Name: reconstitution of cell-cycle oscillations in microemulsions of cell-free xenopus egg extracts
Uploaded: 2018-09-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts at JoVE.com

ونحن نشكر لو مادلين لتشييد بلازميد مشري سيكورين، لي مان اللفة والن ف ليو للمناقشات حول الجيل الحبرية وجيريمي باء تشانغ وهو كينيث جيمس هاء فيريل الابن لتوفير بناء بروتينات فلورية خضراء-NLS. هذا العمل كان تدعمها "المؤسسة الوطنية للعلوم" (الوظيفي المبكر منحة #1553031)، المعاهد الوطنية للصحة (ميرا #GM119688)، وزمالة أبحاث سلون.

عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة ميشيغان.
1-إعداد مواد لإعادة تشكيل دورة الخلية والكشف
<ol><li>
الجمعية جيبسون الاستنساخ لأغراض تشييد الحمض النووي بلازميد ومرناً تطهير مشري سيكورين
	<ol>
<li>إعداد ثلاث شظايا من ا...

<ol>
	<li>Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+extracts.">Cell cycle extracts.</a> Methods in Cell Biology. 36, 581-605 (1991).</li><li>Hannak, E., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+mitotic+spindle+assembly+and+function+in+vitro+using+Xenopus+laevis+egg+extracts.">Investigating mitotic spindle assembly and function in vitro using Xenopus laevis egg extracts.</a> Nature Protocols. 1, 2305-2314 (2006).</li><li>Murray, A. W., Solomon, M. J., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cyclin+synthesis+and+degradation+in+the+control+of+maturation+promoting+factor+activity.">The role of cyclin synthesis and degradation in the control of maturation promoting factor activity.</a> Nature. 339, 280-286 (1989).</li><li>Yang, Q., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cdk1-APC/C+cell+cycle+oscillator+circuit+functions+as+a+time-delayed,+ultrasensitive+switch.">The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch.</a> Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).</li><li>Chang, J. B., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+trigger+waves+and+the+spatial+coordination+of+the+Xenopus+cell+cycle.">Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle.</a> Nature. 500, 603-607 (2013).</li><li>Trunnell, N. B., Poon, A. C., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitivity+in+the+Regulation+of+Cdc25C+by+Cdk1.">Ultrasensitivity in the Regulation of Cdc25C by Cdk1.</a> Molecular Cell. 41, 263-274 (2011).</li><li>Kim, S. Y., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+competition+as+a+source+of+ultrasensitivity+in+the+inactivation+of+Wee1.">Substrate competition as a source of ultrasensitivity in the inactivation of Wee1.</a> Cell. 128, 1133-1145 (2007).</li><li>Pomerening, J. R., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems-level+dissection+of+the+cell-cycle+oscillator:+bypassing+positive+feedback+produces+damped+oscillations.">Systems-level dissection of the cell-cycle oscillator: bypassing positive feedback produces damped oscillations.</a> Cell. 122, 565-578 (2005).</li><li>Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+a+cell+cycle+oscillator:+hysteresis+and+bistability+in+the+activation+of+Cdc2.">Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2.</a> Nature Cell Biology. 5, 346-351 (2003).</li><li>Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aster+migration+determines+the+length+scale+of+nuclear+separation+in+the+Drosophila+syncytial+embryo.">Aster migration determines the length scale of nuclear separation in the Drosophila syncytial embryo.</a> The Journal of Cell Biology. 197, 887-895 (2012).</li><li>Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+Drosophila+embryo+extract+for+the+study+of+mitosis+ex+vivo.">A single Drosophila embryo extract for the study of mitosis ex vivo.</a> Nature Protocols. 8, 310-324 (2013).</li><li>Tsai, T. Y. C., Theriot, J. A., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+Oscillatory+Dynamics+in+the+Cell+Cycle+of+Early+Xenopus+laevis+Embryos.">Changes in Oscillatory Dynamics in the Cell Cycle of Early Xenopus laevis Embryos.</a> PLoS Biology. 12, e1001788 (2014).</li><li>Chang, J. B., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+trigger+waves+and+the+spatial+coordination+of+the+Xenopus+cell+cycle.">Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle.</a> Nature. 500, 603-607 (2013).</li><li>Yang, Q., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cdk1-APC/C+cell+cycle+oscillator+circuit+functions+as+a+time-delayed,+ultrasensitive+switch.">The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch.</a> Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).</li><li>Kumagai, A., Dunphy, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claspin,+a+novel+protein+required+for+the+activation+of+Chk1+during+a+DNA+replication+checkpoint+response+in+Xenopus+egg+extracts.">Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts.</a> Molecular Cell. 6, 839-849 (2000).</li><li>Chen, R. H., Murray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+spindle+assembly+checkpoint+in+Xenopus+egg+extracts.">Characterization of spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts.</a> Methods in Enzymology. 283, 572-584 (1997).</li><li>Chen, R. H., Waters, J. C., Salmon, E. D., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+spindle+assembly+checkpoint+component+XMAD2+with+unattached+kinetochores.">Association of spindle assembly checkpoint component XMAD2 with unattached kinetochores.</a> Science. 274, 242-246 (1996).</li><li>Minshull, J., Sun, H., Tonks, N. K., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+MAP+kinase-dependent+spindle+assembly+checkpoint+in+Xenopus+egg+extracts.">A MAP kinase-dependent spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts.</a> Cell. 79, 475-486 (1994).</li><li>Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+Volume+Modulates+Spindle+Size+During+Embryogenesis.">Cytoplasmic Volume Modulates Spindle Size During Embryogenesis.</a> Science. 342, 856-860 (2013).</li><li>Hazel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+cytoplasmic+volume+are+sufficient+to+drive+spindle+scaling.">Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling.</a> Science. 342, 853-856 (2013).</li><li>Garibyan, L., Avashia, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+Techniques+Made+Simple:+Polymerase+Chain+Reaction+(PCR).">Research Techniques Made Simple: Polymerase Chain Reaction (PCR).</a> The Journal of Investigative Dermatology. 133, e6 (2013).</li><li>Hecker, K. H., Roux, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+and+low+annealing+temperatures+increase+both+specificity+and+yield+in+touchdown+and+stepdown+PCR.">High and low annealing temperatures increase both specificity and yield in touchdown and stepdown PCR.</a> BioTechniques. 20, 478-485 (1996).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6, 343-345 (2009).</li><li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Plasmid+DNA+into+E.+coli+Using+the+Heat+Shock+Method.">Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method.</a> Journal of Visualized Experiments. 6, e253 (2007).</li><li>Torreilles, S. L., McClure, D. E., Green, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+and+refinement+of+euthanasia+methods+for+Xenopus+laevis.">Evaluation and refinement of euthanasia methods for Xenopus laevis.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48, 512-516 (2009).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+Xenopus+laevis+Testes.">Isolating Xenopus laevis Testes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2007, (2007).</li><li>Showell, C., Conlon, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Egg+Collection+and+In+vitro+Fertilization+of+the+Western+Clawed+Frog+Xenopus+tropicalis.">Egg Collection and In vitro Fertilization of the Western Clawed Frog Xenopus tropicalis.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).</li><li>Wilson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 91, 236-247 (1983).</li><li>Schutze, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+protocol+for+emulsion+polymerase+chain+reaction+and+subsequent+purification.">A streamlined protocol for emulsion polymerase chain reaction and subsequent purification.</a> Analytical Biochemistry. 410, 155-157 (2011).</li><li>Weitz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+in+the+dynamical+behaviour+of+a+compartmentalized+programmable+biochemical+oscillator.">Diversity in the dynamical behaviour of a compartmentalized programmable biochemical oscillator.</a> Nature Chemistry. 6, 295-302 (2014).</li><li>Ho, K. K., Lee, J. W., Durand, G., Majumder, S., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+with+poly(vinyl)+alcohol+surfactant+reduces+double+emulsion-encapsulated+mammalian+cell-free+expression.">Protein aggregation with poly(vinyl) alcohol surfactant reduces double emulsion-encapsulated mammalian cell-free expression.</a> PloS One. 12, e0174689 (2017).</li><li>Nakajima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+circadian+oscillation+of+cyanobacterial+KaiC+phosphorylation+in+vitro.">Reconstitution of circadian oscillation of cyanobacterial KaiC phosphorylation in vitro.</a> Science. 308, 414-415 (2005).</li><li>Guan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+tunable+mitotic+oscillator+in+artificial+cells.">A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells.</a> eLife. 7, (2018).</li></ol>

وقد قدمنا طريقة جديدة لوضع نظام خلية اصطناعية الفائق أن تمكن المختبر في إعادة تشكيل وتتبع ذبذبات دورة الخلية الاكتفاء الذاتي على مستوى خلية واحدة طويلة الأجل. وهناك العديد من الخطوات الحاسمة التي تجعل هذا الأسلوب الناجح. أولاً، الطازج البيض النمو مع نوعية جيدة، بالمقارنة مع الب...

مقتطفات هيولى إعداد من البيض ليفيس النمو تمثل أحد النماذج الأكثر الغالبة لدراسة الكيمياء الحيوية لدورة الخلية، نظراً لكبر حجم بويضات، والتقدم السريع في دورة الخلية، والقدرة على إعادة تشكيل أحداث الانقسامية في المختبر1،2. هذا النظام قد أتاح اكتشاف الأولية وتوصيف آليا لمنظمي دورة الخلية الأساسية مثل مغزل عامل تشجيع النضج (MPF) فضلا عن العمليات الانقسامية المتلقين للمعلومات بما في ذلك الفصل بين الجمعية وكروموسوم1 ،2،3،4،5،،من67،،من89،10، 11. مقتطفات البيض النمو استخدمت أيضا لتشريح مفصل للشبكات التنظيمية لدورة الخلية على مدار الساعة8،،من1213،14 ودراسات عن أضرار الحمض النووي /replication حاجز15 والمغزل التفتلي الجمعية حاجز16،،من1718.
هذه الدراسات من دورات الخلية باستخدام مقتطفات البيض النمو أساسا قد تم استناداً إلى قياسات السائبة. ومع ذلك، فحوصات رد فعل الجملة التقليدية قد تقليد سلوكيات الخلية الحقيقية، نظراً لاختلاف رئيسي في الأبعاد والتقسيم المكاني سوبسيلولار من جزيئات رد فعل. وعلاوة على ذلك، هم عرضه لإعطاء عدد محدود من دورات قبل التخميد بسرعة8قياسات الجزء الأكبر من الأنشطة الانقسامية. هذه العيوب من ردود فعل معظم حالت دون نظام استخراج لتوفير مزيد من فهم الخصائص الديناميكية المعقدة على مدار الساعة ووظائفها. الدراسات التي أجريت مؤخرا قد مغلفة تثبيط الخلايا الخلية الحرة (CSF) القبض على عامل النمو مقتطفات19،20 في أماكن مثل الخلية تعريف الحجم، التي ساعدت في توضيح كيف هو حجم الدوران عن طريق التضمين حجم هيولى. بيد أن هذا النظام في المختبر هو القبض على الطورية من الانقسام الاختزالي الثاني بفعل العوامل القاتلة1ويلزم وجود نظام قادر على ذبذبات المطرد طويل الأجل على مستوى خلية واحدة لإجراء مزيد من التحقيقات لدورة الخلية مذبذب.
دراسة ذبذبات دورة الخلية مع القرار خلية واحدة، وقد وضعنا على نطاق الخلية، النظام الفائق لقياس المتزامن لعدة عمليات متذبذبة الانقسامية مكتفية ذاتيا في ميكرومولسيون الفردية وإعادة تشكيل قطرات. في هذا البروتوكول فيديو مفصلة، نبدي إنشاء نظام التذبذب الانقسامية الاصطناعية بتغليف ليفيس النمو ركوب البيض السيتوبلازم في ميكرومولسيونس بأحجام تتراوح بين 10 إلى 300 ميكرون. وفي هذا النظام، كانت ذبذبات الانقسامية، بما في ذلك التكثيف كروموسوم والتكثيف دي، وانهيار المغلف النووية واصلاحهم، وتدهور والتوليف من ركائز طور الصعود (مثلاً، سيكورين-مشري في هذا البروتوكول) أعيد تشكيلها بنجاح.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="593">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Xenopus laevis frogs</td>
			<td style="width:93px;">Xenopus-I Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">QIAprep spin miniprep kit</td>
			<td style="width:93px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">27104</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">QIAquick PCR Purification Kit (250)</td>
			<td style="width:93px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">28106</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td>
			<td style="width:93px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM1340</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">BL21 (DE3)-T-1 competent cell</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B2935</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Calcium ionophore</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A23187</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B2261</td>
			<td style="width:167px;">Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Trichloro</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">448931</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;">Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl) silane</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:215px;">PFPE-PEG surfactant</td>
			<td style="width:93px;">Ran Biotechnologies</td>
			<td style="width:119px;">008-FluoroSurfactant-2wtH-50G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">GE Healthcare Glutathione Sepharose 4B beads</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">GE17-0756-01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">PD-10 column</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">GE17-0851-01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">VitroCom miniature hollow glass tubing</td>
			<td style="width:93px;">VitroCom</td>
			<td style="width:119px;">5012</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Olympus SZ61 Stereo Microscope</td>
			<td style="width:93px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Olympus IX83 microscope</td>
			<td style="width:93px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Olympus FV1200 confocal microscope</td>
			<td style="width:93px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">NanoDrop spectrophotometer</td>
			<td style="width:93px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:119px;">ND-2000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">0.4 mL Snap-Cap Microtubes</td>
			<td style="width:93px;">E&#38;K Scientific</td>
			<td style="width:119px;">485050-B</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="54" rowspan="2" style="height:55px;width:215px;">&#160;PureLink RNA Mini Kit</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">ThermoFisher&#65288;Ambion&#65289;</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">12183018A</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Fisherbrand Analog Vortex Mixer</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">2215365</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Imaris</td>
			<td style="width:93px;">Bitplane</td>
			<td style="width:119px;">Version 7.3</td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of cell-cycle oscillations in microemulsions of cell-free xenopus egg extracts

المهم قياس ذبذبات على مستوى خلية واحدة في الوقت الحقيقي لكشف آليات الساعات البيولوجية. رغم مقتطفات جل إعداد من البيض ليفيس النمو القوية في تشريح الشبكات الحيوية الكامنة وراء تطور دورة الخلية، قياس متوسط الفرقة عادة ما يؤدي إلى التذبذب ثبط، على الرغم من كل مذبذب الفردية التي لحقت. وهذا نظراً لصعوبة تزامن مثالي بين التذبذب الفردية في الأنظمة البيولوجية صاخبة. لاسترداد ديناميات خلية واحدة المذبذب، قمنا بتطوير نظام المستندة إلى الحبرية خلية اصطناعية التي يمكن إعادة تشكيل دورات الانقسامية في المقصورات الخليوي تشبه تغليف مقتطفات هيولى ركوب البيض ليفيس النمو . هذه الخلايا هيولى فقط بسيط يحمل ذبذبات مستمرة لما يزيد على 30 من دورات. لبناء خلايا أكثر تعقيداً مع نويات، أضفنا الكروماتين الحيوانات المنوية ديميمبراناتيد لتحريك نويات التجميع الذاتي في النظام. لاحظنا تقدم دوري كروموسوم التكثيف/ديكوندينسيشن ونوى يطوق انهيار/الإصلاح، مثل في الخلايا الحقيقية. يشير هذا إلى أن المذبذب الانقسامية وظائف أمانة محرك أقراص متعددة الأحداث الانقسامية المتلقين للمعلومات. ونحن في نفس الوقت تعقب ديناميات مذبذب الانقسامية وعمليات المصب في قطرات الفردية باستخدام مجهر الأسفار الوقت الفاصل بين متعدد القنوات. نظام دورة الخلية الاصطناعية يوفر إطارا الفائق للتلاعب بالكمية وتحليل ذبذبات الانقسامية مع القرار خلية واحدة، مما يرجح أن يوفر معلومات هامة بشأن الآلية التنظيمية ووظائفها على مدار الساعة.

نحن في الشكل 2، يظهر أن هذا البروتوكول وتنتج ذبذبات الانقسامية في خلايا بسيطة، خالية من الأسلحة النووية، فضلا عن خلايا معقدة مع نويات، حيث يدفع المذبذب التناوب الدوري لتشكيل نواة وتشوه. قطرات خالية من الأنوية توليد ذبذبات الانقسامية يصل إلى 30 دورات على م?...

Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts at JoVE.com

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

نقدم وسيلة لتوليد في المختبر مكتفية ذاتيا ذبذبات الانقسامية على مستوى خلية واحدة بتغليف البيض مقتطفات من النمو لإيفيس في ميكرومولسيونس الماء في النفط.

إعادة تشكيل ذبذبات دورة الخلية في ميكرومولسيونس مستخرجات البيض خالية من الخلية النمو

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا النظام، مثل آلية التنظيم خلف الشبكة الميتاوتية والخصائص الديناميكية ووظائف ساعة دورة الخلية. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها ستولد كمية كبيرة من القطرات مع دورات خلايا متعددة في كل منها، مما يوفر لنا إطارًا عالي الإنتاجية للتلاعب الكمي والتحليل. للبدء، تخلص من دفعات من البيض التي لها حدود غير واضحة بين الأعمدة الحيوانية والنيباتية أو بقع بيضاء غير منتظمة فوق أقطاب الحيوانات.بعد ذلك ، حدد دفعة مناسبة من البيض من ضفدع أنثى واحدة ، ونقل البيض إلى منقار 600 ملليلتر. صب فائض من 0.2x MMR العازلة، وإضافة بلطف السيستين في 1x استخراج العازلة إلى البيض. بعد هذا، هز القار بقوة باليد لإزالة المعاطف هلام من البيض.كرر هذا الغسيل ثلاث مرات مع ما مجموعه 800 ملليلتر من العازلة السيستين أو حتى تجمع البيض وتستقر في الجزء السفلي من القارض. بعد إزالة معطف هلام، وغسل البيض أربع مرات في لتر واحد من 0.2x حل MMR. استخدام ماصة زجاجية لالتقاط وتجاهل البيض الذي يتحول الأبيض.صب العازلة MMR من الكواب، وإضافة 200 ملليلتر من محلول ionophore الكالسيوم في البيض. استخدام ماصة زجاجية لتحريك البيض بلطف حتى يتم تنشيطها، وإزالة محلول ionophore الكالسيوم. ترك البيض في محلول ionophore الكالسيوم لفترة طويلة جدا سوف تبدأ المبرمج.نحن حرك البيض لمدة 1.5 دقيقة والتحقق من كفاءة التنشيط. إذا لم يتم تنشيطها، استئناف التحريك، والتحقق أكثر من ذلك حتى يتحقق التنشيط 90٪. بعد أن يستقر البيض في الجزء السفلي من القارض ، تحقق من كفاءة التنشيط.البيض المنشط جيدا لديه ما يقرب من 25٪ من القطب الحيواني و 75٪ من القطب النباتي. بعد ذلك ، اغسل البيض مرتين بحجم إجمالي 50 ملليلتر من مخزن الاستخراج المكمل بمثبطات البروتياز. ثم، نقل بعناية البيض إلى 0.4 ملليلتر المفاجئة كاب microtube.أجهزة الطرد المركزي microtube لمدة 60 ثانية في 200 غرام ثم في 600 غرام لمدة 30 ثانية لحزمة البيض. ثم، استخدم ماصة باستور الزجاج لإزالة العازلة الزائدة على رأس البيض بعد كل خطوة. بعد ذلك، سحق البيض في 15،000 غرام لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية.استخدام شفرة حلاقة لقطع الأنابيب لفصل الطبقات الثلاث من البيض سحقت والحفاظ على السيتوبلازم الخام في الطبقة الوسطى. ثم، نقل السيتوبلازم الخام لتنظيف أنابيب فائقة التركيز. تكملة السيتوبلازم مع مثبطات البروتياز وcytochalasin B في 10 ميكروغرام لكل ملليلتر لكل من.جهاز طرد مركزي السيتوبلازم الخام في 15،000 غرام وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. ثم، استخدم شفرة حلاقة لقطع الأنبوب والحفاظ على السيتوبلازم في الطبقة الوسطى. ضع المستخلصات المعدة حديثًا على الجليد.أولاً، أضف securin-mCherry mRNA إلى المقتطفات المعدة. بعد ذلك، إضافة 200 ميكرولترات من 2٪ PFPE-PEG الفلوروستورفاكانت لاستخراج خليط مرنا. استخدم خلاط دوامة لتوليد قطرات، وضبط سرعة الدوامة ومدتها حسب الحاجة.ثم، فحص بصريا قطرات للتأكد من أنها موحدة في الحجم. باستخدام ماصة 200 ميكرولتر، نقل قطرات عائمة على أعلى وحجم متساو من السطح إلى أنبوب PCR. تراجع أنبوب زجاجي في طبقة قطرات، وانتظر حتى قطرات ملء ما يقرب من 75٪ من الأنبوب.ثم، دفع أنبوب في طبقة السطحي، وملء الأنبوب تماما. بعد ذلك، املأ طبقًا زجاجي القاع بالزيت المعدني. ثم، استخدم ملاقط غرامة لتزج أنبوب قطرة مملوءة في النفط.استخدم ماصة زجاجية لإزالة أي حطام مرئي أو قطرات مسربة. لتجنب حركة وتسرب قطرات، ينبغي أن تكون مغمورة أنبوب زجاجي مليئة قطرات تحت النفط المعدنية بعناية. يمكننا إما دفع الأنبوب على طرفي مع التوازن أو إضافة بضع قطرات من الزيت المعدني على نهايات الأنبوب في وقت واحد أولا.بعد ذلك، استخدم مجهر epifluorescence مجهزة مرحلة xy مزودة بمحركات لتصوير القطرات. سجل مقاطع فيديو الفاصل الزمني في الحقل المشرق وقنوات الفلوريسين متعددة كل ست إلى تسع دقائق حتى تفقد القطرات نشاطها. وباستخدام هذا البروتوكول، تم إنتاج التذبذب الميتوتيك في كل من الخلايا البسيطة الخالية من الأسلحة النووية والخلايا المعقدة ذات النوى.ولدت قطرات خالية من النوى التذبذب الميتو المتعدد يصل إلى 30 دورات غير مختومة على مدى 92 ساعة. كما تم فحص قدرة المذبذب الميتوج على قيادة أحداث مجرى النهر. وقاد المذبذب الميت الذاتي التغيرات في مورفولوجيا المواد النووية التي لوحظت من خلال التغيير المستقل لمراحل دورة الخلية المتميزة.أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر أن العقل الوقت عند جعل استخراج، كما أنها حساسة للوقت، ودائما الحفاظ على البيض واستخراج على الجليد. بعد تطورها، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا النظام لاستكشاف المبادئ الأساسية لخصائص الساعة المعقدة، مثل قابلية التونة والتونة في Xenopus laevis.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

إعادة تشكيل جسيم نووي مع الهستونات الأخت المسمى النظائر-تفاضلي

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

الجهد المشبك فلوروميتري في<em&gt; القيطم</em&gt; البويضات باستخدام الفلورسنت الأحماض الأمينية غير طبيعية

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

تنقية وإعادة تشكيل TRPV1 لتحليل سبيكتروسكوبيك

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

الأسفار خلايا حية تصوير "دورة الخلية الخضري كاملة" من "بكتيريا الاجتماعية" بطيئة النمو إكسانثوس ميكسوكوككوس

Fluorescence live-cell imaging of bacterial cells is a key method in the analysis of the spatial and temporal dynamics of proteins and chromosomes ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

في المختبر إعادة تشكيل التنظيم الذاتي أنماط البروتين في بليرس الدهن المعتمدة

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

دراسة التمثيلات الحمض النووي الريبي للبروتين كيناز المنشط الجيش الملكي النيبالي خلال دورة الخلية الثديية

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

التحديد الكمي المطلق لاستقلاب تخليق البروتين الخالي من الخلايا بواسطة الفصل اللوني السائل للمرحلة المعكوسة

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

إثراء الأنسجة الثديية وأوسيتس زينوبوس مع الكوليسترول

Cholesterol enrichment of mammalian tissues and cells, including Xenopus oocytes used for studying cell function, can be accomplished using a variety of ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

إنتاج البروتينات الخالية من الخلايا للتحليل الوظيفي وتطوير الأجسام المضادة التي تستهدف البروتينات الغشائية

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

موقع محدد ليسين أسيتيل الهستونات لإعادة تشكيل النوكليوسوم باستخدام توسيع الشفرة الوراثية في الإشريكية القولونية

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...