Name: reconstitution of cell-cycle oscillations in microemulsions of cell-free xenopus egg extracts
Uploaded: 2018-09-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts at JoVE.com

Vi takker Madeleine Lu til at konstruere securin mCherry plasmid, Lap mand Lee, Kenneth Ho og Allen P Liu for diskussioner om droplet generation, Jeremy B. Chang og James E. Ferrell Jr nemlig sørger for normal god landbrugspraksis-NLS konstruere. Dette arbejde blev støttet af National Science Foundation (tidlig karriere Grant #1553031), National Institutes of Health (MIRA #GM119688), og en Sloan Research Fellowship.

Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) på University of Michigan.
1. forberedelse af materialer til cellecyklus rekonstitution og påvisning
<ol><li>
Gibson forsamling kloning til plasmid DNA konstruktion og mRNA rensning af securin-mCherry
	<ol>
<li>Forberede tre DNA fragmenter herunder pMTB2 vektor rygraden, securin og mCherry gennem Polymerasekædereaktionen (PCR) og gel rensning21,...

<ol>
	<li>Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+extracts.">Cell cycle extracts.</a> Methods in Cell Biology. 36, 581-605 (1991).</li><li>Hannak, E., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+mitotic+spindle+assembly+and+function+in+vitro+using+Xenopus+laevis+egg+extracts.">Investigating mitotic spindle assembly and function in vitro using Xenopus laevis egg extracts.</a> Nature Protocols. 1, 2305-2314 (2006).</li><li>Murray, A. W., Solomon, M. J., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cyclin+synthesis+and+degradation+in+the+control+of+maturation+promoting+factor+activity.">The role of cyclin synthesis and degradation in the control of maturation promoting factor activity.</a> Nature. 339, 280-286 (1989).</li><li>Yang, Q., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cdk1-APC/C+cell+cycle+oscillator+circuit+functions+as+a+time-delayed,+ultrasensitive+switch.">The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch.</a> Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).</li><li>Chang, J. B., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+trigger+waves+and+the+spatial+coordination+of+the+Xenopus+cell+cycle.">Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle.</a> Nature. 500, 603-607 (2013).</li><li>Trunnell, N. B., Poon, A. C., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitivity+in+the+Regulation+of+Cdc25C+by+Cdk1.">Ultrasensitivity in the Regulation of Cdc25C by Cdk1.</a> Molecular Cell. 41, 263-274 (2011).</li><li>Kim, S. Y., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+competition+as+a+source+of+ultrasensitivity+in+the+inactivation+of+Wee1.">Substrate competition as a source of ultrasensitivity in the inactivation of Wee1.</a> Cell. 128, 1133-1145 (2007).</li><li>Pomerening, J. R., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems-level+dissection+of+the+cell-cycle+oscillator:+bypassing+positive+feedback+produces+damped+oscillations.">Systems-level dissection of the cell-cycle oscillator: bypassing positive feedback produces damped oscillations.</a> Cell. 122, 565-578 (2005).</li><li>Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+a+cell+cycle+oscillator:+hysteresis+and+bistability+in+the+activation+of+Cdc2.">Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2.</a> Nature Cell Biology. 5, 346-351 (2003).</li><li>Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aster+migration+determines+the+length+scale+of+nuclear+separation+in+the+Drosophila+syncytial+embryo.">Aster migration determines the length scale of nuclear separation in the Drosophila syncytial embryo.</a> The Journal of Cell Biology. 197, 887-895 (2012).</li><li>Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+Drosophila+embryo+extract+for+the+study+of+mitosis+ex+vivo.">A single Drosophila embryo extract for the study of mitosis ex vivo.</a> Nature Protocols. 8, 310-324 (2013).</li><li>Tsai, T. Y. C., Theriot, J. A., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+Oscillatory+Dynamics+in+the+Cell+Cycle+of+Early+Xenopus+laevis+Embryos.">Changes in Oscillatory Dynamics in the Cell Cycle of Early Xenopus laevis Embryos.</a> PLoS Biology. 12, e1001788 (2014).</li><li>Chang, J. B., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+trigger+waves+and+the+spatial+coordination+of+the+Xenopus+cell+cycle.">Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle.</a> Nature. 500, 603-607 (2013).</li><li>Yang, Q., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cdk1-APC/C+cell+cycle+oscillator+circuit+functions+as+a+time-delayed,+ultrasensitive+switch.">The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch.</a> Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).</li><li>Kumagai, A., Dunphy, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claspin,+a+novel+protein+required+for+the+activation+of+Chk1+during+a+DNA+replication+checkpoint+response+in+Xenopus+egg+extracts.">Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts.</a> Molecular Cell. 6, 839-849 (2000).</li><li>Chen, R. H., Murray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+spindle+assembly+checkpoint+in+Xenopus+egg+extracts.">Characterization of spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts.</a> Methods in Enzymology. 283, 572-584 (1997).</li><li>Chen, R. H., Waters, J. C., Salmon, E. D., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+spindle+assembly+checkpoint+component+XMAD2+with+unattached+kinetochores.">Association of spindle assembly checkpoint component XMAD2 with unattached kinetochores.</a> Science. 274, 242-246 (1996).</li><li>Minshull, J., Sun, H., Tonks, N. K., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+MAP+kinase-dependent+spindle+assembly+checkpoint+in+Xenopus+egg+extracts.">A MAP kinase-dependent spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts.</a> Cell. 79, 475-486 (1994).</li><li>Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+Volume+Modulates+Spindle+Size+During+Embryogenesis.">Cytoplasmic Volume Modulates Spindle Size During Embryogenesis.</a> Science. 342, 856-860 (2013).</li><li>Hazel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+cytoplasmic+volume+are+sufficient+to+drive+spindle+scaling.">Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling.</a> Science. 342, 853-856 (2013).</li><li>Garibyan, L., Avashia, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+Techniques+Made+Simple:+Polymerase+Chain+Reaction+(PCR).">Research Techniques Made Simple: Polymerase Chain Reaction (PCR).</a> The Journal of Investigative Dermatology. 133, e6 (2013).</li><li>Hecker, K. H., Roux, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+and+low+annealing+temperatures+increase+both+specificity+and+yield+in+touchdown+and+stepdown+PCR.">High and low annealing temperatures increase both specificity and yield in touchdown and stepdown PCR.</a> BioTechniques. 20, 478-485 (1996).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6, 343-345 (2009).</li><li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Plasmid+DNA+into+E.+coli+Using+the+Heat+Shock+Method.">Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method.</a> Journal of Visualized Experiments. 6, e253 (2007).</li><li>Torreilles, S. L., McClure, D. E., Green, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+and+refinement+of+euthanasia+methods+for+Xenopus+laevis.">Evaluation and refinement of euthanasia methods for Xenopus laevis.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48, 512-516 (2009).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+Xenopus+laevis+Testes.">Isolating Xenopus laevis Testes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2007, (2007).</li><li>Showell, C., Conlon, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Egg+Collection+and+In+vitro+Fertilization+of+the+Western+Clawed+Frog+Xenopus+tropicalis.">Egg Collection and In vitro Fertilization of the Western Clawed Frog Xenopus tropicalis.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).</li><li>Wilson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 91, 236-247 (1983).</li><li>Schutze, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+protocol+for+emulsion+polymerase+chain+reaction+and+subsequent+purification.">A streamlined protocol for emulsion polymerase chain reaction and subsequent purification.</a> Analytical Biochemistry. 410, 155-157 (2011).</li><li>Weitz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+in+the+dynamical+behaviour+of+a+compartmentalized+programmable+biochemical+oscillator.">Diversity in the dynamical behaviour of a compartmentalized programmable biochemical oscillator.</a> Nature Chemistry. 6, 295-302 (2014).</li><li>Ho, K. K., Lee, J. W., Durand, G., Majumder, S., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+with+poly(vinyl)+alcohol+surfactant+reduces+double+emulsion-encapsulated+mammalian+cell-free+expression.">Protein aggregation with poly(vinyl) alcohol surfactant reduces double emulsion-encapsulated mammalian cell-free expression.</a> PloS One. 12, e0174689 (2017).</li><li>Nakajima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+circadian+oscillation+of+cyanobacterial+KaiC+phosphorylation+in+vitro.">Reconstitution of circadian oscillation of cyanobacterial KaiC phosphorylation in vitro.</a> Science. 308, 414-415 (2005).</li><li>Guan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+tunable+mitotic+oscillator+in+artificial+cells.">A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells.</a> eLife. 7, (2018).</li></ol>

Vi har forelagt en roman metode til at udvikle en høj overførselshastighed kunstige celle system, der gør det muligt for in vitro rekonstitution og langsigtede sporing af selvbærende cellecyklus svingninger på én celle-niveau. Der er flere kritiske trin, der gør denne metode lykkes. Første, friskpresset Xenopus æg med en god kvalitet, sammenlignet med lagt æg, tendens til at producere ekstrakter med længerevarende svingning aktivitet. Andet, indkapsling af ekstrakter inden for de overfladeakt...

Cytoplasmatisk ekstrakter forberedt fra Xenopus laevis æg repræsenterer en af de mest fremherskende modeller for biokemiske studier af celle cyklusser, givet den store mængde af oocytter, hurtig cellecyklus progression og evnen til at retablere mitotiske begivenheder in vitro-1,2. Dette system har tilladt første opdagelse og mekanistiske karakterisering af væsentlige cellecyklus lovgivere som fremme af modning faktor (MPF) samt downstream mitotiske processer herunder spindel forsamling og kromosom adskillelse1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11. Xenopus æg ekstrakter har også været brugt til detaljerede dissektion af de regulerende net af cellecyklus ur8,12,13,14 og for studier af DNA-skader /Replication checkpoint15 og mitotiske spindel forsamling checkpoint16,17,18.
Disse undersøgelser af celle cyklusser ved hjælp af Xenopus æg ekstrakter har primært været baseret på bulk målinger. Konventionelle bulk reaktion assays kan dog ikke efterligne virkelige celle adfærd, givet en større afvigelse i deres dimensioner og subcellulært rumlig opdeling af reaktion molekyler. Derudover er bulk målinger af mitotiske aktiviteter tilbøjelige til at give et begrænset antal cyklusser før hurtigt dæmpning8. Disse ulemper af bulk reaktioner har forhindret ekstrakt system for at give yderligere forståelse af komplekse ur dynamiske egenskaber og funktioner. Nylige undersøgelser har indkapslet celle-fri cytostatiske faktor-anholdt (CSF) Xenopus ekstrakter19,20 i størrelse-defineret celle-lignende rum, som har bidraget til at belyse hvordan spindel størrelse moduleres af den cytoplasmatisk volumen. Men denne i vitro system er anholdt på metafase af meiose II ved hjælp af cytostatiske faktor1, og et system i stand til at langsigtede vedvarende svingninger på én celle-plan er behov for yderligere undersøgelser af cellecyklus oscillator.
For at studere cellecyklus svingninger med enkelt-celle opløsning, har vi udviklet en celle-skala, høj overførselshastighed system til rekonstitution og samtidig måling af flere selvbærende mitotiske oscillerende processer i individuelle microemulsion dråber. I denne detaljerede video protokol viser vi skabelsen af kunstige mitotiske oscillation system af indkapsling cykling Xenopus laevis æg cytoplasma i microemulsions af størrelser spænder fra 10 til 300 µm. I dette system blev mitotiske svingninger herunder kromosom kondens og nedtrapning kondens, nukleare kuvert opdeling og reformationen, og nedbrydning og syntese af anaphase substrater (f.eks. securin mCherry i denne protokol) med held rekonstitueres.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="593">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Xenopus laevis frogs</td>
			<td style="width:93px;">Xenopus-I Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">QIAprep spin miniprep kit</td>
			<td style="width:93px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">27104</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">QIAquick PCR Purification Kit (250)</td>
			<td style="width:93px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">28106</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td>
			<td style="width:93px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM1340</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">BL21 (DE3)-T-1 competent cell</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B2935</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Calcium ionophore</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A23187</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B2261</td>
			<td style="width:167px;">Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Trichloro</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">448931</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;">Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl) silane</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:215px;">PFPE-PEG surfactant</td>
			<td style="width:93px;">Ran Biotechnologies</td>
			<td style="width:119px;">008-FluoroSurfactant-2wtH-50G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">GE Healthcare Glutathione Sepharose 4B beads</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">GE17-0756-01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">PD-10 column</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">GE17-0851-01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">VitroCom miniature hollow glass tubing</td>
			<td style="width:93px;">VitroCom</td>
			<td style="width:119px;">5012</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Olympus SZ61 Stereo Microscope</td>
			<td style="width:93px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Olympus IX83 microscope</td>
			<td style="width:93px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Olympus FV1200 confocal microscope</td>
			<td style="width:93px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">NanoDrop spectrophotometer</td>
			<td style="width:93px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:119px;">ND-2000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">0.4 mL Snap-Cap Microtubes</td>
			<td style="width:93px;">E&#38;K Scientific</td>
			<td style="width:119px;">485050-B</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="54" rowspan="2" style="height:55px;width:215px;">&#160;PureLink RNA Mini Kit</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">ThermoFisher&#65288;Ambion&#65289;</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">12183018A</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Fisherbrand Analog Vortex Mixer</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">2215365</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Imaris</td>
			<td style="width:93px;">Bitplane</td>
			<td style="width:119px;">Version 7.3</td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of cell-cycle oscillations in microemulsions of cell-free xenopus egg extracts

Real-time målinger af svingninger på én celle-niveau er vigtig at afdække mekanismer i biologiske ure. Selv om bulk ekstrakter forberedt fra Xenopus laevis æg har været magtfulde i dissekere biokemiske netværk bag cellecyklus progression, fører deres ensemble gennemsnit måling typisk til en dæmpet svingning, trods hver enkelte oscillator opretholdes. Dette er på grund af vanskeligheden ved perfekt synkronisering mellem individuelle oscillatorer i støjende biologiske systemer. For at hente den encellede dynamics af oscillatoren, udviklede vi en droplet-baserede kunstige celle system, der kan rekonstruere mitotiske cyklusser i celle-lignende rum indkapsling cykling cytoplasmatisk ekstrakter af Xenopus laevis æg. Disse enkle cytoplasmatisk-kun celler udviser vedvarende svingninger til over 30 cykler. For at bygge mere komplicerede celler med kerner, tilføjet vi demembranated sperm kromatin for at udløse kerner samlesæt i systemet. Vi observerede en periodisk progression af kromosom kondens/decondensation og kerner indhylle opdeling/reformation, ligesom i rigtige celler. Dette indikerer, at den mitotiske oscillator fungerer loyalt for at drive flere downstream mitotiske begivenheder. Vi spores samtidig dynamikken i den mitotiske oscillator og downstream processer i enkelte dråber ved hjælp af multi-kanal time-lapse Fluorescens mikroskopi. Kunstige cellecyklus system giver en høj overførselshastighed ramme for kvantitative manipulation og analyse af mitotiske svingninger med enkelt-celle opløsning, som sandsynligvis giver vigtig indsigt i de lovgivningsmæssige maskiner og funktioner i uret.

I figur 2viser vi, at denne protokol producerer mitotiske svingninger i både enkle, atomfrit celler samt kompliceret celler med kerner, hvor oscillatoren drev cyklisk skiftevis kerner dannelse og deformation. Fri for kerner dråber generere mitotiske svingninger op til 30 undamped cykler over tidsrum 92 timer, som fremgår af de periodiske syntese og nedbrydning af et fluorescens reporter securin-mCherry (figur 2A). Securin er e...

Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts at JoVE.com

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Vi præsenterer en metode for generation af in vitro- selvbærende mitotiske svingninger på én celle niveau af indkapsling æg ekstrakter af Xenopus laevis i vand-i-olie microemulsions.

Rekonstituering af cellecyklus svingninger i Microemulsions af celle-fri Xenopus æg uddrag

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål inden for systembiologi, såsom reguleringsmekanismen bag mitotisk netværk og de dynamiske egenskaber og funktioner i cellecyklusuret. Den største fordel ved denne teknik er, at det vil generere en stor mængde dråber med flere cellecyklusser i hver, hvilket giver os en høj gennemløbsramme for kvantitativ manipulation og analyse. Til at begynde, kassere partier af æg, der har uklare grænser mellem dyr og vegetal poler eller uregelmæssige hvide pletter på toppen af dyrepæle.Vælg derefter et passende parti æg fra en hunfrø, og overfør æggene til et 600 milliliterbæger. Hæld et overskud på 0,2 x MMR buffer, og tilsæt forsigtigt cystein i 1x ekstrakt buffer til æggene. Derefter rystes bægerglasset kraftigt i hånden for at fjerne æggenes geléfrakker.Denne vask gentages tre gange med i alt 800 milliliter cysteinbuffer eller indtil æggene samles og afregnes i bunden af bægeret. Når geléfrakket er fjernet, vaskes æggene fire gange i en liter 0,2 x MMR-opløsning. Brug en glaspipette til at samle de æg op, der bliver hvide.Hæld MMR buffer ud af bægeret, og tilsæt 200 milliliter calcium ionophore opløsning i æggene. Brug en glaspipette til at røre æggene forsigtigt, indtil de er aktiveret, og fjern calciumionophore opløsningen. Forlader æggene i calcium ionophore opløsning for længe vil indlede apoptose.Vi rører æggene i 1,5 minutter og kontrollerer aktiveringseffektiviteten. Hvis de ikke aktiveres, skal du genoptage omrøringen og kontrollere hyppigere, indtil der opnås 90 %aktivering. Når æggene har lagt sig i bunden af bægeret, skal du kontrollere aktiveringseffektiviteten.Godt aktiverede æg har ca. 25% af dyrestangen og 75% af vegetalstangen. Dernæst vaskes æggene to gange med et samlet volumen på 50 milliliter ekstraktbuffer suppleret med proteasehæmmere. Derefter forsigtigt overføre æggene til en 0,4-milliliter snap-cap mikrorør.Centrifuge mikrorøret i 60 sekunder ved 200 g og derefter ved 600 g i 30 sekunder for at pakke æggene. Brug derefter et glas Pasteur pipette til at fjerne den overskydende buffer oven på æggene efter hvert trin. Efter dette, knuse æggene på 15, 000 g i 10 minutter ved fire grader Celsius.Brug et barberblad til at skære rørene til at adskille de tre lag af knuste æg og holde den rå cytoplasma i det midterste lag. Derefter overføres den rå cytoplasma til at rense ultracentrifuge rør. Tillæg cytoplasmaet med proteasehæmmere og cytochalasin B ved 10 mikrogram pr. milliliter hver.Centrifuge den rå cytoplasma ved 15, 000 g og fire grader Celsius i fem minutter. Brug derefter et barberblad til at skære røret og holde cytoplasmaet i det midterste lag. Læg de frisklavede ekstrakter på is.Først tilsættes securin-mCherry mRNA til de forberedte ekstrakter. Dernæst tilsættes 200 mikroliter af 2% PFPE-PEG fluorosurfactant til ekstrakt mRNA blandingen. Brug en vortex mixer til at generere dråber, justere vortex hastighed og varighed efter behov.Derefter inspiceres dråberne visuelt for at sikre, at de er ensartede i størrelse. Ved hjælp af en pipette på 200 mikroliter overføres dråberne, der flyder ovenfra, og et tilsvarende volumen af overfladeaktivt stof til et PCR-rør. Dyp et glasrør i dråbelaget, og vent, indtil dråberne fylder ca. 75% af røret.Skub derefter røret ind i overfladeaktive lag, og fyld røret helt. Dernæst fylde en glasbundet skål med mineralsk olie. Brug derefter fine pincet til at nedsænke dråbefyldte rør i olien.Brug en glaspipette til at fjerne synlige snavs eller lækkede dråber. For at undgå bevægelse og lækage af dråber, glasrøret fyldt med dråber bør nedsænkes under mineralsk olie omhyggeligt. Vi kan enten skubbe røret i begge ender med balance eller tilføje et par dråber mineralsk olie på enderne af røret samtidig først.Efter dette, skal du bruge en epifluorescens mikroskop udstyret med en motoriseret xy fase til at billedet dråberne. Optag time-lapse videoer i det lyse felt og flere fluorescens kanaler hver seks til ni minutter, indtil dråberne mister deres aktivitet. Ved hjælp af denne protokol blev der produceret mitotiske svingninger i både enkle, atomfrie celler og komplicerede celler med kerner.De kernefri dråber genererede mitotisk svingning op til 30 uforstærkede cyklusser over 92 timer. Det blev også undersøgt, om mitotisk oscillator kunne køre nedstrøms. Den selvbærende mitotiske oscillator drev ændringer af nuklear morfologi observeret gennem den autonome ændring af forskellige celle-cyklus faser.Mens du forsøger denne procedure, er det vigtigt at huske på det tidspunkt, når du foretager ekstraktet, da det er tidsfølsomme, og altid holde æg og ekstrakt på is. Efter sin udvikling banede denne teknik vejen for forskere inden for systembiologi til at udforske grundlæggende principper for komplekse uregenskaber, som tunerbarhed og stokasticitet i Xenopus laevis.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Rekonstituering af nucleosomer med differentielt isotopmærkede Sister Histoner

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Spændingsklemme Fluorometri i<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocytter ved hjælp af fluorescerende unaturlige aminosyrer

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Rensning og rekonstituering af TRPV1 for spektroskopisk analyse

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Fluorescens Live-celle billeddannelse af den komplette Vegetative cellecyklus Slow-voksende sociale bakterien Myxococcus xanthus

Fluorescence live-cell imaging of bacterial cells is a key method in the analysis of the spatial and temporal dynamics of proteins and chromosomes ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Rekonstituering af selvstændige organisering Protein mønstre på understøttede Lipid dobbeltlag

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

At studere RNA Interactors af Protein Kinase RNA-aktiveret under pattedyr cellecyklus

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Absolut kvantificering af celle frit protein syntese metabolisme ved omvendt fase-væskekromatografi-massespektrometri

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Berigelse af pattedyrvæv og Xenopus Oocytter med kolesterol

Cholesterol enrichment of mammalian tissues and cells, including Xenopus oocytes used for studying cell function, can be accomplished using a variety of ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Cellefri produktion af proteoliposomer til funktionel analyse og antistofudvikling rettet mod membranproteiner

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Specifik lysin acetylering af Histoner for nukleosom rekonstitution ved hjælp af genetisk kode ekspansion i Escherichia coli

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...