Name: reconstitution of cell-cycle oscillations in microemulsions of cell-free xenopus egg extracts
Uploaded: 2018-09-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts at JoVE.com

Ringraziamo Madeleine Lu per la costruzione del plasmide securin-mCherry, Lap Man Lee, Kenneth Ho e Allen P Liu per una discussione sulla generazione della gocciolina, Jeremy B. Chang e James E. Ferrell Jr per la fornitura di CHE GFP-NLS costruire. Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Science Foundation (inizio carriera Grant n. 1553031), il National Institutes of Health (MIRA #GM119688) e un assegno di ricerca di Sloan.

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) dell'Università del Michigan.
1. preparazione dei materiali per il rilevamento e la ricostituzione del ciclo cellulare
<ol><li>
Assemblea di Gibson clonazione per la costruzione del DNA del plasmide e la purificazione di mRNA di securin-mCherry
	<ol>
<li>Preparare tre frammenti di DNA, tra cui una spina dorsale di vettore di pMTB2, securin e mCherry tramite reazione a cat...

<ol>
	<li>Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+extracts.">Cell cycle extracts.</a> Methods in Cell Biology. 36, 581-605 (1991).</li><li>Hannak, E., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+mitotic+spindle+assembly+and+function+in+vitro+using+Xenopus+laevis+egg+extracts.">Investigating mitotic spindle assembly and function in vitro using Xenopus laevis egg extracts.</a> Nature Protocols. 1, 2305-2314 (2006).</li><li>Murray, A. W., Solomon, M. J., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cyclin+synthesis+and+degradation+in+the+control+of+maturation+promoting+factor+activity.">The role of cyclin synthesis and degradation in the control of maturation promoting factor activity.</a> Nature. 339, 280-286 (1989).</li><li>Yang, Q., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cdk1-APC/C+cell+cycle+oscillator+circuit+functions+as+a+time-delayed,+ultrasensitive+switch.">The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch.</a> Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).</li><li>Chang, J. B., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+trigger+waves+and+the+spatial+coordination+of+the+Xenopus+cell+cycle.">Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle.</a> Nature. 500, 603-607 (2013).</li><li>Trunnell, N. B., Poon, A. C., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitivity+in+the+Regulation+of+Cdc25C+by+Cdk1.">Ultrasensitivity in the Regulation of Cdc25C by Cdk1.</a> Molecular Cell. 41, 263-274 (2011).</li><li>Kim, S. Y., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+competition+as+a+source+of+ultrasensitivity+in+the+inactivation+of+Wee1.">Substrate competition as a source of ultrasensitivity in the inactivation of Wee1.</a> Cell. 128, 1133-1145 (2007).</li><li>Pomerening, J. R., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems-level+dissection+of+the+cell-cycle+oscillator:+bypassing+positive+feedback+produces+damped+oscillations.">Systems-level dissection of the cell-cycle oscillator: bypassing positive feedback produces damped oscillations.</a> Cell. 122, 565-578 (2005).</li><li>Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+a+cell+cycle+oscillator:+hysteresis+and+bistability+in+the+activation+of+Cdc2.">Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2.</a> Nature Cell Biology. 5, 346-351 (2003).</li><li>Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aster+migration+determines+the+length+scale+of+nuclear+separation+in+the+Drosophila+syncytial+embryo.">Aster migration determines the length scale of nuclear separation in the Drosophila syncytial embryo.</a> The Journal of Cell Biology. 197, 887-895 (2012).</li><li>Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+Drosophila+embryo+extract+for+the+study+of+mitosis+ex+vivo.">A single Drosophila embryo extract for the study of mitosis ex vivo.</a> Nature Protocols. 8, 310-324 (2013).</li><li>Tsai, T. Y. C., Theriot, J. A., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+Oscillatory+Dynamics+in+the+Cell+Cycle+of+Early+Xenopus+laevis+Embryos.">Changes in Oscillatory Dynamics in the Cell Cycle of Early Xenopus laevis Embryos.</a> PLoS Biology. 12, e1001788 (2014).</li><li>Chang, J. B., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+trigger+waves+and+the+spatial+coordination+of+the+Xenopus+cell+cycle.">Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle.</a> Nature. 500, 603-607 (2013).</li><li>Yang, Q., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cdk1-APC/C+cell+cycle+oscillator+circuit+functions+as+a+time-delayed,+ultrasensitive+switch.">The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch.</a> Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).</li><li>Kumagai, A., Dunphy, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claspin,+a+novel+protein+required+for+the+activation+of+Chk1+during+a+DNA+replication+checkpoint+response+in+Xenopus+egg+extracts.">Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts.</a> Molecular Cell. 6, 839-849 (2000).</li><li>Chen, R. H., Murray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+spindle+assembly+checkpoint+in+Xenopus+egg+extracts.">Characterization of spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts.</a> Methods in Enzymology. 283, 572-584 (1997).</li><li>Chen, R. H., Waters, J. C., Salmon, E. D., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+spindle+assembly+checkpoint+component+XMAD2+with+unattached+kinetochores.">Association of spindle assembly checkpoint component XMAD2 with unattached kinetochores.</a> Science. 274, 242-246 (1996).</li><li>Minshull, J., Sun, H., Tonks, N. K., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+MAP+kinase-dependent+spindle+assembly+checkpoint+in+Xenopus+egg+extracts.">A MAP kinase-dependent spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts.</a> Cell. 79, 475-486 (1994).</li><li>Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+Volume+Modulates+Spindle+Size+During+Embryogenesis.">Cytoplasmic Volume Modulates Spindle Size During Embryogenesis.</a> Science. 342, 856-860 (2013).</li><li>Hazel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+cytoplasmic+volume+are+sufficient+to+drive+spindle+scaling.">Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling.</a> Science. 342, 853-856 (2013).</li><li>Garibyan, L., Avashia, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+Techniques+Made+Simple:+Polymerase+Chain+Reaction+(PCR).">Research Techniques Made Simple: Polymerase Chain Reaction (PCR).</a> The Journal of Investigative Dermatology. 133, e6 (2013).</li><li>Hecker, K. H., Roux, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+and+low+annealing+temperatures+increase+both+specificity+and+yield+in+touchdown+and+stepdown+PCR.">High and low annealing temperatures increase both specificity and yield in touchdown and stepdown PCR.</a> BioTechniques. 20, 478-485 (1996).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6, 343-345 (2009).</li><li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Plasmid+DNA+into+E.+coli+Using+the+Heat+Shock+Method.">Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method.</a> Journal of Visualized Experiments. 6, e253 (2007).</li><li>Torreilles, S. L., McClure, D. E., Green, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+and+refinement+of+euthanasia+methods+for+Xenopus+laevis.">Evaluation and refinement of euthanasia methods for Xenopus laevis.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48, 512-516 (2009).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+Xenopus+laevis+Testes.">Isolating Xenopus laevis Testes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2007, (2007).</li><li>Showell, C., Conlon, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Egg+Collection+and+In+vitro+Fertilization+of+the+Western+Clawed+Frog+Xenopus+tropicalis.">Egg Collection and In vitro Fertilization of the Western Clawed Frog Xenopus tropicalis.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).</li><li>Wilson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 91, 236-247 (1983).</li><li>Schutze, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+protocol+for+emulsion+polymerase+chain+reaction+and+subsequent+purification.">A streamlined protocol for emulsion polymerase chain reaction and subsequent purification.</a> Analytical Biochemistry. 410, 155-157 (2011).</li><li>Weitz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+in+the+dynamical+behaviour+of+a+compartmentalized+programmable+biochemical+oscillator.">Diversity in the dynamical behaviour of a compartmentalized programmable biochemical oscillator.</a> Nature Chemistry. 6, 295-302 (2014).</li><li>Ho, K. K., Lee, J. W., Durand, G., Majumder, S., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+with+poly(vinyl)+alcohol+surfactant+reduces+double+emulsion-encapsulated+mammalian+cell-free+expression.">Protein aggregation with poly(vinyl) alcohol surfactant reduces double emulsion-encapsulated mammalian cell-free expression.</a> PloS One. 12, e0174689 (2017).</li><li>Nakajima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+circadian+oscillation+of+cyanobacterial+KaiC+phosphorylation+in+vitro.">Reconstitution of circadian oscillation of cyanobacterial KaiC phosphorylation in vitro.</a> Science. 308, 414-415 (2005).</li><li>Guan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+tunable+mitotic+oscillator+in+artificial+cells.">A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells.</a> eLife. 7, (2018).</li></ol>

Abbiamo presentato un nuovo metodo per lo sviluppo di un sistema di alto-rendimento cellula artificiale che consente in vitro ricostituzione e il monitoraggio a lungo termine delle oscillazioni di ciclo cellulare auto-sostenuta a livello di singola cellula. Ci sono diversi passaggi critici che rendono questo metodo successo. Uova di Xenopus in primo luogo, appena spremute con una buona qualità, rispetto alle uova deposte, tendono a produrre estratti con attività di più lunga durata di oscillazione. I...

Estratti citoplasmatici preparati con uova di Xenopus laevis di rappresentano uno dei modelli più predominanti per lo studio biochimico dei cicli cellulari, dato il grande volume di ovociti, la progressione del ciclo cellulare rapida e la capacità di ricostituzione eventi mitotic in vitro1,2. Questo sistema ha permesso la scoperta iniziale e caratterizzazione meccanicistico di regolatori del ciclo cellulare essenziale come fattore di promozione di maturazione (MPF) così come i processi mitotici a valle tra cui spindle assembly e cromosoma segregazione1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11. Gli estratti di uovo di Xenopus sono stati utilizzati anche per la dissezione dettagliata delle reti regolatori del ciclo cellulare orologio8,12,13,14 e per gli studi del danno del DNA /Replication checkpoint15 e il fuso mitotico Assemblea checkpoint16,17,18.
Questi studi dei cicli cellulari usando gli estratti di uovo di Xenopus sono principalmente basati su misurazioni di massa. Tuttavia, analisi di reazione di massa convenzionale non possono imitare i comportamenti reali delle cellule, dati una discrepanza di maggiore dimensioni e subcellulare compartimentalizzazione spaziale delle molecole di reazione. Inoltre, misurazioni di massa di attività mitotica sono inclini a dare un numero limitato di cicli prima di smorzamento rapidamente8. Questi svantaggi delle reazioni di massa hanno impedito il sistema estratto per fornire ulteriore comprensione delle proprietà dinamiche complesse orologio e funzioni. Studi recenti hanno incapsulato senza cellula citostatico fattore-arrestato (CSF) Xenopus estrae19,20 in dimensione definita cellula-come compartimenti, che hanno contribuito a delucidare come dimensione del mandrino è modulata dalla volume citoplasmatico. Tuttavia, questo sistema in vitro è arrestato alla metafase della meiosi II dall'azione del fattore citostatico1, ed è necessario un sistema capace di oscillazioni sostenute a lungo termine a livello di singola cellula per ulteriori indagini del ciclo cellulare oscillatore.
Per studiare le oscillazioni del ciclo cellulare con cella singola risoluzione, abbiamo sviluppato una cella-scala, sistema ad alta produttività per la ricostituzione e la misura simultanea di più processi oscillatori mitotici autogestiti in microemulsione individuo goccioline. In questo protocollo dettagliato dei video, dimostriamo la creazione del sistema artificiale oscillazione mitotica incapsulando ciclismo citoplasma di uovo di Xenopus laevis in microemulsioni di dimensioni che vanno da 10 a 300 µm. In questo sistema, sono stati mitotiche oscillazioni tra cui condensazione cromosomica e de-condensazione, ripartizione busta nucleare e riforma e la degradazione e sintesi dei substrati anafase (ad es., securin-mCherry in questo protocollo) ricostituito con successo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="593">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Xenopus laevis frogs</td>
			<td style="width:93px;">Xenopus-I Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">QIAprep spin miniprep kit</td>
			<td style="width:93px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">27104</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">QIAquick PCR Purification Kit (250)</td>
			<td style="width:93px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">28106</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td>
			<td style="width:93px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM1340</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">BL21 (DE3)-T-1 competent cell</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B2935</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Calcium ionophore</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A23187</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B2261</td>
			<td style="width:167px;">Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Trichloro</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">448931</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;">Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl) silane</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:215px;">PFPE-PEG surfactant</td>
			<td style="width:93px;">Ran Biotechnologies</td>
			<td style="width:119px;">008-FluoroSurfactant-2wtH-50G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">GE Healthcare Glutathione Sepharose 4B beads</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">GE17-0756-01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">PD-10 column</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">GE17-0851-01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">VitroCom miniature hollow glass tubing</td>
			<td style="width:93px;">VitroCom</td>
			<td style="width:119px;">5012</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Olympus SZ61 Stereo Microscope</td>
			<td style="width:93px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Olympus IX83 microscope</td>
			<td style="width:93px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Olympus FV1200 confocal microscope</td>
			<td style="width:93px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">NanoDrop spectrophotometer</td>
			<td style="width:93px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:119px;">ND-2000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">0.4 mL Snap-Cap Microtubes</td>
			<td style="width:93px;">E&#38;K Scientific</td>
			<td style="width:119px;">485050-B</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="54" rowspan="2" style="height:55px;width:215px;">&#160;PureLink RNA Mini Kit</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">ThermoFisher&#65288;Ambion&#65289;</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">12183018A</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Fisherbrand Analog Vortex Mixer</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">2215365</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Imaris</td>
			<td style="width:93px;">Bitplane</td>
			<td style="width:119px;">Version 7.3</td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of cell-cycle oscillations in microemulsions of cell-free xenopus egg extracts

Misura in tempo reale delle oscillazioni a livello di singola cellula è importante scoprire i meccanismi di orologi biologici. Anche se alla rinfusa gli estratti preparati con uova di Xenopus laevis di sono stati potenti in reti biochimiche che sono alla base della progressione del ciclo cellulare di dissezione, loro misura media ensemble in genere porta ad un'oscillazione smorzata, nonostante ciascuno oscillatore individuale essendo sostenuta. Ciò è dovuto la difficoltà di sincronizzazione perfetta tra singoli oscillatori in sistemi biologici rumorosi. Per recuperare la cella singola dinamica dell'oscillatore, abbiamo sviluppato un sistema di cellula artificiale basata su goccia che può ricostituire mitotic cicli nei compartimenti di cellula-come incapsulare ciclismo estratti citoplasmatici di uova di Xenopus laevis . Queste semplici cellule solo citoplasmatici presentano oscillazioni sostenute per oltre 30 cicli. Per costruire più complicate cellule con i nuclei, abbiamo aggiunto della cromatina di sperma demembranated per attivare l'auto-assemblaggio nuclei nel sistema. Abbiamo osservato una progressione periodica del cromosoma condensazione/decondensazione e nuclei avvolgono ripartizione/riforma, come nelle celle reali. Questo indica che l'oscillatore mitotica funzioni fedelmente per guidare più a valle eventi mitotic. Contemporaneamente abbiamo rintracciato la dinamica dei processi a valle in goccioline individuali utilizzando la microscopia a fluorescenza time-lapse multi-canale e oscillatore mitotica. Il sistema di ciclo cellulare artificiale fornisce un framework di alto-rendimento per manipolazione quantitativa e l'analisi delle oscillazioni mitotiche con cella singola ad alta risoluzione, che probabilmente fornisce importanti intuizioni la regolamentazione macchine e funzioni di l'orologio.

In Figura 2, indichiamo che questo protocollo produce oscillazioni mitotiche in cellule semplici, senza nucleare così come complicate cellule con i nuclei, dove l'oscillatore spinge l'alternanza ciclica di formazione di nuclei e deformazione. Le goccioline privo di nuclei generano oscillazioni mitotiche fino a 30 cicli undamped nell'arco di tempo di 92 ore, come indicato dal periodico sintesi e degradazione di una fluorescenza reporter securin-mCherry (<stro...

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Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Presentiamo un metodo per la generazione di in vitro autosostenuto mitotica oscillazioni a livello di singola cellula incapsulando gli estratti di uovo di Xenopus laevis in microemulsioni di acqua in olio.

La ricostituzione delle oscillazioni del ciclo cellulare in microemulsioni di uovo senza cellula Xenopus estrae

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia dei sistemi, come il meccanismo di regolazione dietro la rete mitotica e le proprietà e le funzioni dinamiche dell'orologio del ciclo cellulare. Il vantaggio principale di questa tecnica è che genererà una grande quantità di goccioline con più cicli cellulari in ciascuno, fornendoci un framework ad alta produttività per la manipolazione e l'analisi quantitativa. Per iniziare, scartare lotti di uova che hanno confini poco chiari tra pali animali e vegetali o macchie bianche irregolari sopra i pali degli animali.Quindi, selezionare un lotto appropriato di uova da una rana femmina e trasferire le uova in un becher da 600 millilitri. Versare un eccesso di tampone MMR 0,2x e aggiungere delicatamente la cisteina in 1x tampone di estrazione alle uova. Dopo questo, agitare vigorosamente il becher a mano per rimuovere le meduse delle uova.Ripetere questo lavaggio tre volte con un totale di 800 millilitri di tampone di cisteina o fino a quando le uova si aggregano e si depositano sul fondo del becher. Dopo aver rimosso la medusa, lavare le uova quattro volte in un litro di soluzione MMR 0,2x. Usa una pipetta di vetro per raccogliere e scartare le uova che diventano bianche.Versare il tampone MMR dal becher e aggiungere 200 millilitri di soluzione di ionoforo di calcio nelle uova. Utilizzare una pipetta di vetro per mescolare delicatamente le uova fino a quando non vengono attivate e rimuovere la soluzione di ionoforo di calcio. Lasciare le uova in soluzione di ionoforo di calcio per troppo tempo inizierà l'apoptosi.Mescoliamo le uova per 1,5 minuti e controlliamo l'efficienza di attivazione. Se non vengono attivati, riprendere l'agitazione e controllare più frequentemente fino al 90% di attivazione. Dopo che le uova si depositano sul fondo del becher, controllare l'efficienza di attivazione.Le uova ben attivate hanno circa il 25% del polo animale e il 75% del polo vegetale. Successivamente, lavare le uova due volte con un volume totale di 50 millilitri di tampone di estrazione integrato con inibitori della proteasi. Quindi, trasferire attentamente le uova su un microtubo snap-cap da 0,4 millilitri.Centrifugare il microtubo per 60 secondi a 200 g e poi a 600 g per 30 secondi per imballare le uova. Quindi, utilizzare una pipetta Pasteur in vetro per rimuovere il buffer in eccesso sopra le uova dopo ogni passaggio. Dopo questo, schiacciare le uova a 15.000 g per 10 minuti a quattro gradi Celsius.Utilizzare una lama di rasoio per tagliare i tubi per separare i tre strati di uova schiacciate e mantenere il citoplasma grezzo nello strato intermedio. Quindi, trasferire il citoplasma grezzo per pulire i tubi ultracentrifugo. Integrare il citoplasma con inibitori della proteasi e citocalcasina B a 10 microgrammi per millilitro ciascuno.Centrifugare il citoplasma grezzo a 15.000 g e quattro gradi Celsius per cinque minuti. Quindi, utilizzare una lama di rasoio per tagliare il tubo e mantenere il citoplasma nello strato intermedio. Mettere gli estratti appena preparati sul ghiaccio.In primo luogo, aggiungere l'mRNA di cartolarizzazione-mCherry agli estratti preparati. Aggiungere quindi 200 microlitri di fluorosurfactant PFPE-PEG al fluorosurfactant estratto. Utilizzate un mixer vortice per generare goccioline, regolando la velocità e la durata del vortice in base alle esigenze.Quindi, ispezionare visivamente le goccioline per assicurarsi che siano di dimensioni uniformi. Utilizzando una pipetta da 200 microliter, trasferire le goccioline che galleggiano sulla parte superiore e un volume uguale di tensioattivi su un tubo PCR. Immergere un tubo di vetro nello strato di goccioline e attendere che le goccioline riempiano circa il 75% del tubo.Quindi, spingere il tubo nello strato tensioattivi e riempire completamente il tubo. Quindi, riempire un piatto con fondo di vetro con olio minerale. Quindi, utilizzare una pinzetta fine per immergere il tubo pieno di goccioline nell'olio.Utilizzare una pipetta di vetro per rimuovere eventuali detriti visibili o goccioline trapelate. Per evitare movimenti e perdite di goccioline, il tubo di vetro pieno di goccioline deve essere immerso con cura sotto l'olio minerale. Possiamo spingere il tubo su entrambe le estremità con equilibrio o aggiungere alcune gocce di olio minerale sulle estremità del tubo contemporaneamente prima.Successivamente, utilizzare un microscopio a epifluorescenza dotato di uno stadio xy motorizzato per immagini le goccioline. Registra video time-lapse nel campo luminoso e più canali di fluorescenza ogni sei-nove minuti fino a quando le goccioline perdono la loro attività. Utilizzando questo protocollo, sono state prodotte oscillazioni mitotiche sia in celle semplici e senza nucleare che in celle complicate con nuclei.Le goccioline senza nuclei hanno generato oscillazioni mitotiche fino a 30 cicli non smorzati nell'over 92 ore. È stata anche esaminata la capacità dell'oscillatore mitotico di guidare eventi mitotici a valle. L'oscillatore mitotico auto-sostenuto ha guidato i cambiamenti della morfologia nucleare osservati attraverso l'alterazione autonoma di distinte fasi del ciclo cellulare.Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare a mente il momento in cui si fa l'estratto, in quanto è sensibile al tempo, e tenere sempre le uova ed estrarre sul ghiaccio. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della biologia dei sistemi per esplorare i principi fondamentali delle proprietà complesse dell'orologio, come la tonnibilità e la stochasticity in Xenopus laevis.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Ricostituzione dei nucleosomi con differenzialmente marcati con isotopi sorelle istoni

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Ricerca

Biochimica

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Fluorescenza a tensione di serraggio in<em&gt; Xenopus</em&gt; Oociti che utilizzano aminoacidi innaturali fluorescenti

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

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Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

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Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

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Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

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