Name: reconstitution of cell-cycle oscillations in microemulsions of cell-free xenopus egg extracts
Uploaded: 2018-09-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts at JoVE.com

אנו מודים לו מדלן על בניית פלסמיד securin-mCherry, הברכיים Man Lee, קנת הו, אלן ליו P לדיונים על יצירת droplet, ג'רמי B. צ'אנג, ג'יימס דגלס פרל ג'וניור למתן ש-GFP-NLS לבנות. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע (הקריירה המוקדמת מענק #1553031), מכוני הבריאות הלאומיים (מירה #GM119688), מלגת מחקר סלואן.

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת מישיגן.
1. הכנת חומרי שיחזור מחזור התא וזיהוי
<ol><li>
הרכבה גיבסון שיבוט על פלסמיד DNA הבנייה ועל טיהור mRNA של securin-mCherry
	<ol>
<li>להכין שלוש שברי DNA כולל של עמוד השדרה וקטור pMTB2, securi...

<ol>
	<li>Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+extracts.">Cell cycle extracts.</a> Methods in Cell Biology. 36, 581-605 (1991).</li><li>Hannak, E., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+mitotic+spindle+assembly+and+function+in+vitro+using+Xenopus+laevis+egg+extracts.">Investigating mitotic spindle assembly and function in vitro using Xenopus laevis egg extracts.</a> Nature Protocols. 1, 2305-2314 (2006).</li><li>Murray, A. W., Solomon, M. J., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cyclin+synthesis+and+degradation+in+the+control+of+maturation+promoting+factor+activity.">The role of cyclin synthesis and degradation in the control of maturation promoting factor activity.</a> Nature. 339, 280-286 (1989).</li><li>Yang, Q., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cdk1-APC/C+cell+cycle+oscillator+circuit+functions+as+a+time-delayed,+ultrasensitive+switch.">The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch.</a> Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).</li><li>Chang, J. B., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+trigger+waves+and+the+spatial+coordination+of+the+Xenopus+cell+cycle.">Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle.</a> Nature. 500, 603-607 (2013).</li><li>Trunnell, N. B., Poon, A. C., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitivity+in+the+Regulation+of+Cdc25C+by+Cdk1.">Ultrasensitivity in the Regulation of Cdc25C by Cdk1.</a> Molecular Cell. 41, 263-274 (2011).</li><li>Kim, S. Y., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+competition+as+a+source+of+ultrasensitivity+in+the+inactivation+of+Wee1.">Substrate competition as a source of ultrasensitivity in the inactivation of Wee1.</a> Cell. 128, 1133-1145 (2007).</li><li>Pomerening, J. R., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems-level+dissection+of+the+cell-cycle+oscillator:+bypassing+positive+feedback+produces+damped+oscillations.">Systems-level dissection of the cell-cycle oscillator: bypassing positive feedback produces damped oscillations.</a> Cell. 122, 565-578 (2005).</li><li>Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+a+cell+cycle+oscillator:+hysteresis+and+bistability+in+the+activation+of+Cdc2.">Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2.</a> Nature Cell Biology. 5, 346-351 (2003).</li><li>Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aster+migration+determines+the+length+scale+of+nuclear+separation+in+the+Drosophila+syncytial+embryo.">Aster migration determines the length scale of nuclear separation in the Drosophila syncytial embryo.</a> The Journal of Cell Biology. 197, 887-895 (2012).</li><li>Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+Drosophila+embryo+extract+for+the+study+of+mitosis+ex+vivo.">A single Drosophila embryo extract for the study of mitosis ex vivo.</a> Nature Protocols. 8, 310-324 (2013).</li><li>Tsai, T. Y. C., Theriot, J. A., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+Oscillatory+Dynamics+in+the+Cell+Cycle+of+Early+Xenopus+laevis+Embryos.">Changes in Oscillatory Dynamics in the Cell Cycle of Early Xenopus laevis Embryos.</a> PLoS Biology. 12, e1001788 (2014).</li><li>Chang, J. B., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+trigger+waves+and+the+spatial+coordination+of+the+Xenopus+cell+cycle.">Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle.</a> Nature. 500, 603-607 (2013).</li><li>Yang, Q., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cdk1-APC/C+cell+cycle+oscillator+circuit+functions+as+a+time-delayed,+ultrasensitive+switch.">The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch.</a> Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).</li><li>Kumagai, A., Dunphy, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claspin,+a+novel+protein+required+for+the+activation+of+Chk1+during+a+DNA+replication+checkpoint+response+in+Xenopus+egg+extracts.">Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts.</a> Molecular Cell. 6, 839-849 (2000).</li><li>Chen, R. H., Murray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+spindle+assembly+checkpoint+in+Xenopus+egg+extracts.">Characterization of spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts.</a> Methods in Enzymology. 283, 572-584 (1997).</li><li>Chen, R. H., Waters, J. C., Salmon, E. D., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+spindle+assembly+checkpoint+component+XMAD2+with+unattached+kinetochores.">Association of spindle assembly checkpoint component XMAD2 with unattached kinetochores.</a> Science. 274, 242-246 (1996).</li><li>Minshull, J., Sun, H., Tonks, N. K., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+MAP+kinase-dependent+spindle+assembly+checkpoint+in+Xenopus+egg+extracts.">A MAP kinase-dependent spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts.</a> Cell. 79, 475-486 (1994).</li><li>Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+Volume+Modulates+Spindle+Size+During+Embryogenesis.">Cytoplasmic Volume Modulates Spindle Size During Embryogenesis.</a> Science. 342, 856-860 (2013).</li><li>Hazel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+cytoplasmic+volume+are+sufficient+to+drive+spindle+scaling.">Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling.</a> Science. 342, 853-856 (2013).</li><li>Garibyan, L., Avashia, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+Techniques+Made+Simple:+Polymerase+Chain+Reaction+(PCR).">Research Techniques Made Simple: Polymerase Chain Reaction (PCR).</a> The Journal of Investigative Dermatology. 133, e6 (2013).</li><li>Hecker, K. H., Roux, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+and+low+annealing+temperatures+increase+both+specificity+and+yield+in+touchdown+and+stepdown+PCR.">High and low annealing temperatures increase both specificity and yield in touchdown and stepdown PCR.</a> BioTechniques. 20, 478-485 (1996).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6, 343-345 (2009).</li><li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Plasmid+DNA+into+E.+coli+Using+the+Heat+Shock+Method.">Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method.</a> Journal of Visualized Experiments. 6, e253 (2007).</li><li>Torreilles, S. L., McClure, D. E., Green, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+and+refinement+of+euthanasia+methods+for+Xenopus+laevis.">Evaluation and refinement of euthanasia methods for Xenopus laevis.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48, 512-516 (2009).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+Xenopus+laevis+Testes.">Isolating Xenopus laevis Testes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2007, (2007).</li><li>Showell, C., Conlon, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Egg+Collection+and+In+vitro+Fertilization+of+the+Western+Clawed+Frog+Xenopus+tropicalis.">Egg Collection and In vitro Fertilization of the Western Clawed Frog Xenopus tropicalis.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).</li><li>Wilson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 91, 236-247 (1983).</li><li>Schutze, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+protocol+for+emulsion+polymerase+chain+reaction+and+subsequent+purification.">A streamlined protocol for emulsion polymerase chain reaction and subsequent purification.</a> Analytical Biochemistry. 410, 155-157 (2011).</li><li>Weitz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+in+the+dynamical+behaviour+of+a+compartmentalized+programmable+biochemical+oscillator.">Diversity in the dynamical behaviour of a compartmentalized programmable biochemical oscillator.</a> Nature Chemistry. 6, 295-302 (2014).</li><li>Ho, K. K., Lee, J. W., Durand, G., Majumder, S., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+with+poly(vinyl)+alcohol+surfactant+reduces+double+emulsion-encapsulated+mammalian+cell-free+expression.">Protein aggregation with poly(vinyl) alcohol surfactant reduces double emulsion-encapsulated mammalian cell-free expression.</a> PloS One. 12, e0174689 (2017).</li><li>Nakajima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+circadian+oscillation+of+cyanobacterial+KaiC+phosphorylation+in+vitro.">Reconstitution of circadian oscillation of cyanobacterial KaiC phosphorylation in vitro.</a> Science. 308, 414-415 (2005).</li><li>Guan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+tunable+mitotic+oscillator+in+artificial+cells.">A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells.</a> eLife. 7, (2018).</li></ol>

הוצגו שיטה לפיתוח מערכת תפוקה גבוהה התא המלאכותי הזה מאפשר חוץ גופית בתוך שיחזור ומעקב לטווח ארוך של מחזור התא עצמית מתמשכת תנודות ברמת תא בודד. ישנם מספר שלבים קריטיים, ההופכות שיטה זו מוצלחת. ביצים צפרדע רפואית הראשון, סחוט טרי באיכות טובה, בהשוואה עם ביצים הניח, נוטים לייצר תמצ...

תמציות cytoplasmic להכין מביצים זריזה צפרדע רפואית מייצג אחד המודלים הדומיננטית ביותר לחקר התא מחזורים, נתון הכמות הגדולה של oocytes, את התקדמות מהירה מחזור התא, את היכולת לשחזר הביוכימי אירועים mitotic במבחנה1,2. מערכת זו אפשרה את התגלית הראשונית ואפיון מכניסטית של מחזור התא חיוני הרגולטורים, כמו קידום ההבשלה פקטור (MPF), כמו גם התהליכים mitotic במורד הזרם, כולל ציר סגרגציה הרכבה של כרומוזום1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11. תמציות ביצה צפרדע רפואית גם שימשו עבור ניתוח מפורט של רשתות רגולטוריות של מחזור התא שעון8,12,13,14 , מחקרים של נזק לדנ א מחסום /replication15 , פלך mitotic הרכבה מחסום16,17,18.
מחקרים אלה מחזורי תאים באמצעות תמציות ביצה צפרדע רפואית בעיקר התבססו על מדידות בצובר. עם זאת, התגובה בצובר קונבנציונאלי מבחני עשוי לא לחקות התנהגויות תא אמיתי, בהתחשב פער גדול הממדים שלהם, subcellular מידור המרחבי של מולקולות התגובה. יתר על כן, מדידות בכמות גדולה של פעילויות mitotic נוטים לתת מספר מוגבל של מחזורים לפני דעיכת במהירות8. החסרונות של תגובות בצובר למנוע את תמצית למערכת לספק נוסף להבנה של מאפיינים דינאמי שעון מורכבים ופונקציות. מחקרים שנעשו לאחרונה יש אנקפסולציה ללא תא cytostatic בבידוד-פקטור (CSF) צפרדע רפואית תמציות19,20 לתוך מוגדרת על-ידי גודל תא דמוי מדורים, סייעו להבהיר איך לגודל צירים הוא מווסת על ידי נפח cytoplasmic. עם זאת, מערכת זו במבחנה נעצר בשדה מפה של מיוזה II על ידי הפעולה של גורם cytostatic1, מערכת מסוגלת לטווח ארוך מתמשכת תנודות ברמת התא היחיד שנדרש לחקירה נוספת של מחזור התא מתנד.
ללמוד מחזור התא תנודות ברזולוציה של תא בודד, פיתחנו של התא-סולם, מערכת תפוקה גבוהה למפת המדידה בו זמנית מספר תהליכי מתנדנדות עצמית מתמשכת mitotic microemulsion בודדים טיפות. בפרוטוקול זה וידאו מפורט, נדגים על הקמת מערכת תנודה mitotic מלאכותי על ידי לבצע רכיבת אופניים הציטופלסמה ביצה זריזה צפרדע רפואית ב microemulsions בגדלים החל מ 10 מיקרומטר 300. במערכת זו, היו תנודות mitotic כולל כרומוזום עיבוי, דה-עיבוי, התמוטטות מעטפת הגרעין, הרפורמציה, השפלה ואת סינתזה של סובסטרטים "אנאפאזה" (למשל, securin-mCherry ב פרוטוקול זה) בהצלחה מחדש.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="593">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Xenopus laevis frogs</td>
			<td style="width:93px;">Xenopus-I Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">QIAprep spin miniprep kit</td>
			<td style="width:93px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">27104</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">QIAquick PCR Purification Kit (250)</td>
			<td style="width:93px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">28106</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td>
			<td style="width:93px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM1340</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">BL21 (DE3)-T-1 competent cell</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B2935</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Calcium ionophore</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A23187</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B2261</td>
			<td style="width:167px;">Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Trichloro</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">448931</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;">Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl) silane</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:215px;">PFPE-PEG surfactant</td>
			<td style="width:93px;">Ran Biotechnologies</td>
			<td style="width:119px;">008-FluoroSurfactant-2wtH-50G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">GE Healthcare Glutathione Sepharose 4B beads</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">GE17-0756-01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">PD-10 column</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">GE17-0851-01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">VitroCom miniature hollow glass tubing</td>
			<td style="width:93px;">VitroCom</td>
			<td style="width:119px;">5012</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Olympus SZ61 Stereo Microscope</td>
			<td style="width:93px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Olympus IX83 microscope</td>
			<td style="width:93px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Olympus FV1200 confocal microscope</td>
			<td style="width:93px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">NanoDrop spectrophotometer</td>
			<td style="width:93px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:119px;">ND-2000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">0.4 mL Snap-Cap Microtubes</td>
			<td style="width:93px;">E&#38;K Scientific</td>
			<td style="width:119px;">485050-B</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="54" rowspan="2" style="height:55px;width:215px;">&#160;PureLink RNA Mini Kit</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">ThermoFisher&#65288;Ambion&#65289;</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">12183018A</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Fisherbrand Analog Vortex Mixer</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">2215365</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Imaris</td>
			<td style="width:93px;">Bitplane</td>
			<td style="width:119px;">Version 7.3</td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of cell-cycle oscillations in microemulsions of cell-free xenopus egg extracts

בזמן אמת מדידה של תנודות ברמת תא בודד חשוב לחשוף את המנגנונים של שעונים ביולוגיים. למרות תמציות בצובר להכין מביצים צפרדע רפואית זריזה היה חזק בניתוח רשתות הביוכימי שבבסיס את התקדמות מחזור התא, מדידה הממוצע שלהם אנסמבל בדרך כלל מוביל לאי תנודה לח, למרות כל אחד מתנד בודדים עם השיתופן. זאת בשל הקושי של סנכרון מושלם בין מתנדים בודדים במערכות ביולוגיות רועש. כדי לאחזר את הדינמיקה תא בודד של מתנד, פיתחנו מערכת מבוססת-droplet תא מלאכותיים יכולים לשקם מחזורים mitotic בתאים קטנים לבצע רכיבת אופניים cytoplasmic תמציות של צפרדע רפואית זריזה ביצים. תאים פשוטים אלה cytoplasmic בלבד התערוכה תנודות ממושכת מעל 30 מחזורים. כדי לבנות יותר מסובך תאים עם גרעינים, הוספנו demembranated כרומטין הזרע כדי לעורר את הגרעינים הרכבה עצמית במערכת. הבחנו התקדמות תקופתיים של כרומוזום עיבוי/decondensation, גרעינים אופפים התמוטטות/הרפורמציה, כמו תאים אמיתיים. אפשרות זו מציינת כי מתנד mitotic מתפקד בנאמנות להסיע מספר אירועים mitotic במורד הזרם. במקביל איתרנו את הדינמיקה של מתנד mitotic ואת התהליכים במורד הזרם droplets בודדים באמצעות מיקרוסקופ רב ערוצית זריחה זמן לשגות. מערכת מחזור התא המלאכותי מספק מסגרת תפוקה גבוהה עבור מניפולציה כמותיים וניתוח של תנודות mitotic עם רזולוציה מתא בודד, אשר סביר להניח מספק תובנות חשובות מכונות רגולטוריות והפונקציות של השעון.

איור 2, אנו מראים כי פרוטוקול זה מייצרת תנודות mitotic הן פשוטות, ללא גרעיני תאים, כמו גם מסובך תאים עם גרעינים, איפה מתנד כוננים ההתחלפות מחזורית של היווצרות גרעינים, דפורמציה. טיפות ללא גרעינים יוצרות תנודות mitotic למעלה כדי 30 מחזורים undamped מעל משך הזמן של 92 שעות...

Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts at JoVE.com

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

אנו מציגים שיטה לדור של במבחנה עצמית מתמשכת mitotic תנודות ברמת תא בודד על-ידי לבצע תמציות ביצה של צפרדע רפואית זריזה microemulsions מים בתוך שמן.

שיחזור התנודות מחזור התא ב- Microemulsions של תמציות ביצה ללא תא צפרדע רפואית

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

שיטה זו יכולה לסייע לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של המערכת, כגון מנגנון הוויסות שמאחורי הרשת המיטוטית והמאפיינים והפונקציות הדינמיים של שעון מחזור התא. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא תיצור כמות גדולה של טיפות עם מחזורי תאים מרובים בכל אחד, מתן לנו מסגרת תפוקה גבוהה עבור מניפולציה כמותית וניתוח. ראשית, השליכו קבוצות ביצים שיש להן גבולות לא ברורים בין מוטות בעלי חיים וצמחייה או כתמים לבנים לא סדירים על גבי מוטות בעלי חיים.לאחר מכן, בחר קבוצה מתאימה של ביצים מצפרדע אחת, והעבר את הביצים לסקייה של 600 מיליליטר. יוצקים עודף של חיץ MMR 0.2x, ומוסיפים בעדינות ציסטאין במאגר תמצית 1x לביצים. לאחר מכן, לנער את הסלק במרץ ביד כדי להסיר את מעילי ג'לי של הביצים.חזור על שטיפה זו שלוש פעמים עם סך של 800 מיליליטר של חיץ ציסטאין או עד הביצים לצבור להתיישב בתחתית הפוף. לאחר הסרת מעיל הג'לי, לשטוף את הביצים ארבע פעמים בליטר אחד של 0.2x פתרון MMR. השתמש פיפטה זכוכית להרים ולהשליך את הביצים להפוך לבן.יוצקים את מאגר MMR מתוך התוך המק, ומוסיפים 200 מיליליטר של תות תוסף סידן יונופור לתוך הביצים. השתמש פיפטה זכוכית כדי לערבב את הביצים בעדינות עד שהם מופעלים, ולהסיר את פתרון הסידן יונופור. השארת הביצים בתספור סידן יונופור במשך זמן רב מדי תיזום אפופטוזיס.אנחנו מערבבים את הביצים במשך 1.5 דקות ולבדוק את יעילות ההפעלה. אם הם אינם מופעלים, חזור לערבב ובדוק בתדירות גבוהה יותר עד להשגת הפעלה של 90%.. לאחר שהביצים מתיישבות בתחתית הסקילר, בדוק את יעילות ההפעלה.ביצים מופעלות היטב יש כ 25% של מוט החיה ו 75% של מוט הצמחייה. לאחר מכן, לשטוף את הביצים פעמיים עם נפח כולל של 50 מיליליטר של חיץ תמצית בתוספת מעכבי פרוטאז. לאחר מכן, מעבירים בזהירות את הביצים למיקרו-צינור Snap-cap של 0.4 מיליליטר.צנטריפוגה microtube במשך 60 שניות ב 200 גרם ולאחר מכן ב 600 גרם במשך 30 שניות כדי לארוז את הביצים. לאחר מכן, השתמש פיפטה פסטר זכוכית כדי להסיר את המאגר עודף על גבי הביצים לאחר כל שלב. לאחר מכן, למחוץ את הביצים ב 15, 000 גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.השתמש סכין גילוח כדי לחתוך את הצינורות כדי להפריד את שלוש שכבות של ביצים כתוש ולשמור על ציטופלסמה גולמית בשכבה האמצעית. לאחר מכן, להעביר את הציטופלסמה הגולמית כדי לנקות צינורות אולטרהצנטריפוגה. להשלים את הציטופלסמה עם מעכבי פרוטאז ו cytochalasin B ב 10 מיקרוגרם למיליליטר כל אחד.צנטריפוגה ציטופלסמה גולמית ב 15, 000 גרם וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לאחר מכן, השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך את הצינור ולשמור את הציטופלסמה בשכבה האמצעית. מניחים את התמציות הטריות המוכנות על קרח.ראשית, להוסיף securin-mCherry mRNA לתמציות מוכנות. לאחר מכן, הוסיפו 200 מיקרוליטרים של 2%PFPE-PEG פלואורו-פרקטיקה לתערובת תמצית mRNA. השתמש מערבל מערבולת כדי ליצור טיפות, התאמת מהירות המערבולת ומשך לפי הצורך.לאחר מכן, לבדוק חזותית את טיפות כדי להבטיח שהם אחידים בגודל. באמצעות פיפטה 200 מיקרוליטר, להעביר את טיפות צף על גבי נפח שווה של פעילי שטח לצינור PCR. טובלים צינור זכוכית בשכבת טיפה, ומחכים עד שהטפסות ימלאו כ-75% מהצינור.לאחר מכן, לדחוף את הצינור לתוך השכבה פעילי שטח, ולמלא את הצינור לחלוטין. לאחר מכן, מלאו צלחת עם תחתית זכוכית בשמן מינרלי. לאחר מכן, השתמש פינצטה בסדר לטבול את הצינור מלא טיפה בשמן.השתמש פיפטה זכוכית כדי להסיר את כל פסולת גלויה או טיפות דלף. כדי למנוע תנועה ודליפת טיפות, צינור הזכוכית מלא טיפות צריך להיות שקוע מתחת לשמן מינרלי בזהירות. אנחנו יכולים גם לדחוף את הצינור בשני הקצוות עם איזון או להוסיף כמה טיפות של שמן מינרלי על קצות הצינור בו זמנית הראשון.לאחר מכן, השתמש במיקרוסקופ epifluorescence המצויד בשלב xy ממונע כדי לדמיין את טיפות. הקלט קטעי וידאו לשגות זמן בשדה הבהיר וערוצי פלואורסצנטיות מרובים כל שש עד תשע דקות עד טיפות לאבד את פעילותם. באמצעות פרוטוקול זה, תנודות מיוטיות בתאים פשוטים, ללא גרעין ותאים מסובכים עם גרעינים יוצרו.טיפות ללא גרעינים יצרו תנודות מיתוטיות עד 30 מחזורים לא מבושלים במשך 92 שעות. כמו כן נבחנה היכולת של מתנד המיטוטי לנהוג במורד הזרם. המתנד המיטוטי המתמשך דחף את השינויים של המורפולוגיה הגרעינית שנצפתה באמצעות שינוי אוטונומי של שלבי מחזור תאים נפרדים.בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור את הזמן בעת ביצוע התמצית, כפי שהוא זמן רגיש, ותמיד לשמור את הביצים לחלץ על קרח. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה לחוקרים בתחום הביולוגיה של המערכת לחקור עקרונות בסיסיים של תכונות שעון מורכבות, כמוtunability ושטוצ'סטיות בקסנופוס לאבס.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

כינון של נוקלאוזום עם דיפרנציאלי איזוטופ שכותרתו היסטונים אחות

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

מתח הידוק פלואומטריה ב<em&gt; קסנופוס</em&gt; ביציות באמצעות חומצות אמינו פלואורסצנטי לא טבעי

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

טיהור, בנייתו מחדש של TRPV1 לניתוח Spectroscopic

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

קרינה פלואורסצנטית Live-תא הדמיה של שלמה וגטטיבי תא מחזור של חיידק חברתית גידול איטי Myxococcus xanthus

Fluorescence live-cell imaging of bacterial cells is a key method in the analysis of the spatial and temporal dynamics of proteins and chromosomes ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

במבחנה בנייתו מחדש של דפוסי חלבון ב- Bilayers הנתמכים השומנים ארגון-עצמי

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

לומד RNA Interactors של חלבון ה-RNA-מופעל במהלך מחזור התא בתרבית

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

קוונפיקציה מוחלטת של מטבוליזם החלבון ללא שימוש בפרוטאין על-ידי היפוך-שלב נוזלי כרומטוגרפיה המסה-ספקטרומטריה

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

העשרה של רקמות מיונקים וקסנפוס אוציטים עם כולסטרול

Cholesterol enrichment of mammalian tissues and cells, including Xenopus oocytes used for studying cell function, can be accomplished using a variety of ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

ייצור ללא תאים של פרוטאוליפוזומים לניתוח פונקציונלי ופיתוח נוגדנים המכוונים לחלבוני ממברנה

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

אתר ספציפי ליסין אצטילציה של היסטונים עבור שחזור Nucleosome באמצעות הרחבת קוד גנטי ב Escherichia קולי

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...