Name: reconstitution of cell-cycle oscillations in microemulsions of cell-free xenopus egg extracts
Uploaded: 2018-09-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts at JoVE.com

हम Madeleine लू के निर्माण के लिए धंयवाद securin-mCherry प्लाज्मिड, गोद आदमी ली, केनेथ हो और एलन पी लियू छोटी बूंद पीढ़ी के बारे में विचार विमर्श के लिए, जेरेमी बी चांग और जेंस ई. Ferrell GFP प्रदान करने के लिए जूनियर-एनएलएस का निर्माण । इस काम को राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (अर्ली करियर ग्रांट #1553031), स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (मीरा #GM119688), और एक Sloan रिसर्च फेलोशिप द्वारा समर्थित किया गया ।

सभी विधियां यहां वर्णित संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) मिशिगन विश्वविद्यालय के द्वारा अनुमोदित किया गया है ।
1. सेल चक्र पुनर्गठन और पता लगाने के लिए सामग्री की तैयारी
<ol><li>
गिब्सन ?...

<ol>
	<li>Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+extracts.">Cell cycle extracts.</a> Methods in Cell Biology. 36, 581-605 (1991).</li><li>Hannak, E., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+mitotic+spindle+assembly+and+function+in+vitro+using+Xenopus+laevis+egg+extracts.">Investigating mitotic spindle assembly and function in vitro using Xenopus laevis egg extracts.</a> Nature Protocols. 1, 2305-2314 (2006).</li><li>Murray, A. W., Solomon, M. J., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cyclin+synthesis+and+degradation+in+the+control+of+maturation+promoting+factor+activity.">The role of cyclin synthesis and degradation in the control of maturation promoting factor activity.</a> Nature. 339, 280-286 (1989).</li><li>Yang, Q., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cdk1-APC/C+cell+cycle+oscillator+circuit+functions+as+a+time-delayed,+ultrasensitive+switch.">The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch.</a> Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).</li><li>Chang, J. B., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+trigger+waves+and+the+spatial+coordination+of+the+Xenopus+cell+cycle.">Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle.</a> Nature. 500, 603-607 (2013).</li><li>Trunnell, N. B., Poon, A. C., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitivity+in+the+Regulation+of+Cdc25C+by+Cdk1.">Ultrasensitivity in the Regulation of Cdc25C by Cdk1.</a> Molecular Cell. 41, 263-274 (2011).</li><li>Kim, S. Y., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+competition+as+a+source+of+ultrasensitivity+in+the+inactivation+of+Wee1.">Substrate competition as a source of ultrasensitivity in the inactivation of Wee1.</a> Cell. 128, 1133-1145 (2007).</li><li>Pomerening, J. R., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems-level+dissection+of+the+cell-cycle+oscillator:+bypassing+positive+feedback+produces+damped+oscillations.">Systems-level dissection of the cell-cycle oscillator: bypassing positive feedback produces damped oscillations.</a> Cell. 122, 565-578 (2005).</li><li>Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+a+cell+cycle+oscillator:+hysteresis+and+bistability+in+the+activation+of+Cdc2.">Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2.</a> Nature Cell Biology. 5, 346-351 (2003).</li><li>Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aster+migration+determines+the+length+scale+of+nuclear+separation+in+the+Drosophila+syncytial+embryo.">Aster migration determines the length scale of nuclear separation in the Drosophila syncytial embryo.</a> The Journal of Cell Biology. 197, 887-895 (2012).</li><li>Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+Drosophila+embryo+extract+for+the+study+of+mitosis+ex+vivo.">A single Drosophila embryo extract for the study of mitosis ex vivo.</a> Nature Protocols. 8, 310-324 (2013).</li><li>Tsai, T. Y. C., Theriot, J. A., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+Oscillatory+Dynamics+in+the+Cell+Cycle+of+Early+Xenopus+laevis+Embryos.">Changes in Oscillatory Dynamics in the Cell Cycle of Early Xenopus laevis Embryos.</a> PLoS Biology. 12, e1001788 (2014).</li><li>Chang, J. B., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+trigger+waves+and+the+spatial+coordination+of+the+Xenopus+cell+cycle.">Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle.</a> Nature. 500, 603-607 (2013).</li><li>Yang, Q., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cdk1-APC/C+cell+cycle+oscillator+circuit+functions+as+a+time-delayed,+ultrasensitive+switch.">The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch.</a> Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).</li><li>Kumagai, A., Dunphy, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claspin,+a+novel+protein+required+for+the+activation+of+Chk1+during+a+DNA+replication+checkpoint+response+in+Xenopus+egg+extracts.">Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts.</a> Molecular Cell. 6, 839-849 (2000).</li><li>Chen, R. H., Murray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+spindle+assembly+checkpoint+in+Xenopus+egg+extracts.">Characterization of spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts.</a> Methods in Enzymology. 283, 572-584 (1997).</li><li>Chen, R. H., Waters, J. C., Salmon, E. D., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+spindle+assembly+checkpoint+component+XMAD2+with+unattached+kinetochores.">Association of spindle assembly checkpoint component XMAD2 with unattached kinetochores.</a> Science. 274, 242-246 (1996).</li><li>Minshull, J., Sun, H., Tonks, N. K., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+MAP+kinase-dependent+spindle+assembly+checkpoint+in+Xenopus+egg+extracts.">A MAP kinase-dependent spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts.</a> Cell. 79, 475-486 (1994).</li><li>Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+Volume+Modulates+Spindle+Size+During+Embryogenesis.">Cytoplasmic Volume Modulates Spindle Size During Embryogenesis.</a> Science. 342, 856-860 (2013).</li><li>Hazel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+cytoplasmic+volume+are+sufficient+to+drive+spindle+scaling.">Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling.</a> Science. 342, 853-856 (2013).</li><li>Garibyan, L., Avashia, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+Techniques+Made+Simple:+Polymerase+Chain+Reaction+(PCR).">Research Techniques Made Simple: Polymerase Chain Reaction (PCR).</a> The Journal of Investigative Dermatology. 133, e6 (2013).</li><li>Hecker, K. H., Roux, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+and+low+annealing+temperatures+increase+both+specificity+and+yield+in+touchdown+and+stepdown+PCR.">High and low annealing temperatures increase both specificity and yield in touchdown and stepdown PCR.</a> BioTechniques. 20, 478-485 (1996).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6, 343-345 (2009).</li><li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Plasmid+DNA+into+E.+coli+Using+the+Heat+Shock+Method.">Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method.</a> Journal of Visualized Experiments. 6, e253 (2007).</li><li>Torreilles, S. L., McClure, D. E., Green, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+and+refinement+of+euthanasia+methods+for+Xenopus+laevis.">Evaluation and refinement of euthanasia methods for Xenopus laevis.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48, 512-516 (2009).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+Xenopus+laevis+Testes.">Isolating Xenopus laevis Testes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2007, (2007).</li><li>Showell, C., Conlon, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Egg+Collection+and+In+vitro+Fertilization+of+the+Western+Clawed+Frog+Xenopus+tropicalis.">Egg Collection and In vitro Fertilization of the Western Clawed Frog Xenopus tropicalis.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).</li><li>Wilson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 91, 236-247 (1983).</li><li>Schutze, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+protocol+for+emulsion+polymerase+chain+reaction+and+subsequent+purification.">A streamlined protocol for emulsion polymerase chain reaction and subsequent purification.</a> Analytical Biochemistry. 410, 155-157 (2011).</li><li>Weitz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+in+the+dynamical+behaviour+of+a+compartmentalized+programmable+biochemical+oscillator.">Diversity in the dynamical behaviour of a compartmentalized programmable biochemical oscillator.</a> Nature Chemistry. 6, 295-302 (2014).</li><li>Ho, K. K., Lee, J. W., Durand, G., Majumder, S., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+with+poly(vinyl)+alcohol+surfactant+reduces+double+emulsion-encapsulated+mammalian+cell-free+expression.">Protein aggregation with poly(vinyl) alcohol surfactant reduces double emulsion-encapsulated mammalian cell-free expression.</a> PloS One. 12, e0174689 (2017).</li><li>Nakajima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+circadian+oscillation+of+cyanobacterial+KaiC+phosphorylation+in+vitro.">Reconstitution of circadian oscillation of cyanobacterial KaiC phosphorylation in vitro.</a> Science. 308, 414-415 (2005).</li><li>Guan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+tunable+mitotic+oscillator+in+artificial+cells.">A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells.</a> eLife. 7, (2018).</li></ol>

हम एक उच्च प्रवाह कृत्रिम कोशिका प्रणाली के विकास के लिए एक उपंयास विधि प्रस्तुत किया है कि इन विट्रो में सक्षम बनाता है पुनर्गठन और दीर्घकालिक ट्रैकिंग स्वयं की-निरंतर सेल-चक्र दोलनों पर एकल-कक्ष ...

Xenopus laevis अंडे से तैयार Cytoplasmic अर्क कोशिका चक्र के जैव रासायनिक अध्ययन के लिए सबसे प्रमुख मॉडलों में से एक का प्रतिनिधित्व करते हैं, अंडाणुओं की बड़ी मात्रा को देखते हुए, तेजी से कोशिका चक्र प्रगति, और पुनर्गठन की क्षमता इन विट्रो मेंmitotic घटनाओं1,2. इस प्रणाली प्रारंभिक खोज और आवश्यक सेल के यंत्रवत लक्षण वर्णन की अनुमति दी है-परिपक्वता को बढ़ावा देने के कारक की तरह चक्र नियामकों (MPF) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से बहाव mitotic धुरी विधानसभा और गुणसूत्र अलगाव 1 सहित प्रक्रियाओं ,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11. Xenopus egg अर्क भी सेल चक्र घड़ी8,12,13,14 के विनियामक नेटवर्क के विस्तृत विच्छेदन के लिए इस्तेमाल किया गया है और डीएनए क्षति के अध्ययन के लिए /replication चौकी15 और mitotic धुरी विधानसभा चौकी16,17,18।
कोशिका चक्र के इन अध्ययनों Xenopus अंडे के अर्क का उपयोग मुख्य रूप से थोक माप के आधार पर किया गया है । हालांकि, पारंपरिक थोक प्रतिक्रिया परख असली सेल व्यवहार की नकल नहीं कर सकते हैं, उनके आयामों और प्रतिक्रिया अणुओं के उपसेलुलर स्थानिक compartmentalization में एक प्रमुख विसंगति दी । इसके अलावा, mitotic गतिविधियों के थोक माप जल्दी से8भिगोने से पहले चक्र की एक सीमित संख्या देने के लिए प्रवण हैं । बल्क प्रतिक्रियाओं का ये नुकसान जटिल घड़ी गतिशील गुणों और कार्यों के आगे की समझ प्रदान करने के लिए निकालने प्रणाली को रोका है । हाल के अध्ययनों से सेल-मुक्त cytostatic फैक्टर encapsulated है-गिरफ्तार (सीएसएफ) Xenopus अर्क19,20 आकार में परिभाषित सेल-डिब्बों की तरह है, जो मदद की है स्पष्ट कैसे धुरी आकार द्वारा संग्राहक है cytoplasmic मात्रा । हालांकि, इस में इन विट्रो सिस्टम cytostatic फैक्टर1की कार्रवाई द्वारा अर्धसूत्रीविभाजन द्वितीय के metaphase में गिरफ्तार किया है, और एक लंबे समय तक निरंतर दोलनों में सक्षम एक प्रणाली सेल के स्तर पर आगे की जांच के लिए सेल चक्र की जरूरत है थरथरानवाला.
एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन के साथ सेल चक्र दोलनों का अध्ययन करने के लिए, हमने एक सेल-स्केल, उच्च-प्रवाह प्रणाली को पुनर्गठन के लिए विकसित किया है और व्यक्तिगत microemulsion में कई स्वयं-निरंतर mitotic थरथरानवाला प्रक्रियाओं का एक साथ माप बूंदों. इस विस्तृत वीडियो प्रोटोकॉल में, हम 10 से ३०० microemulsions को लेकर आकारों के µm में साइकलिंग Xenopus laevis एग कोशिका द्रव्य encapsulating द्वारा कृत्रिम mitotic दोलन प्रणाली के निर्माण का प्रदर्शन करते हैं । इस प्रणाली में, mitotic दोलनों गुणसूत्र संघनित्र और de-संघनित्र, परमाणु लिफाफा टूटने और सुधार, और anaphase सब्सट्रेट (जैसे, securin-mCherry के इस प्रोटोकॉल में) की गिरावट और संश्लेषण शामिल थे सफलतापूर्वक पुनर्गठन किया गया ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="593">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Xenopus laevis frogs</td>
			<td style="width:93px;">Xenopus-I Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">QIAprep spin miniprep kit</td>
			<td style="width:93px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">27104</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">QIAquick PCR Purification Kit (250)</td>
			<td style="width:93px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">28106</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td>
			<td style="width:93px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM1340</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">BL21 (DE3)-T-1 competent cell</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B2935</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Calcium ionophore</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A23187</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B2261</td>
			<td style="width:167px;">Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Trichloro</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">448931</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;">Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl) silane</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:215px;">PFPE-PEG surfactant</td>
			<td style="width:93px;">Ran Biotechnologies</td>
			<td style="width:119px;">008-FluoroSurfactant-2wtH-50G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">GE Healthcare Glutathione Sepharose 4B beads</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">GE17-0756-01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">PD-10 column</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">GE17-0851-01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">VitroCom miniature hollow glass tubing</td>
			<td style="width:93px;">VitroCom</td>
			<td style="width:119px;">5012</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Olympus SZ61 Stereo Microscope</td>
			<td style="width:93px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Olympus IX83 microscope</td>
			<td style="width:93px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Olympus FV1200 confocal microscope</td>
			<td style="width:93px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">NanoDrop spectrophotometer</td>
			<td style="width:93px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:119px;">ND-2000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">0.4 mL Snap-Cap Microtubes</td>
			<td style="width:93px;">E&#38;K Scientific</td>
			<td style="width:119px;">485050-B</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="54" rowspan="2" style="height:55px;width:215px;">&#160;PureLink RNA Mini Kit</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">ThermoFisher&#65288;Ambion&#65289;</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">12183018A</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Fisherbrand Analog Vortex Mixer</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">2215365</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Imaris</td>
			<td style="width:93px;">Bitplane</td>
			<td style="width:119px;">Version 7.3</td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of cell-cycle oscillations in microemulsions of cell-free xenopus egg extracts

एकल-कक्ष स्तर पर दोलनों का वास्तविक समय मापन जैविक घड़ियों के तंत्र को उजागर करने के लिए महत्वपूर्ण है । हालांकि थोक अर्क Xenopus laevis अंडे से तैयार कोशिका चक्र की प्रगति अंतर्निहित जैव रासायनिक नेटवर्क विदारक में शक्तिशाली किया गया है, उनके पहनावा औसत माप आम तौर पर एक नम दोलन करने के लिए सुराग, प्रत्येक के बावजूद व्यक्तिगत थरथरानवाला लगातार किया जा रहा है । यह शोर जैविक प्रणालियों में व्यक्तिगत oscillators के बीच सही तुल्यकालन की कठिनाई के कारण है. थरथरानवाला के एकल सेल गतिशीलता को पुनः प्राप्त करने के लिए, हम एक छोटी बूंद-आधारित कृत्रिम सेल प्रणाली है कि सेल की तरह डिब्बों में mitotic चक्र का पुनर्गठन कर सकते है विकसित Xenopus laevis अंडे की साइकिल चालन cytoplasmic निष्कर्षों encapsulating । इन सरल cytoplasmic केवल कोशिकाओं पर 30 से अधिक चक्र के लिए निरंतर दोलनों का प्रदर्शन । नाभिक के साथ और अधिक जटिल कोशिकाओं का निर्माण करने के लिए, हम demembranated शुक्राणु क्रोमेटिन प्रणाली में नाभिक स्वयं विधानसभा ट्रिगर करने के लिए कहा । हम वास्तविक कोशिकाओं में की तरह गुणसूत्र संघनित्र//विरूपण और नाभिक ढंक टूट/सुधार की आवधिक प्रगति मनाया । यह इंगित करता है कि mitotic थरथरानवाला कार्यों ईमानदारी से कई बहाव mitotic घटनाओं ड्राइव करने के लिए । हम एक साथ बहु चैनल समय चूक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर व्यक्तिगत बूंदों में mitotic थरथरानवाला और बहाव की प्रक्रियाओं की गतिशीलता पर नज़र रखी । कृत्रिम कोशिका चक्र प्रणाली मात्रात्मक हेरफेर और एकल सेल संकल्प के साथ mitotic दोलनों के विश्लेषण के लिए एक उच्च प्रवाह ढांचा प्रदान करता है, जो की संभावना नियामक मशीनरी और कार्यों में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करता है घड़ी ।

चित्रा 2में, हम बताते हैं कि इस प्रोटोकॉल mitotic दोलनों दोनों सरल, परमाणु मुक्त कोशिकाओं में के रूप में अच्छी तरह से नाभिक, जहां थरथरानवाला नाभिक गठन और विकृति के चक्रीय बारी ड्राइव ?...

Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts at JoVE.com

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

हम इन विट्रो में स्व-निरंतर mitotic दोलनों की पीढ़ी के लिए एक विधि वर्तमान में Xenopus laevis के अंडे के अर्क encapsulating द्वारा पानी में तेल microemulsions ।

सेल-प्रकोष्ठ के Microemulsions में चक्र दोलनों का पुनर्गठन-मुक्त Xenopus Egg अर्क

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

यह विधि सिस्टम जीव विज्ञान क्षेत्र में महत्वपूर्ण प्रश्नों के उत्तर देने में मदद कर सकती है, जैसे मिटोटिक नेटवर्क के पीछे विनियमन तंत्र और कोशिका चक्र घड़ी के गतिशील गुण और कार्य। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह प्रत्येक में कई सेल चक्रों के साथ बड़ी मात्रा में बूंदों को उत्पन्न करेगा, जो हमें मात्रात्मक हेरफेर और विश्लेषण के लिए एक उच्च-थ्रूपुट फ्रेमवर्क प्रदान करेगा। शुरू करने के लिए, अंडे के बैचों को त्यागें जिनमें पशु और वनस्पति ध्रुवों या पशु ध्रुवों के शीर्ष पर अनियमित सफेद धब्बे के बीच अस्पष्ट सीमाएं हैं।इसके बाद, एक मादा मेंढक से अंडे के एक उपयुक्त बैच का चयन करें, और अंडे को 600-मिलीलीटर बीकर में स्थानांतरित करें। 0.2x एमएमआर बफर की अधिकता डालें, और धीरे-धीरे अंडे में 1x निकालने बफर में सिस्टीन जोड़ें। इसके बाद अंडे के जेली कोट को हटाने के लिए बीकर को हाथ से जोर से हिलाएं।इस धोने को तीन बार सिस्टीन बफर के कुल 800 मिलीलीटर के साथ दोहराएं या अंडे कुल होने तक और बीकर के तल पर व्यवस्थित न करें। जेली कोट निकालने के बाद, अंडे को 0.2x एमएमआर समाधान के एक लीटर में चार बार धोएं। सफेद बारी है कि अंडे लेने और त्यागने के लिए एक गिलास पिपेट का प्रयोग करें।बीकर से एमएमआर बफर डालो, और अंडे में कैल्शियम आयनोफोर समाधान के 200 मिलीलीटर जोड़ें। अंडे को धीरे-धीरे हिलाने के लिए ग्लास पिपेट का उपयोग करें जब तक कि वे सक्रिय न हो जाएं, और कैल्शियम आयनोफोर समाधान को हटा दें। अंडे को कैल्शियम आयनोफोर समाधान में बहुत लंबे समय तक छोड़ने से एपोप्टोसिस शुरू हो जाएगा।हम अंडे को 1.5 मिनट तक हिलाते हैं और सक्रियण दक्षता की जांच करते हैं। यदि वे सक्रिय नहीं हैं, तो सरगर्मी फिर से शुरू करें, और 90% सक्रियण प्राप्त होने तक अधिक बार जांच करें। अंडे बीकर के तल पर बसने के बाद, सक्रियण दक्षता की जांच करें।अच्छी तरह से सक्रिय अंडे में लगभग 25% पशु ध्रुव और वनस्पति ध्रुव का 75% होता है। इसके बाद, अंडे को दो बार एक्सटीज़ अवरोधकों के साथ पूरक एक्सट्रैक्ट बफर के 50 मिलीलीटर की कुल मात्रा के साथ धोएं। फिर, ध्यान से अंडे को 0.4-मिलीलीटर स्नैप-कैप माइक्रोट्यूब में स्थानांतरित करें।200 ग्राम पर 60 सेकंड के लिए माइक्रोट्यूब को सेंट्रलाइज करें और फिर अंडे पैक करने के लिए 30 सेकंड के लिए 600 ग्राम पर। फिर, प्रत्येक चरण के बाद अंडे के शीर्ष पर अतिरिक्त बफर को हटाने के लिए एक ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग करें। इसके बाद अंडे को 15, 000 ग्राम पर 10 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर क्रश करें।कुचल अंडे की तीन परतों को अलग करने और कच्चे साइटोप्लाज्म को बीच की परत में रखने के लिए ट्यूबों को काटने के लिए रेजर ब्लेड का उपयोग करें। फिर, अल्ट्रासेंट्रफ्यूज ट्यूबों को साफ करने के लिए क्रूड साइटोप्लाज्म को स्थानांतरित करें। साइटोप्लाज्म को प्रोटीज अवरोधकों और साइटोचलासिन बी के साथ 10 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर प्रत्येक में पूरक करें।पांच मिनट के लिए 15, 000 ग्राम और चार डिग्री सेल्सियस पर क्रूड साइटोप्लाज्म को सेंट्रलाइज करें। फिर, ट्यूब को काटने और साइटोप्लाज्म को बीच की परत में रखने के लिए रेजर ब्लेड का उपयोग करें। ताजा तैयार अर्क को बर्फ पर रखें।सबसे पहले, तैयार अर्क में सिक्योरिन-म्हेरी एमआरएनए जोड़ें। इसके बाद, निकालने एमआरएनए मिश्रण में 2% पीएफपीई-खूंटी फ्लोरोसर्जार्थंट के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें। बूंदों को उत्पन्न करने के लिए भंवर मिक्सर का उपयोग करें, भंवर की गति और आवश्यकतानुसार अवधि को समायोजित करें।फिर, नेत्रहीन बूंदों का निरीक्षण करने के लिए सुनिश्चित करें कि वे आकार में एक समान हैं । 200-माइक्रोलीटर पिपेट का उपयोग करके, शीर्ष पर तैरती बूंदों को स्थानांतरित करें और एक पीसीआर ट्यूब में सर्फेक्टेंट की बराबर मात्रा। बूंद परत में एक गिलास ट्यूब डुबकी, और बूंदों ट्यूब के लगभग ७५% भरने तक इंतजार ।फिर, ट्यूब को सर्फेक्टेंट परत में धकेलें, और ट्यूब को पूरी तरह से भर दें। इसके बाद, खनिज तेल के साथ एक गिलास तली हुई डिश भरें। फिर, तेल में बूंद से भरी ट्यूब विसर्जित करने के लिए ठीक चिमटी का उपयोग करें।किसी भी दिखाई मलबे या लीक बूंदों को हटाने के लिए एक ग्लास पिपेट का उपयोग करें। बूंदों के मूवमेंट और रिसाव से बचने के लिए बूंदों से भरी कांच की नली को मिनरल ऑयल के नीचे सावधानी से डुबो देना चाहिए। हम या तो संतुलन के साथ दोनों सिरों पर ट्यूब धक्का या ट्यूब के सिरों पर खनिज तेल की कुछ बूंदें एक साथ पहले जोड़ सकते हैं ।इसके बाद, बूंदों को छवि देने के लिए मोटराइज्ड जाइल चरण से लैस एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। उज्ज्वल क्षेत्र और कई फ्लोरेसेंस चैनलों में रिकॉर्ड समय-चूक वीडियो हर छह से नौ मिनट में जब तक बूंदों अपनी गतिविधि खो देते हैं । इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, नाभिक के साथ सरल, परमाणु मुक्त कोशिकाओं और जटिल कोशिकाओं दोनों में माइटोटिक दोलन का उत्पादन किया गया था।नाभिक मुक्त बूंदों ने 92 घंटे से अधिक 30 अण्डाकारित चक्रों तक मिटोटिक दोलन उत्पन्न किया। डाउनस्ट्रीम माइटोटिक घटनाओं को चलाने के लिए माइटोटिक ऑसिलेटर की क्षमता की भी जांच की गई। स्व-निरंतर माइटोटिक ऑसिलेटर ने अलग-अलग सेल-चक्र चरणों के स्वायत्त परिवर्तन के माध्यम से मनाए गए परमाणु आकृति विज्ञान के परिवर्तनों को खदेड़ दिया।इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय, निकालने के समय को ध्यान में रखना याद रखना महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह समय के प्रति संवेदनशील है, और हमेशा अंडे और बर्फ पर निकालने के लिए रखते हैं। इसके विकास के बाद, इस तकनीक ने सिस्टम जीव विज्ञान के क्षेत्र में शोधकर्ताओं के लिए जटिल घड़ी गुणों के मौलिक सिद्धांतों का पता लगाने का मार्ग प्रशस्त किया, जैसे ज़ेनोपस लेविस में ट्यूनेबिलिटी और स्टोचस्टिकिटी।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

विभिन्न आइसोटोप लेबल बहन histones साथ nucleosomes का पुनर्गठन

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

वोल्टेज क्लैंप फ्लोराइट्री में<em&gt; Xenopus</em&gt; फ्लोरोसेंट अस्वास्थ्यकर एमिनो एसिड का प्रयोग करने वाले ओक्साइट्स

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

स्पेक्ट्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए TRPV1 का शुद्धिकरण और पुनर्गठन

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

धीमी गति से बढ़ती सामाजिक जीवाणु Myxococcus xanthus के पूर्ण वनस्पति कोशिका चक्र के प्रतिदीप्ति लाइव-सेल इमेजिंग

Fluorescence live-cell imaging of bacterial cells is a key method in the analysis of the spatial and temporal dynamics of proteins and chromosomes ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

इन विट्रो में स्व का पुनर्गठन-समर्थित लिपिड Bilayers पर प्रोटीन पैटर्न का आयोजन

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

स्तनधारी कोशिका चक्र के दौरान सक्रिय प्रोटीन काइनेज आरएनए के आरएनए इंटरएक्टर्स का अध्ययन

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

उलट-चरण तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा सेल मुक्त प्रोटीन संश्लेषण चयापचय का निरपेक्ष क्वांटिफिकेशन

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

कोलेस्ट्रॉल के साथ स्तनधारी ऊतकों और ज़ेनोपस ओसाइट्स का संवर्धन

Cholesterol enrichment of mammalian tissues and cells, including Xenopus oocytes used for studying cell function, can be accomplished using a variety of ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

झिल्ली प्रोटीन को लक्षित करने वाले कार्यात्मक विश्लेषण और एंटीबॉडी विकास के लिए प्रोटियोलिपोसोम का सेल-मुक्त उत्पादन

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

एस्चेरिचिया कोलाई में जेनेटिक कोड विस्तार का उपयोग करके न्यूक्लियोसोम पुनर्गठन के लिए हिस्टोन्स की साइट विशिष्ट लाइसिन एसिटिलेशन

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...