Name: reconstitution of cell-cycle oscillations in microemulsions of cell-free xenopus egg extracts
Uploaded: 2018-09-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts at JoVE.com

Wir danken Madeleine Lu für den Bau von securin mCherry Plasmid, Runde Mann Lee, Kenneth Ho und Allen P Liu für Diskussionen über Tröpfchen-Generation, Jeremy B. Chang und James E. Ferrell Jr für die Bereitstellung, GFP-NLS zu konstruieren. Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation unterstützt (frühe Karriere Grant #1553031), die National Institutes of Health (MIRA #GM119688) und ein Forschungsstipendium Sloan.

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der University of Michigan genehmigt.
1. Vorbereitung der Materialien für Zellzyklus Rekonstitution und Erkennung
<ol><li>
Gibson-Assembly für den Plasmid DNA-Bau und mRNA Reinigung des securin mCherry Klonen
	<ol>
<li>Bereiten Sie drei DNA-Fragmente, darunter ein pMTB2 Vektor Rückgrat, securin und mCherry durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und gel Reinigung<sup cl...

<ol>
	<li>Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+extracts.">Cell cycle extracts.</a> Methods in Cell Biology. 36, 581-605 (1991).</li><li>Hannak, E., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+mitotic+spindle+assembly+and+function+in+vitro+using+Xenopus+laevis+egg+extracts.">Investigating mitotic spindle assembly and function in vitro using Xenopus laevis egg extracts.</a> Nature Protocols. 1, 2305-2314 (2006).</li><li>Murray, A. W., Solomon, M. J., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cyclin+synthesis+and+degradation+in+the+control+of+maturation+promoting+factor+activity.">The role of cyclin synthesis and degradation in the control of maturation promoting factor activity.</a> Nature. 339, 280-286 (1989).</li><li>Yang, Q., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cdk1-APC/C+cell+cycle+oscillator+circuit+functions+as+a+time-delayed,+ultrasensitive+switch.">The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch.</a> Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).</li><li>Chang, J. B., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+trigger+waves+and+the+spatial+coordination+of+the+Xenopus+cell+cycle.">Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle.</a> Nature. 500, 603-607 (2013).</li><li>Trunnell, N. B., Poon, A. C., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitivity+in+the+Regulation+of+Cdc25C+by+Cdk1.">Ultrasensitivity in the Regulation of Cdc25C by Cdk1.</a> Molecular Cell. 41, 263-274 (2011).</li><li>Kim, S. Y., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+competition+as+a+source+of+ultrasensitivity+in+the+inactivation+of+Wee1.">Substrate competition as a source of ultrasensitivity in the inactivation of Wee1.</a> Cell. 128, 1133-1145 (2007).</li><li>Pomerening, J. R., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems-level+dissection+of+the+cell-cycle+oscillator:+bypassing+positive+feedback+produces+damped+oscillations.">Systems-level dissection of the cell-cycle oscillator: bypassing positive feedback produces damped oscillations.</a> Cell. 122, 565-578 (2005).</li><li>Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+a+cell+cycle+oscillator:+hysteresis+and+bistability+in+the+activation+of+Cdc2.">Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2.</a> Nature Cell Biology. 5, 346-351 (2003).</li><li>Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aster+migration+determines+the+length+scale+of+nuclear+separation+in+the+Drosophila+syncytial+embryo.">Aster migration determines the length scale of nuclear separation in the Drosophila syncytial embryo.</a> The Journal of Cell Biology. 197, 887-895 (2012).</li><li>Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+Drosophila+embryo+extract+for+the+study+of+mitosis+ex+vivo.">A single Drosophila embryo extract for the study of mitosis ex vivo.</a> Nature Protocols. 8, 310-324 (2013).</li><li>Tsai, T. Y. C., Theriot, J. A., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+Oscillatory+Dynamics+in+the+Cell+Cycle+of+Early+Xenopus+laevis+Embryos.">Changes in Oscillatory Dynamics in the Cell Cycle of Early Xenopus laevis Embryos.</a> PLoS Biology. 12, e1001788 (2014).</li><li>Chang, J. B., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+trigger+waves+and+the+spatial+coordination+of+the+Xenopus+cell+cycle.">Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle.</a> Nature. 500, 603-607 (2013).</li><li>Yang, Q., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cdk1-APC/C+cell+cycle+oscillator+circuit+functions+as+a+time-delayed,+ultrasensitive+switch.">The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch.</a> Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).</li><li>Kumagai, A., Dunphy, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claspin,+a+novel+protein+required+for+the+activation+of+Chk1+during+a+DNA+replication+checkpoint+response+in+Xenopus+egg+extracts.">Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts.</a> Molecular Cell. 6, 839-849 (2000).</li><li>Chen, R. H., Murray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+spindle+assembly+checkpoint+in+Xenopus+egg+extracts.">Characterization of spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts.</a> Methods in Enzymology. 283, 572-584 (1997).</li><li>Chen, R. H., Waters, J. C., Salmon, E. D., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+spindle+assembly+checkpoint+component+XMAD2+with+unattached+kinetochores.">Association of spindle assembly checkpoint component XMAD2 with unattached kinetochores.</a> Science. 274, 242-246 (1996).</li><li>Minshull, J., Sun, H., Tonks, N. K., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+MAP+kinase-dependent+spindle+assembly+checkpoint+in+Xenopus+egg+extracts.">A MAP kinase-dependent spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts.</a> Cell. 79, 475-486 (1994).</li><li>Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+Volume+Modulates+Spindle+Size+During+Embryogenesis.">Cytoplasmic Volume Modulates Spindle Size During Embryogenesis.</a> Science. 342, 856-860 (2013).</li><li>Hazel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+cytoplasmic+volume+are+sufficient+to+drive+spindle+scaling.">Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling.</a> Science. 342, 853-856 (2013).</li><li>Garibyan, L., Avashia, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+Techniques+Made+Simple:+Polymerase+Chain+Reaction+(PCR).">Research Techniques Made Simple: Polymerase Chain Reaction (PCR).</a> The Journal of Investigative Dermatology. 133, e6 (2013).</li><li>Hecker, K. H., Roux, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+and+low+annealing+temperatures+increase+both+specificity+and+yield+in+touchdown+and+stepdown+PCR.">High and low annealing temperatures increase both specificity and yield in touchdown and stepdown PCR.</a> BioTechniques. 20, 478-485 (1996).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6, 343-345 (2009).</li><li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Plasmid+DNA+into+E.+coli+Using+the+Heat+Shock+Method.">Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method.</a> Journal of Visualized Experiments. 6, e253 (2007).</li><li>Torreilles, S. L., McClure, D. E., Green, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+and+refinement+of+euthanasia+methods+for+Xenopus+laevis.">Evaluation and refinement of euthanasia methods for Xenopus laevis.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48, 512-516 (2009).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+Xenopus+laevis+Testes.">Isolating Xenopus laevis Testes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2007, (2007).</li><li>Showell, C., Conlon, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Egg+Collection+and+In+vitro+Fertilization+of+the+Western+Clawed+Frog+Xenopus+tropicalis.">Egg Collection and In vitro Fertilization of the Western Clawed Frog Xenopus tropicalis.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).</li><li>Wilson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 91, 236-247 (1983).</li><li>Schutze, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+protocol+for+emulsion+polymerase+chain+reaction+and+subsequent+purification.">A streamlined protocol for emulsion polymerase chain reaction and subsequent purification.</a> Analytical Biochemistry. 410, 155-157 (2011).</li><li>Weitz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+in+the+dynamical+behaviour+of+a+compartmentalized+programmable+biochemical+oscillator.">Diversity in the dynamical behaviour of a compartmentalized programmable biochemical oscillator.</a> Nature Chemistry. 6, 295-302 (2014).</li><li>Ho, K. K., Lee, J. W., Durand, G., Majumder, S., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+with+poly(vinyl)+alcohol+surfactant+reduces+double+emulsion-encapsulated+mammalian+cell-free+expression.">Protein aggregation with poly(vinyl) alcohol surfactant reduces double emulsion-encapsulated mammalian cell-free expression.</a> PloS One. 12, e0174689 (2017).</li><li>Nakajima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+circadian+oscillation+of+cyanobacterial+KaiC+phosphorylation+in+vitro.">Reconstitution of circadian oscillation of cyanobacterial KaiC phosphorylation in vitro.</a> Science. 308, 414-415 (2005).</li><li>Guan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+tunable+mitotic+oscillator+in+artificial+cells.">A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells.</a> eLife. 7, (2018).</li></ol>

Wir haben einer neuartigen Methode zur Entwicklung eines künstlichen Zelle Hochdurchsatz-Systems, ermöglicht in Vitro Rekonstitution und langfristige Verfolgung von selbsttragenden Zellzyklus Schwingungen auf der Ebene der einzelligen vorgelegt. Es gibt mehrere wichtige Schritte, mit denen diese Methode erfolgreich. Erste, frisch gepresste Xenopus Eiern mit einer guten Qualität verglichen mit gelegten Eier, tendenziell Extrakte mit länger anhaltende Schwingung Aktivität zu produzieren. Zweitens ist...

Zytoplasmatischen Extrakte aus Xenopus Laevis Eier zubereitet repräsentieren eines der vorherrschenden Modelle für die biochemische Untersuchung der Zelle Zyklen, angesichts der großen Anzahl der Eizellen, die schnelle Zellzyklus Progression und die Fähigkeit der Neuaufbau mitotische Veranstaltungen in-vitro-1,2. Dieses System ermöglichte die erste Entdeckung und mechanistischen Charakterisierung der wesentlichen Zellzyklus Regulierungsbehörden wie Förderung der Reifung Faktor (MPF) sowie nachgelagerte mitotische Prozesse einschließlich Montage und Chromosom Segregation1 Spindel ,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11. Xenopus -Ei-Extrakte haben auch verwendet worden, für detaillierte Dissektion der regulationsnetzwerke des Zellzyklus Uhr8,12,13,14 und Studien von DNA-Schäden /Replication Checkpoint15 und der mitotischen Spindel Baugruppe Checkpoint16,17,18.
Diese Studien der Zelle Zyklen mit Xenopus -Ei-Extrakte haben hauptsächlich basiert auf Masse Messungen. Jedoch können konventionelle Masse Reaktion Assays nicht echte Zelle Verhalten, gegeben eine große Diskrepanz in ihren Dimensionen und subzelluläre räumliche Abschottung der Reaktion Moleküle imitieren. Darüber hinaus sind lose Messungen der mitotischen Aktivitäten anfällig für eine begrenzte Anzahl von Zyklen vor der Dämpfung schnell8geben. Diese Nachteile der Masse Reaktionen verhindert haben das Extrakt System um weitere Verständnis der komplexen Uhr dynamische Eigenschaften und Funktionen bereitzustellen. Jüngste Studien haben gekapselt zellfreie Zytostatika Faktor verhaftet (CSF) Xenopus extrahiert19,20 in Größe definiert zellähnliche Fächer, die dazu beigetragen haben, aufzuklären, wie Spindel Größe durch moduliert wird die zytoplasmatischen Volumen. Jedoch dieses in-vitro- System ist durch die Wirkung der Zytostatika Faktor1in Metaphase der Meiose II verhaftet, und ein System in der Lage, langfristige nachhaltige Schwingungen auf der Ebene der einzelnen Zelle zur weiteren Untersuchung des Zellzyklus erforderlich Oszillator.
Zellzyklus Schwingungen mit einzelligen Auflösung studieren, entwickelten wir eine Zelle-Skala, Hochdurchsatz-System zur Rekonstitution und gleichzeitige Messung mehrerer selbsttragenden mitotischen oszillierende Prozesse in einzelnen Mikroemulsion Tröpfchen. In diesem ausführlichen video Protokoll zeigen wir die Schaffung eines künstlichen mitotischen Schwingung durch Kapselung von Radsport Xenopus Laevis Ei Zytoplasma in Mikroemulsionen Größen von 10 bis 300 µm. In diesem System wurden mitotische Schwingungen einschließlich Chromosom Kondensation und de-Kondensation, Kernhülle Aufschlüsselung und Reformation, und der Abbau und Synthese von Anaphase Substrate (z. B. securin-mCherry in diesem Protokoll) erfolgreich wieder hergestellt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="593">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Xenopus laevis frogs</td>
			<td style="width:93px;">Xenopus-I Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">QIAprep spin miniprep kit</td>
			<td style="width:93px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">27104</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">QIAquick PCR Purification Kit (250)</td>
			<td style="width:93px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">28106</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td>
			<td style="width:93px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM1340</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">BL21 (DE3)-T-1 competent cell</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B2935</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Calcium ionophore</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A23187</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B2261</td>
			<td style="width:167px;">Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Trichloro</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">448931</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;">Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl) silane</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:215px;">PFPE-PEG surfactant</td>
			<td style="width:93px;">Ran Biotechnologies</td>
			<td style="width:119px;">008-FluoroSurfactant-2wtH-50G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">GE Healthcare Glutathione Sepharose 4B beads</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">GE17-0756-01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">PD-10 column</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">GE17-0851-01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">VitroCom miniature hollow glass tubing</td>
			<td style="width:93px;">VitroCom</td>
			<td style="width:119px;">5012</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Olympus SZ61 Stereo Microscope</td>
			<td style="width:93px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Olympus IX83 microscope</td>
			<td style="width:93px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Olympus FV1200 confocal microscope</td>
			<td style="width:93px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">NanoDrop spectrophotometer</td>
			<td style="width:93px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:119px;">ND-2000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">0.4 mL Snap-Cap Microtubes</td>
			<td style="width:93px;">E&#38;K Scientific</td>
			<td style="width:119px;">485050-B</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="54" rowspan="2" style="height:55px;width:215px;">&#160;PureLink RNA Mini Kit</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">ThermoFisher&#65288;Ambion&#65289;</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">12183018A</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Fisherbrand Analog Vortex Mixer</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">2215365</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Imaris</td>
			<td style="width:93px;">Bitplane</td>
			<td style="width:119px;">Version 7.3</td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of cell-cycle oscillations in microemulsions of cell-free xenopus egg extracts

Echtzeit-Messung von Schwingungen auf die einzelne Zelle Ebene ist wichtig, die Mechanismen der biologischen Uhren entdecken. Obwohl Bulk Extrakte aus Xenopus Laevis Eier zubereitet mächtig in biochemischen Netzwerken zugrunde liegt die Zellzyklus Progression seziert wurden, führt deren Ensemble durchschnittliche Messung typischerweise zu einer gedämpften Schwingung, trotz jeder einzelnen Oszillator wird aufrechterhalten. Dies ist aufgrund der Schwierigkeiten der perfekte Synchronisation zwischen einzelnen Oszillatoren in laut biologischer Systeme. Die einzelligen Dynamik des Oszillators abzurufen, entwickelten wir ein Droplet-basierten künstlichen Zellsystem, die mitotische Zyklen in zellähnliche Fächer Verkapselung Radsport zytoplasmatischen Extrakte von Xenopus Laevis Eier rekonstruieren kann. Diese einfachen nur cytoplasmatische Zellen weisen nachhaltige Schwingungen für über 30 Zyklen. Um kompliziertere Zellen mit Kernen zu bauen, haben wir Demembranated Spermien Chromatin Kerne Selbstmontage im System ausgelöst. Wir beobachteten eine periodische Abfolge von Chromosom Kondensation/enttauung und Kerne umhüllen Aufschlüsselung/Reformation wie in realen Zellen. Dies bedeutet, dass der mitotische Oszillator treu dient dazu um mehrere nachgeschaltete mitotischen Ereignisse zu fahren. Wir haben gleichzeitig die Dynamik der mitotischen Oszillator und nachgelagerte Prozesse in einzelnen Tröpfchen mit Multi-Channel-time-lapse-Fluoreszenz-Mikroskopie. Das künstliche Zellzyklus-System bietet einen Hochdurchsatz-Rahmen für quantitative Manipulation und Analyse der mitotischen Schwingungen mit einzelligen Entschließung, die wahrscheinlich wichtige Erkenntnisse über die regulatorischen Maschinen und Funktionen des liefert die Uhr.

In Abbildung 2zeigen wir, dass dieses Protokoll mitotische Schwingungen in einfache, atomwaffenfreien Zellen sowie komplizierte Zellen mit Kernen produziert, wo der Oszillator den zyklischen Wechsel von Kernen Bildung und Verformung treibt. Die Kerne frei Tröpfchen erzeugen mitotische Schwingungen bis zu 30 ungedämpften Zyklen über die Zeitspanne von 92 Stunden, wie durch den periodischen Synthese und Abbau von einem Fluoreszenz-Reporter securin-mCherry (<...

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Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Wir präsentieren eine Methode zur Erzeugung von in-vitro- autarken mitotischen Schwingungen auf der Ebene der einzelnen Zelle durch Verkapselung Ei Extrakte von Xenopus Laevis in Wasser-in-Öl-Mikroemulsionen.

Rekonstitution des Zellzyklus Schwingungen in Mikroemulsionen zellfreie Xenopus Ei Extrakte

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Systembiologie zu beantworten, wie z. B. den Regelungsmechanismus hinter dem mitotischen Netzwerk und die dynamischen Eigenschaften und Funktionen der Zellzyklusuhr. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie eine große Menge von Tröpfchen mit jeweils mehreren Zellzyklen erzeugt und uns ein Hochdurchsatz-Framework für quantitative Manipulation und Analyse bietet. Um zu beginnen, entsorgen Sie Chargen von Eiern, die unklare Grenzen zwischen tierischen und vegetalischen Polen oder unregelmäßigen weißen Flecken auf tierischen Polen haben.Als nächstes wählen Sie eine entsprechende Charge Eier von einem weiblichen Frosch, und übertragen Sie die Eier auf ein 600-Milliliter-Becher. Gießen Sie einen Überschuss von 0,2x MMR-Puffer, und fügen Sie Cystein in 1x ExtraktPuffer zu den Eiern. Danach den Becher kräftig von Hand schütteln, um die Geleemäntel der Eier zu entfernen.Wiederholen Sie diese Wäsche dreimal mit insgesamt 800 Milliliter Cysteinpuffer oder bis die Eier sich aggregieren und am Boden des Bechers absetzen. Nachdem das Gelee-Mantel entfernt wurde, waschen Sie die Eier viermal in einem Liter 0,2x MMR-Lösung. Verwenden Sie eine Glaspipette, um die Eier, die weiß werden, aufzunehmen und zu entsorgen.Gießen Sie den MMR-Puffer aus dem Becher, und fügen Sie 200 Milliliter Calciumionophorlösung in die Eier. Verwenden Sie eine Glaspipette, um die Eier sanft zu rühren, bis sie aktiviert werden, und entfernen Sie die Calcium-Ionophor-Lösung. Wenn die Eier zu lange in Calciumionophorlösung gelassen werden, wird dies eine Apoptose initiieren.Wir rühren die Eier 1,5 Minuten lang und überprüfen die Aktivierungseffizienz. Wenn sie nicht aktiviert sind, fahren Sie mit dem Rühren fort, und überprüfen Sie häufiger, bis eine 90%ige Aktivierung erreicht ist. Nachdem sich die Eier am Unteren Rand des Bechers absetzen, überprüfen Sie die Aktivierungseffizienz.Gut aktivierte Eier haben etwa 25% des Tierpols und 75% des Gemüsepols. Als nächstes waschen Sie die Eier zweimal mit einem Gesamtvolumen von 50 Milliliter Nextraliter Naderpuffer, ergänzt mit Protease-Inhibitoren. Dann die Eier vorsichtig auf ein 0,4-Milliliter-Snap-Cap-Mikrotube übertragen.Zentrifugieren Sie das Mikrorohr 60 Sekunden lang bei 200 g und dann 30 Sekunden lang bei 600 g, um die Eier einzupacken. Verwenden Sie dann eine glasende Pasteurpipette, um den überschüssigen Puffer auf den Eiern nach jedem Schritt zu entfernen. Danach die Eier bei 15.000 g 10 Minuten bei vier Grad Celsius zerdrücken.Verwenden Sie eine Rasierklinge, um die Rohre zu schneiden, um die drei Schichten von zerkleinerten Eiern zu trennen und das rohe Zytoplasma in der mittleren Schicht zu halten. Dann übertragen Sie das rohe Zytoplasma, um Ultrazentrifugenrohre zu reinigen. Ergänzen Sie das Zytoplasma mit Protease-Inhibitoren und Cytochalasin B bei jeweils 10 Mikrogramm pro Milliliter.Zentrifugieren Sie das rohe Zytoplasma bei 15 000 g und vier Grad Celsius für fünf Minuten. Verwenden Sie dann eine Rasierklinge, um das Rohr zu schneiden und das Zytoplasma in der mittleren Schicht zu halten. Die frisch zubereiteten Extrakte auf Eis legen.Fügen Sie zunächst securin-mCherry mRNA zu den vorbereiteten Extrakten hinzu. Als nächstes fügen Sie dem Extrakt mRNA-Gemisch 200 Mikroliter 2%PFPE-PEG-Fluorosursidans hinzu. Verwenden Sie einen Wirbelmischer, um Tröpfchen zu erzeugen und die Wirbelgeschwindigkeit und -dauer nach Bedarf anzupassen.Überprüfen Sie dann die Tröpfchen visuell, um sicherzustellen, dass sie einheitlich sind. Mit einer 200-Mikroliter-Pipette die auf der Oberseite schwebenden Tröpfchen und ein gleiches Tensidvolumen auf ein PCR-Rohr übertragen. Tauchen Sie ein Glasrohr in die Tröpfchenschicht, und warten Sie, bis die Tröpfchen etwa 75% des Rohres füllen.Dann schieben Sie das Rohr in die Tensidschicht, und füllen Sie das Rohr vollständig. Als nächstes füllen Sie eine Schale mit Glasboden mit Mineralöl. Dann verwenden Sie eine feine Pinzette, um das mit Tröpfchen gefüllte Rohr in das Öl einzutauchen.Verwenden Sie eine Glaspipette, um sichtbare Trümmer oder ausgelaufene Tröpfchen zu entfernen. Um Bewegung und Leckage von Tröpfchen zu vermeiden, sollte das mit Tröpfchen gefüllte Glasrohr sorgfältig unter Mineralöl getaucht werden. Wir können entweder die Röhre an beiden Enden mit Dembalese schieben oder zuerst ein paar Tropfen Mineralöl an die Enden des Rohres geben.Verwenden Sie anschließend ein Epifluoreszenzmikroskop, das mit einer motorisierten xy-Stufe ausgestattet ist, um die Tröpfchen abzubilden. Nehmen Sie Zeitraffervideos im hellen Feld und mehrere Fluoreszenzkanäle alle sechs bis neun Minuten auf, bis die Tröpfchen ihre Aktivität verlieren. Mit diesem Protokoll wurden mitotische Oszillationen sowohl in einfachen, kernfreien Zellen als auch in komplizierten Zellen mit Kernen hergestellt.Die kernfreien Tröpfchen erzeugten mitotische Schwingungen bis zu 30 undamped Zyklen über 92 Stunden. Die Fähigkeit des mitotischen Oszillators, nachgeschaltete mitotische Ereignisse anzutreiben, wurde ebenfalls untersucht. Der selbsttragende mitotische Oszillator trieb die Veränderungen der kerntechnischen Morphologie voran, die durch die autonome Veränderung verschiedener Zellzyklusphasen beobachtet wurden.Beim Versuch dieses Verfahrens, Es ist wichtig, die Zeit bei der Herstellung des Extraktes zu beachten, da es zeitempfindlich ist, und halten Sie immer die Eier und Extrakt auf Eis. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Systembiologie, um grundlegende Prinzipien komplexer Uhreigenschaften wie Tunabilität und Stochasticity in Xenopus laevis zu erforschen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Rekonstitution von Nukleosomen mit differentiell isotopenmarkierten Schwester Histone

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Forschung

Biochemie

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Spannklemme Fluorometrie in<em&gt; Xenopus</em&gt; Oozyten mit fluoreszierenden unnatürlichen Aminosäuren

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Reinigung und Wiederherstellung der TRPV1 für spektroskopische Analyse

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Fluoreszenz Live Cell Imaging der komplette Vegetative Zellzyklus von langsam wachsenden sozialen Bakterium Myxococcus xanthus

Fluorescence live-cell imaging of bacterial cells is a key method in the analysis of the spatial and temporal dynamics of proteins and chromosomes ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In-vitro- Rekonstitution der selbstorganisierenden Proteinmuster auf unterstützten Lipid Bilayer

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Studium der RNA Interaktoren des RNA während der Säugetier-Zelle Zyklus aktiviert Proteinkinase

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Absolute Quantifizierung des zellfreien Proteinsynthesestoffwechsels durch Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Anreicherung von Säugetiergeweben und Xenopus-Oozyten mit Cholesterin

Cholesterol enrichment of mammalian tissues and cells, including Xenopus oocytes used for studying cell function, can be accomplished using a variety of ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Zellfreie Produktion von Proteoliposomen für die funktionelle Analyse und Antikörperentwicklung gegen Membranproteine

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Ortsspezifische Lysin-Acetylierung von Histonen zur Nukleosomen-Rekonstitution mit genetischer Codeerweiterung bei Escherichia coli

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...