Name: tick microbiome characterization by next-generation 16s rrna amplicon sequencing
Uploaded: 2018-08-25T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing at JoVE.com

Diese Arbeit wurde unterstützt durch die National Science Foundation vergibt an A.S. (DEB #1427772, 1745411, 1750037).

1. kreuzen Sie Sammlung und Oberfläche Sterilisation
<ol><li>Durch Ziehen einer 1 m2 weiße Tuch über einen Tick-assoziierten Lebensraum, Entfernen von Zecken Zecken an Wirtsarten, oder Aufzucht im Labor15,16Zecken sammeln. Verwenden Sie feine Pinzette, um Zecken zu manipulieren und bei-80 ° c aufbewahren</li>
	<li>Zecken in die einzelnen PCR-Rohre und entfernen Oberflächenverunreinigungen durch Vortexen für 15 s sukzessive mit 500 μL von Wasse...

Sequenzierung der nächsten Generation der 16 s rRNA geworden eine Standardmethode für die mikrobielle Identifizierung und aktiviert die Studie wie Vektor mikrobiome Erreger-Übertragung auswirken. Die hier beschriebene Protokoll beschreibt die Verwendung dieser Methode zu untersuchen, mikrobielle Gemeindeversammlung in I. Pacificus, ein Vektor-Arten für Lyme-Borreliose; Allerdings kann es leicht angewendet werden, um andere Zeckenarten oder Arthropoden Vektor Arten zu studieren.
In...

Das Wiederaufleben und Verbreitung von vektorübertragenen Krankheiten in den letzten Jahrzehnten Bedrohung eine ernsthafte für globale Gesundheit von Mensch und Natur. Wirksame Impfstoffe fehlen für die meisten dieser Krankheiten, und Bemühungen sind durch die komplexe biologische Natur der Vektoren und Vektor-Wirt Interaktionen behindert. Verständnis der Rolle der mikrobielle Wechselwirkungen innerhalb eines Vektors bei der Übertragung der Erreger können für die Entwicklung von neuen Strategien, die diese Herausforderungen umgehen. Insbesondere müssen die Wechselwirkungen zwischen Vektor-assoziierten mikrobielle Kommensalen, Symbionten und Krankheitserreger, genannt das Mikrobiom wichtige Konsequenzen für die Übertragung der Erreger. Überwältigende Beweise jetzt unterstützt diese Behauptung mit Beispiele, die zeigen einer Verbindung zwischen dem Vektor Mikrobiom und Kompetenz für Krankheiten wie Malaria, Zika-Virus und Lyme-Borreliose1,2,3. Allerdings erfordert die Umsetzung dieser Erkenntnisse in Strategien zur Seuchenbekämpfung weit mehr Detailwissen über die Struktur, Funktion und Herkunft der Vektor mikrobiome. Identifizierung und Charakterisierung der mikrobiellen Gemeinschaft unter unterschiedlichen ökologische und experimentellen Bedingungen Vektor bilden einen wichtigen Weg in die Zukunft in diesem Bereich.
Ein Verfahren zur Identifizierung von mikrobiellen Bewohner eines Vektors Erreger erfolgt hier durch die Verwendung von westlichen schwarzen Beinen Zecke, Ixodes Pacificus, eine Vektor-Spezies von der Lyme-Borreliose-Erreger Borrelia Burgdorferi. Während Zecken mehr Arten von menschlichen Krankheitserreger als andere Arthropoden Hafen, ist relativ wenig über die Biologie und Gemeinschaft Ökologie der Tick mikrobiome4bekannt. Es ist offensichtlich, dass Zecken beherbergen eine Vielzahl von Viren, Bakterien, Pilze und Protozoen die Kommensalen, Endosymbionts und transiente mikrobiellen Bewohner5,4enthalten. Vorherige Arbeit hat gezeigt, dass starke Schwankungen der Ixodes mikrobiome Geographie, Spezies, Geschlecht, Lebensphase und Blutmehl Quelle6,7,8zugeordnet. Jedoch die Mechanismen, die diese Variante unbekannt bleiben und detailliertere Untersuchungen über den Ursprung und Montage dieser mikrobiellen Gemeinschaften zu rechtfertigen. Zecken können Mikroben durch vertikale Übertragung erwerben Kontakt mit Gastgebern und Aufnahme aus der Umgebung durch die Luftlöcher, Mund und anal Pore9. Verständnis der Faktoren, die Gestaltung der Ausbildung und Entwicklung der Zecke Mikrobiom, ist speziell der relative Anteil der vertikalen und ökologischen Übertragung, wichtig für das Verständnis der natürlichen Muster und Variationen in tick Microbiome Vielfalt und wie interagieren diese Gemeinschaften während der Übertragung der Erreger, mit möglichen Anwendungen, Krankheit oder Vektor-Steuerung.
Leistungsstarke Molekulare Techniken, wie Next Generation Sequencing, jetzt zur Identifizierung von mikrobieller Gemeinschaften existieren und können eingesetzt werden, um Vektor mikrobiome unter verschiedenen Umwelt- oder experimentellen Bedingungen zu charakterisieren. Vor dem Aufkommen dieser Hochdurchsatz-Sequenzierung Ansätze die Identifizierung von Mikroben stützte sich überwiegend auf Mikroskopie und Kultur. Während Mikroskopie eine schnelle und einfache Technik ist, sind morphologische Methoden zur Identifizierung von Mikroben von Natur aus subjektiv und grob und begrenzt durch geringe Empfindlichkeit und Erkennung10. Kultur-basierte Methoden sind im großen und ganzen für mikrobielle Identifizierung verwendet und können zur Anfälligkeit von Mikroben für Droge-Behandlungen-11zu ermitteln. Allerdings leidet diese Methode auch geringe Empfindlichkeit, wie es hat geschätzt, dass weniger als 2 % der ökologischen Mikroben in einem Labor Einstellung12kultiviert werden können. Histologische Färbung Ansätze sind auch eingesetzt worden, zu erkennen und bestimmte Mikroben innerhalb von Vektoren zu lokalisieren, Untersuchungen von verschiedenen Taxa Ausschüttungen innerhalb der Zecke zu aktivieren und Hypothesen über mikrobielle Wechselwirkungen zu studieren. Allerdings sind Vorkenntnisse der mikrobiellen Identität für die Auswahl der geeigneten Flecken, was diesen Ansatz ungeeignet für mikrobielle Charakterisierung und Identifizierung erforderlich. Darüber hinaus histologische Färbung ist eine sehr zeitaufwendige und mühsame Prozess und skaliert nicht gut für große Probenmengen. Traditionelle Molekulare Ansätze wie Sanger-Sequenzierung sind ähnlich in ihrer Empfindlichkeit und Erkennung von verschiedenen mikrobiellen Gemeinschaften begrenzt.
Sequenzierung der nächsten Generation ermöglicht die schnelle Identifizierung von Mikroben aus einer großen Anzahl von Proben. Das Vorhandensein von standard Markergene und Referenz Datenbanken weitere ermöglicht verbesserte taxonomische Auflösung oft auf die Gattung oder Art. Kleinen Untereinheit ribosomalen RNAs sind häufig verwendet, um dieses Ziel zu erreichen mit 16 s rRNA ist die am häufigsten aufgrund des Vorhandenseins von konservierten und Variable Regionen innerhalb des Gens, so dass für die Erstellung von universellen Primer mit einzigartigen Amplifikate für jede bakterielle Art13,14. Dieser Bericht beschreibt ein Verfahren zur Identifizierung von Taxa in der Zecke Microbiome durch 16 s rRNA Next Generation Sequencing. Dieses Protokoll betont insbesondere die Schritte bei der Vorbereitung von Proben für die Sequenzierung. Mehr Details über die Sequenzierung verallgemeinert und Bioinformatik Schritte vorgesehen sind, da gibt es eine Vielzahl von Plattformen Sequenzierung und Analyse-Programme verfügbar, jeweils mit umfangreicher Dokumentation. Die Machbarkeit dieses Ansatzes Next Generation Sequencing zeigt eine Untersuchung der mikrobiellen Gemeindeversammlung innerhalb eine wichtige Krankheit Vektor zuweisen.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Item</td>
			<td>Name of Material/Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog #</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>DNeasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>Qubit 4 Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q3326</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>NanoDrop 8000 Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-8000-GL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK2501</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>AMPure XP beads</td>
			<td>Agen Court</td>
			<td>A63880&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>Magnetic Rack</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MR02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>TE buffer</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>T0223</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>Nextera Index Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-121-1011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td>KAPA Library Quantification Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>KK4824</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td>MiSeq System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-410-1003</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>MiSeq Reagent Kit v3&#160;</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>MS-102-3001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11</td>
			<td>10 mM Tris-HCl with 0.1% Tween 20</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>T7724</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tick microbiome characterization by next-generation 16s rrna amplicon sequencing

In den letzten Jahrzehnten haben vektorübertragene Krankheiten wieder aufgetaucht und mit alarmierender Rate, wodurch erhebliche Morbidität und Mortalität weltweit ausgebaut. Effektive und allgemein verfügbaren Impfstoffe sind für einen Großteil dieser Erkrankungen erfordern die Entwicklung von neuartigen Krankheit Minderungsstrategien fehlen. Zu diesem Zweck beinhaltet eine vielversprechende Möglichkeit der Seuchenbekämpfung targeting Vektor Mikrobiom, die Gemeinschaft der Mikroben bewohnen den Vektor. Der Vektor Microbiome spielt eine Schlüsselrolle in der Erreger Dynamik und Manipulationen das Mikrobiom zu reduzierten Vektor Fülle oder Erreger-Übertragung für eine Handvoll vektorübertragene Krankheiten geführt haben. Allerdings erfordert die Umsetzung dieser Erkenntnisse in Krankheit Steuer-und Regelanwendungen ein gründliches Verständnis der Vektor mikrobielle Ökologie, historisch durch unzureichende Technologie in diesem Bereich begrenzt. Das Aufkommen der Next Generation Sequencing Ansätze hat schnelle, hochparallele Sequenzierung von verschiedenen mikrobiellen Gemeinschaften ermöglicht. Ausrichtung auf das hoch konserviert 16 s rRNA-gen hat Charakterisierungen von Mikroben in Vektoren unter unterschiedlichen ökologische und experimentellen Bedingungen erleichtert. Diese Technik beinhaltet die Verstärkung der 16 s rRNA-gen, Probe Barcoding über Laden Proben auf einer Durchflusszelle für die Sequenzierung, PCR und Bioinformatik Ansätze Sequenzdaten phylogenetische Informationen übereinstimmen. Art oder Gattung-Ebene Kennung für eine hohe Anzahl von Wiederholungen kann in der Regel durch diesen Ansatz, damit umgehen Herausforderungen mißraten Entdeckung, Auflösung und Ausgabe von traditionellen Kultivierung, Mikroskopie oder histologische Färbung erreicht werden Techniken. Daher ist diese Methode eignet sich gut für die Charakterisierung von Vektor Mikroben unter unterschiedlichen Bedingungen aber kann nicht aktuell informieren über mikrobielle Funktion, Stelle innerhalb des Vektors oder Reaktion auf Antibiotika-Behandlung. Insgesamt ist 16 s Next Generation Sequencing eine leistungsfähige Technik für die Identität und Rolle der Vektor Mikroben in der Dynamik der Krankheit besser zu verstehen.

Insgesamt 42 Zecken aus drei separaten Ei Kupplungen und zwei Umweltexposition Perioden 0 und 2 Wochen im Boden für die Sequenzierung Microbiome verarbeitet wurden. Jeder Behandlungsgruppe, als ein einziges Kupplung und Belichtung Mal enthalten 6-8 Tick Proben zu replizieren. Diese verarbeiteten Tick-Extrakte wurden auf einer nächsten Generation Sequenzer geladen und ergab 12,885,713 gepaart Ende liest Filter übergeben. Waren in diesem Lauf 3 Negativkontrollen aus dem Extraktionsschrit...

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Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

Hier präsentieren wir ein Next Generation Sequencing-Protokoll für die 16 s rRNA-Sequenzierung die Identifizierung und Charakterisierung mikrobieller Gemeinschaften in Vektoren ermöglicht. Bei dieser Methode wird die DNA-Extraktion, Amplifikation und Barcoding der Proben durch PCR, Sequenzierung auf eine-Durchflusszelle und Bioinformatik Sequenzdaten phylogenetische Informationen übereinstimmen.

Tick Microbiome Charakterisierung von Next-Generation-16 s rRNA Amplikons Sequenzierung

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

Fluoreszenz-Mikroskopie Screening und Next-Generation-Sequencing: Nützliche Tools für die Identifizierung von Genen in den Organellen Integrität beteiligt

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Forschung

Biologie

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

Next-Generation-Sequenzierung der ribosomalen 16S-RNA Gene Amplikons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

Gezielte DNA Methylierungsanalyse von Next-Generation-Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Amplification, Next-Generation-Sequenzierung und genomischer DNA Mapping von Retrovirale Integration Seiten

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

Effiziente Nukleinsäure-Extraktion und 16S rRNA Gen-Sequenzierung für bakterielle Gemeinschaft Charakterisierung

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

Guided Protocol for Fecal Microbial Characterization by 16S rRNA-Amplicon Sequencing

Geführte Protokoll für fäkale mikrobielle Charakterisierung von 16 s rRNA-Amplifikate Sequenzierung

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. ...

Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing

Interaktom-Seq: Ein Protokoll zur Domainome Bibliotheksbau, Validierung und Auswahl von Phagen-Display und Next Generation Sequencing

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

Mikrobiota-Analyse mit zweistufiger PCR- und 16S-rRNA-Gensequenzierung der nächsten Generation

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

Detection of Tissue-resident Bacteria in Bladder Biopsies by 16S rRNA Fluorescence In Situ Hybridization

Nachweis von geweberesidenten Bakterien in Blasenbiopsien durch 16S rRNA Fluoreszenz In Situ Hybridisierung

Visualization of the interaction of bacteria with host mucosal surfaces and tissues can provide valuable insight into mechanisms of pathogenesis. While ...

A Magnetic-Bead-Based Mosquito DNA Extraction Protocol for Next-Generation Sequencing

Ein magnetperlenbasiertes Moskito-DNA-Extraktionsprotokoll für die Sequenzierung der nächsten Generation

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high ...