Name: reconstitution of cell-cycle oscillations in microemulsions of cell-free xenopus egg extracts
Uploaded: 2018-09-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts at JoVE.com

Wij danken Madeleine Lu voor de bouw van securin-mCherry plasmide, schoot Man Lee, Kenneth Ho en Allen P Liu voor discussies over druppel generatie, Jeremy B. Chang en James E. Ferrell Jr voor het verstrekken van DAT GFP-NLS construeren. Dit werk werd gesteund door de National Science Foundation (vroege carrière Grant #1553031), de National Institutes of Health (MIRA #GM119688), en een Sloan Research Fellowship.

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Universiteit van Michigan.
1. bereiding van materialen voor celcyclus reconstitutie en detectie
<ol><li>
Gibson vergadering klonen van de plasmide DNA bouw en mRNA zuivering van securin-mCherry
	<ol>
<li>Bereiden van drie DNA-fragmenten met inbegrip van een pMTB2 vector ruggengraat, securin en mCherry via de Kettingreactie van de polymerase (PCR) en ...

<ol>
	<li>Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+extracts.">Cell cycle extracts.</a> Methods in Cell Biology. 36, 581-605 (1991).</li><li>Hannak, E., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+mitotic+spindle+assembly+and+function+in+vitro+using+Xenopus+laevis+egg+extracts.">Investigating mitotic spindle assembly and function in vitro using Xenopus laevis egg extracts.</a> Nature Protocols. 1, 2305-2314 (2006).</li><li>Murray, A. W., Solomon, M. J., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cyclin+synthesis+and+degradation+in+the+control+of+maturation+promoting+factor+activity.">The role of cyclin synthesis and degradation in the control of maturation promoting factor activity.</a> Nature. 339, 280-286 (1989).</li><li>Yang, Q., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cdk1-APC/C+cell+cycle+oscillator+circuit+functions+as+a+time-delayed,+ultrasensitive+switch.">The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch.</a> Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).</li><li>Chang, J. B., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+trigger+waves+and+the+spatial+coordination+of+the+Xenopus+cell+cycle.">Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle.</a> Nature. 500, 603-607 (2013).</li><li>Trunnell, N. B., Poon, A. C., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitivity+in+the+Regulation+of+Cdc25C+by+Cdk1.">Ultrasensitivity in the Regulation of Cdc25C by Cdk1.</a> Molecular Cell. 41, 263-274 (2011).</li><li>Kim, S. Y., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+competition+as+a+source+of+ultrasensitivity+in+the+inactivation+of+Wee1.">Substrate competition as a source of ultrasensitivity in the inactivation of Wee1.</a> Cell. 128, 1133-1145 (2007).</li><li>Pomerening, J. R., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems-level+dissection+of+the+cell-cycle+oscillator:+bypassing+positive+feedback+produces+damped+oscillations.">Systems-level dissection of the cell-cycle oscillator: bypassing positive feedback produces damped oscillations.</a> Cell. 122, 565-578 (2005).</li><li>Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+a+cell+cycle+oscillator:+hysteresis+and+bistability+in+the+activation+of+Cdc2.">Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2.</a> Nature Cell Biology. 5, 346-351 (2003).</li><li>Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aster+migration+determines+the+length+scale+of+nuclear+separation+in+the+Drosophila+syncytial+embryo.">Aster migration determines the length scale of nuclear separation in the Drosophila syncytial embryo.</a> The Journal of Cell Biology. 197, 887-895 (2012).</li><li>Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+Drosophila+embryo+extract+for+the+study+of+mitosis+ex+vivo.">A single Drosophila embryo extract for the study of mitosis ex vivo.</a> Nature Protocols. 8, 310-324 (2013).</li><li>Tsai, T. Y. C., Theriot, J. A., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+Oscillatory+Dynamics+in+the+Cell+Cycle+of+Early+Xenopus+laevis+Embryos.">Changes in Oscillatory Dynamics in the Cell Cycle of Early Xenopus laevis Embryos.</a> PLoS Biology. 12, e1001788 (2014).</li><li>Chang, J. B., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+trigger+waves+and+the+spatial+coordination+of+the+Xenopus+cell+cycle.">Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle.</a> Nature. 500, 603-607 (2013).</li><li>Yang, Q., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cdk1-APC/C+cell+cycle+oscillator+circuit+functions+as+a+time-delayed,+ultrasensitive+switch.">The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch.</a> Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).</li><li>Kumagai, A., Dunphy, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claspin,+a+novel+protein+required+for+the+activation+of+Chk1+during+a+DNA+replication+checkpoint+response+in+Xenopus+egg+extracts.">Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts.</a> Molecular Cell. 6, 839-849 (2000).</li><li>Chen, R. H., Murray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+spindle+assembly+checkpoint+in+Xenopus+egg+extracts.">Characterization of spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts.</a> Methods in Enzymology. 283, 572-584 (1997).</li><li>Chen, R. H., Waters, J. C., Salmon, E. D., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+spindle+assembly+checkpoint+component+XMAD2+with+unattached+kinetochores.">Association of spindle assembly checkpoint component XMAD2 with unattached kinetochores.</a> Science. 274, 242-246 (1996).</li><li>Minshull, J., Sun, H., Tonks, N. K., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+MAP+kinase-dependent+spindle+assembly+checkpoint+in+Xenopus+egg+extracts.">A MAP kinase-dependent spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts.</a> Cell. 79, 475-486 (1994).</li><li>Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+Volume+Modulates+Spindle+Size+During+Embryogenesis.">Cytoplasmic Volume Modulates Spindle Size During Embryogenesis.</a> Science. 342, 856-860 (2013).</li><li>Hazel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+cytoplasmic+volume+are+sufficient+to+drive+spindle+scaling.">Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling.</a> Science. 342, 853-856 (2013).</li><li>Garibyan, L., Avashia, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+Techniques+Made+Simple:+Polymerase+Chain+Reaction+(PCR).">Research Techniques Made Simple: Polymerase Chain Reaction (PCR).</a> The Journal of Investigative Dermatology. 133, e6 (2013).</li><li>Hecker, K. H., Roux, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+and+low+annealing+temperatures+increase+both+specificity+and+yield+in+touchdown+and+stepdown+PCR.">High and low annealing temperatures increase both specificity and yield in touchdown and stepdown PCR.</a> BioTechniques. 20, 478-485 (1996).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6, 343-345 (2009).</li><li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Plasmid+DNA+into+E.+coli+Using+the+Heat+Shock+Method.">Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method.</a> Journal of Visualized Experiments. 6, e253 (2007).</li><li>Torreilles, S. L., McClure, D. E., Green, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+and+refinement+of+euthanasia+methods+for+Xenopus+laevis.">Evaluation and refinement of euthanasia methods for Xenopus laevis.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48, 512-516 (2009).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+Xenopus+laevis+Testes.">Isolating Xenopus laevis Testes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2007, (2007).</li><li>Showell, C., Conlon, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Egg+Collection+and+In+vitro+Fertilization+of+the+Western+Clawed+Frog+Xenopus+tropicalis.">Egg Collection and In vitro Fertilization of the Western Clawed Frog Xenopus tropicalis.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).</li><li>Wilson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 91, 236-247 (1983).</li><li>Schutze, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+protocol+for+emulsion+polymerase+chain+reaction+and+subsequent+purification.">A streamlined protocol for emulsion polymerase chain reaction and subsequent purification.</a> Analytical Biochemistry. 410, 155-157 (2011).</li><li>Weitz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+in+the+dynamical+behaviour+of+a+compartmentalized+programmable+biochemical+oscillator.">Diversity in the dynamical behaviour of a compartmentalized programmable biochemical oscillator.</a> Nature Chemistry. 6, 295-302 (2014).</li><li>Ho, K. K., Lee, J. W., Durand, G., Majumder, S., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+with+poly(vinyl)+alcohol+surfactant+reduces+double+emulsion-encapsulated+mammalian+cell-free+expression.">Protein aggregation with poly(vinyl) alcohol surfactant reduces double emulsion-encapsulated mammalian cell-free expression.</a> PloS One. 12, e0174689 (2017).</li><li>Nakajima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+circadian+oscillation+of+cyanobacterial+KaiC+phosphorylation+in+vitro.">Reconstitution of circadian oscillation of cyanobacterial KaiC phosphorylation in vitro.</a> Science. 308, 414-415 (2005).</li><li>Guan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+tunable+mitotic+oscillator+in+artificial+cells.">A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells.</a> eLife. 7, (2018).</li></ol>

Dat maakt het mogelijk in vitro reconstitutie en op lange termijn tracking van zichzelf onderhoudende celcyclus-oscillaties op het niveau van eencellige, hebben wij een nieuwe methode voor het ontwikkelen van een systeem met hoge gegevensdoorvoer kunstmatige cel gepresenteerd. Er zijn verschillende kritische stappen die deze methode succesvol te maken. Eerste, versgeperste Xenopus eieren met een goede kwaliteit, in vergelijking met de vastgestelde eieren, de neiging om extracten te produceren met langdu...

Cytoplasmatische extracten, bereid uit Xenopus laevis eieren vertegenwoordigen een van de meest overheersende modellen voor de biochemische studie van cel cycli, gezien de grote hoeveelheid van de eicellen, de snelle celcyclus en het vermogen van de bijenpopulatie mitotische gebeurtenissen in vitro1,2. Dit systeem heeft toegestaan de eerste ontdekking en de mechanistische karakterisering van essentiële celcyclus regelgevers zoals rijping-bevorderende factor (MPF) evenals downstream mitotische processen, met inbegrip van spindel vergadering en chromosoom segregatie1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11. De Xenopus ei extracten zijn ook gebruikt voor gedetailleerde dissectie van de regulerende netwerken van de celcyclus klok8,12,13,14 en voor studies van de DNA-schade /Replication checkpoint15 en de mitotische spindel vergadering checkpoint16,17,18.
Deze studies van cel cycli met gebruik van de ei-extracten van Xenopus zijn voornamelijk gebaseerd op metingen van de bulk. Conventionele bulk reactie testen kunnen echter geen echte cel gedrag, krijgen van een belangrijke discrepantie in hun afmetingen en subcellular ruimtelijke opdeling van reactie moleculen nabootsen. Bovendien, bulk metingen van mitotische activiteiten zijn gevoelig voor een beperkt aantal cycli voor snel demping8geven. Deze nadelen van bulk reacties hebben verhinderd het uittreksel systeem om verder inzicht in de complexe klok dynamische eigenschappen en functies. Recente studies hebben ingekapseld cel-vrije cytostatic factor-gearresteerd (CSF) Xenopus 19,20 in grootte gedefinieerde cel-achtige compartimenten, die hebben bijgedragen toelichten hoe de grootte van de spindel wordt gemoduleerd extracten door de cytoplasmatische volume. Echter, dit systeem in vitro is gearresteerd in de metafase van meiose II door de werking van cytostatica factor1, en een systeem dat kan op lange termijn aanhoudende trillingen op het niveau van eencellige nodig is voor verder onderzoek van de celcyclus oscillator.
Studeren celcyclus oscillaties met eencellige resolutie, hebben we ontwikkeld, een cel-schaal, hoge-doorvoer systeem voor reconstitutie en gelijktijdige meting van meerdere zichzelf onderhoudende mitotische oscillerende processen in individuele microemulsion druppels. In dit gedetailleerde video protocol tonen we de oprichting van de kunstmatige mitotische oscillatie systeem door encapsulating fietsen Xenopus laevis ei cytoplasma in Micro van grootte variërend van 10 tot 300 µm. In dit systeem waren de mitotische oscillaties met inbegrip van chromosoom condensatie en ambtshalve condensatie, nucleaire envelop verdeling en Reformatie en de afbraak en synthese van anafase ondergronden (bijvoorbeeld securin-mCherry in dit protocol) met succes aangemaakt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="593">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Xenopus laevis frogs</td>
			<td style="width:93px;">Xenopus-I Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">QIAprep spin miniprep kit</td>
			<td style="width:93px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">27104</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">QIAquick PCR Purification Kit (250)</td>
			<td style="width:93px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">28106</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td>
			<td style="width:93px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM1340</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">BL21 (DE3)-T-1 competent cell</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B2935</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Calcium ionophore</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A23187</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B2261</td>
			<td style="width:167px;">Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Trichloro</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">448931</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;">Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl) silane</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:215px;">PFPE-PEG surfactant</td>
			<td style="width:93px;">Ran Biotechnologies</td>
			<td style="width:119px;">008-FluoroSurfactant-2wtH-50G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">GE Healthcare Glutathione Sepharose 4B beads</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">GE17-0756-01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">PD-10 column</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">GE17-0851-01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">VitroCom miniature hollow glass tubing</td>
			<td style="width:93px;">VitroCom</td>
			<td style="width:119px;">5012</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Olympus SZ61 Stereo Microscope</td>
			<td style="width:93px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Olympus IX83 microscope</td>
			<td style="width:93px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Olympus FV1200 confocal microscope</td>
			<td style="width:93px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">NanoDrop spectrophotometer</td>
			<td style="width:93px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:119px;">ND-2000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">0.4 mL Snap-Cap Microtubes</td>
			<td style="width:93px;">E&#38;K Scientific</td>
			<td style="width:119px;">485050-B</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="54" rowspan="2" style="height:55px;width:215px;">&#160;PureLink RNA Mini Kit</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">ThermoFisher&#65288;Ambion&#65289;</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">12183018A</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Fisherbrand Analog Vortex Mixer</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">2215365</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Imaris</td>
			<td style="width:93px;">Bitplane</td>
			<td style="width:119px;">Version 7.3</td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of cell-cycle oscillations in microemulsions of cell-free xenopus egg extracts

Real-time meting van trillingen op de eencellige niveau is belangrijk om te ontdekken de mechanismen van biologische klokken. Hoewel bulk extracten, bereid uit Xenopus laevis eieren krachtig geweest in de ontrafeling van biochemische netwerken ten grondslag liggen aan de celcyclus, leidt hun gemiddelde meting van ensemble meestal tot een gedempte trilling, ondanks elk individuele oscillator wordt opgelopen. Dit is te wijten aan de moeilijkheid van perfecte synchronisatie tussen individuele oscillatoren in lawaaierige biologische systemen. Om op te halen de eencellige dynamiek van de oscillator, ontwikkelden we een kunstmatige cel druppel-gebaseerd systeem dat mitotische cycli in cel-achtige compartimenten encapsulating fietsen cytoplasmatische extracten van Xenopus laevis eieren kan reconstrueren. Deze eenvoudige cytoplasmatische-alleen cellen vertonen aanhoudende trillingen voor meer dan 30 cycli. Wij toegevoegd om te bouwen ingewikkelder cellen met kernen, demembranated sperma chromatine te activeren de kernen zelf-assemblage in het systeem. We hebben vastgesteld dat een periodieke progressie van chromosoom condensatie/decondensation en kernen omhullen verdeling/Reformatie, zoals in echte cellen. Dit geeft aan dat de mitotische oscillator getrouw functioneert om meerdere downstream mitotische gebeurtenissen. We tegelijk de dynamiek van de mitotische oscillator en downstream processen in afzonderlijke druppels met meerkanaals time-lapse fluorescentie microscopie bijgehouden. Het kunstmatige celcyclus-systeem biedt een high-throughput kader voor kwantitatieve manipulatie en analyse van de mitotische oscillaties met eencellige resolutie, die waarschijnlijk belangrijke inzichten in de regelgevende machines en functies van biedt de klok.

In Figuur 2, laten we zien dat dit protocol mitotische oscillaties in zowel eenvoudige, nucleair-vrije cellen als ingewikkeld cellen met kernen produceert, waar de oscillator de cyclische afwisseling van kernen vorming en vervorming rijdt. De kernen-vrije druppels genereren mitotische oscillaties omhoog aan 30 ongedempte cycli in de tijdsspanne van 92 uur, zoals aangegeven door de periodieke synthese en degradatie van een fluorescentie verslaggever securin-mC...

Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts at JoVE.com

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Door encapsulating ei extracten van Xenopus laevis in water-in-olie micro presenteren we een methode voor het genereren van in vitro zichzelf onderhoudende mitotische oscillaties op het niveau van eencellige.

Reconstructie van de celcyclus oscillaties in Micro van cel-vrije Xenopus ei extracten

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het gebied van systeembiologie, zoals het regulerende mechanisme achter het mitotische netwerk en de dynamische eigenschappen en functies van de celcyclusklok. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een grote hoeveelheid druppels met meerdere celcycli in elk zal genereren, die ons een hoog doorvoerkader voor kwantitatieve manipulatie en analyse biedt. Om te beginnen, gooi partijen eieren met onduidelijke grenzen tussen dierlijke en plantaardige palen of onregelmatige witte vlekken op de top van dierlijke palen.Selecteer vervolgens een geschikte partij eieren van een vrouwelijke kikker en breng de eieren over op een bekerglas van 600 milliliter. Giet een overmaat van 0,2 x MMR buffer, en voorzichtig cysteïne toe te voegen in 1x extract buffer aan de eieren. Schud hierna de beker krachtig met de hand om de geleilagen van de eieren te verwijderen.Herhaal deze was drie keer met een totaal van 800 milliliter cysteïne buffer of totdat de eieren aggregaat en vestigen op de bodem van het bekerglas. Nadat de geleilaag is verwijderd, was de eieren vier keer in een liter 0,2x MMR-oplossing. Gebruik een glazen pipet op te halen en gooi de eieren die wit.Giet de MMR buffer uit het bekerglas, en voeg 200 milliliter calcium ionofre oplossing in de eieren. Gebruik een glazen pipet om de eieren zachtjes te roeren totdat ze worden geactiveerd, en verwijder de calcium-ionofre oplossing. Het verlaten van de eieren in calcium ionofre oplossing te lang zal initiëren apoptose.We roeren de eieren gedurende 1,5 minuten en controleren de activeringsefficiëntie. Als ze niet worden geactiveerd, hervatten roeren, en controleer vaker tot 90% activering is bereikt. Nadat de eieren zich op de bodem van het bekerglas hebben nestelen, controleert u de activeringsefficiëntie.Goed geactiveerde eieren hebben ongeveer 25% van de dierenpaal en 75% van de plantaardige pool. Was vervolgens de eieren twee maal met een totaal volume van 50 milliliter extractbuffer aangevuld met proteaseremmers. Breng de eieren vervolgens voorzichtig over op een snap-cap microtube van 0,4 milliliter.Centrifugeren de microbuis gedurende 60 seconden op 200 g en vervolgens op 600 g gedurende 30 seconden om de eieren te verpakken. Gebruik vervolgens een glazen Pasteur pipet om de overtollige buffer op de top van de eieren na elke stap te verwijderen. Na deze, plet de eieren op 15,000 g gedurende 10 minuten op vier graden Celsius.Gebruik een scheermesje om de buizen te snijden om de drie lagen van geplette eieren te scheiden en houd de ruwe cytoplasma in de middelste laag. Breng vervolgens het ruwe cytoplasma over om ultracentrifugebuizen schoon te maken. Vul het cytoplasma aan met proteaseremmers en cytochalasine B met 10 microgram per milliliter per stuk.Centrifuge het ruwe cytoplasma op 15, 000 g en vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Gebruik vervolgens een scheermesje om de buis te snijden en het cytoplasma in de middelste laag te houden. Leg de vers bereide extracten op ijs.Voeg eerst securin-mCherry mRNA toe aan de voorbereide extracten. Voeg vervolgens 200 microliter van 2%PFPE-PEG fluorfactant toe aan het extract mRNA mengsel. Gebruik een vortex mixer om druppels te genereren, het aanpassen van de vortex snelheid en duur als dat nodig is.Inspecteer vervolgens visueel de druppels om ervoor te zorgen dat ze uniform in grootte zijn. Met behulp van een pipet van 200 microliter breng je de druppels die op de bovenkant zweven en een gelijk volume oppervlakteactieve stoffen over naar een PCR-buis. Dompel een glazen buis in de druppellaag en wacht tot de druppeltjes ongeveer 75% van de buis vullen.Duw vervolgens de buis in de oppervlakteactieve laag en vul de buis volledig. Vul vervolgens een schotel met glazen bodem met minerale olie. Gebruik vervolgens een fijne pincet om de met druppel gevulde buis in de olie onder te dompelen.Gebruik een glazen pipet om zichtbaar vuil of gelekte druppels te verwijderen. Om beweging en lekkage van druppels te voorkomen, moet de met druppels gevulde glazen buis zorgvuldig onder minerale olie worden ondergedompeld. We kunnen de buis aan beide uiteinden met balans duwen of eerst een paar druppels minerale olie aan de uiteinden van de buis toevoegen.Gebruik hierna een epifluorescentiemicroscoop uitgerust met een gemotoriseerde xy-fase om de druppels in beeld te brengen. Neem time-lapse video's op in het heldere veld en meerdere fluorescentiekanalen om de zes tot negen minuten totdat de druppels hun activiteit verliezen. Met behulp van dit protocol werden mitotische oscillatie in zowel eenvoudige, kernvrije cellen als gecompliceerde cellen met kernen geproduceerd.De nuclei-vrije druppels gegenereerd mitotische oscillatie tot 30 ongedempte cycli over 92 uur. Ook werd gekeken naar het vermogen van de mitotische oscillator om downstream mitotische gebeurtenissen te drijven. De zelfvoorzienende mitotische oscillator dreef de veranderingen van de nucleaire morfologie waargenomen door de autonome verandering van verschillende celcyclusfasen.Tijdens een poging tot deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om de tijd bij het maken van het extract geest, want het is tijdgevoelig, en altijd houden de eieren en extract op ijs. Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van systeembiologie om fundamentele principes van complexe klokeigenschappen te onderzoeken, zoals tunability en stochasticity in Xenopus laevis.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Reconstructie van Nucleosomen met Differentieel Isotopen-gelabelde Sister Histon

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Spanningsklem Fluorometrie in<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocyten Met Fluorescerende Onnatuurlijke Aminozuren

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Zuivering en reconstructie van TRPV1 spectroscopische p.a.

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Fluorescentie Live-cel beeldvorming van de Complete vegetatieve celcyclus van de langzaam groeiende sociale bacterie Myxococcus xanthus

Fluorescence live-cell imaging of bacterial cells is a key method in the analysis of the spatial and temporal dynamics of proteins and chromosomes ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstructie van het zelf-organiserende eiwit patronen op ondersteunde lipide Bilayers

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Bestuderen van RNA Interactors van proteïne Kinase RNA-geactiveerd tijdens de zoogdieren celcyclus

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Absolute kwantificering van de Celvrije eiwitsynthese metabolisme door omgekeerde fase vloeistofchromatografie-massaspectrometrie

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Verrijking van zoogdierweefsels en Xenopus-eicyten met cholesterol

Cholesterol enrichment of mammalian tissues and cells, including Xenopus oocytes used for studying cell function, can be accomplished using a variety of ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Celvrije productie van proteoliposomen voor functionele analyse en antilichaamontwikkeling gericht op membraaneiwitten

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site specifieke Lysine acetylatie van histonen voor nucleosoom reconstitutie met behulp van genetische code uitbreiding in Escherichia coli

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...