16-well Nucleocuvette&#8482; Strips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-targeting: Custom siRNA, Standard 0.05 2mol ON-TARGETplus</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>CTM-360019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R&#174; S.p. Cas9 Nuclease 3NLS</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>1074181</td>
			<td>Cas9 Nuclease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy&#174; Blood &#38; Tissue Handbook</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C3099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF&#946;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>580706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R&#174; CRISPR-Cas9 Control Kit, Human</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>1072554</td>
			<td>Includes tracrRNA, HPRT positive control crRNA, negative control crRNA#1, HPRT Primer Mix, and Nuclease-Free Duplex Buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDTE pH 7.5 (1X TE Solution)</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>11-01-02-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R&#174; Cas9 Electroporation Enhancer</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>1075915</td>
			<td>Cas9 Electroporation Enhancer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of knock-out primary and expanded human nk cells using cas9 ribonucleoproteins

CRISPR/Cas9 teknik accelererar genomet engineering i många celltyper, men hittills har gen leverans och stabil genmodifiering har varit utmanande i primära NK-celler. Till exempel resulterade transgenens leverans med hjälp av lentiviral eller retrovirala transduktion i en begränsad avkastning av genetiskt manipulerade NK-celler på grund av betydande förfarande-associerade NK cell apoptos. Vi beskriver här en DNA-fri metod för editering av mänskliga primära och utökade NK celler använder Cas9 ribonukleoprotein komplex (Cas9/RNPs). Denna metod får effektiv knockout TGFBR2 och HPRT1 gener i NK-celler. RT-PCR data visade en signifikant minskning i gen uttryck nivå, och en cytotoxicitet analys av en representativ cellen produkt föreslog att RNP-modifierade NK-celler blev mindre känslig för TGFβ. Genetiskt modifierade celler kan vara utökade post-elektroporation genom stimulering med bestrålat mbIL21-uttryckande feeder celler.

Elektroporation effektivitet
För att optimera elektroporation av Cas9/RNPs, testade vi 16 olika program med transduktion GFP icke-targeting siRNA och DNA plasmid i NK celler. Flöde flödescytometri analysen visade att den sv-138 hade den högsta andelen cell livskraft och transduktion effektivitet (35% levande GFP positiva celler) för båda partiklar (figur 1 och <strong class="xfig...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Knock-out Primary and Expanded Human NK Cells Using Cas9 Ribonucleoproteins at JoVE.com

Generation of Knock-out Primary and Expanded Human NK Cells Using Cas9 Ribonucleoproteins

Här presenterar vi ett protokoll för att genetiskt modifiera primär eller utökad mänskliga naturliga mördarceller (NK) celler använder Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs). Med hjälp av detta protokoll, genererade vi mänskliga NK celler bristfällig för omvandla tillväxtfaktor – b receptor 2 (TGFBR2) och hypoxantin phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1).

Generation av Knock-out primära och utökade mänskliga NK-celler använder Cas9 Ribonucleoproteins

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Expansion, rening och Functional Assesment of Human Peripheral Blood NK-celler

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Generation of Organotypic Raft Cultures from Primary Human Keratinocytes

Generering av Organotypiska Raft kulturer från Primary humana keratinocyter

The development of organotypic epithelial raft cultures has provided researchers with an efficient in vitro system that faithfully recapitulates ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve and Memory T Cells

Generering av Inducerade regulatoriska T-celler från primära humana naiva och minne T-celler

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac transposon System Ändring av primära humana T-celler

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

Generering av Human Alloantigen-specifika T-celler från perifert blod

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Framställning av rekombinant human IgG monoklonala antikroppar från Immortaliserade Sorterat B-celler

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Generation av mänskliga monocythärledda dendritiska celler från helblod

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

Dextran effektiviserar Lentiviral transduktion murina och mänskliga primära NK-celler

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

Små RNA transfektion i primära humana Th17 celler genom Next Generation elektroporering

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Ett flöde flödescytometri-baserade cytotoxicitet analys för bedömning av människans NK cellsaktivitet

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...