Name: reconstitution of cell-cycle oscillations in microemulsions of cell-free xenopus egg extracts
Uploaded: 2018-09-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts at JoVE.com

マドレーヌ Lu にありがとう GFP NLS を構築提供するためジェームス e. フェレル ジェレミー B. チャンと液滴生成に関する議論のためのアレン P 劉ケネス Ho ラップ男李 securin mCherry プラスミドを構築します。この作品は全米科学財団によって支えられた (早いキャリア助成金 #1553031)、健康の国民の協会 (ミラ #GM119688) とスローン研究員。

ここで説明するすべての方法は、制度的動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ミシガン大学によって承認されています。
1. 細胞周期の再構成と検出のための材料の準備
<ol><li>
ギブソン アセンブリ プラスミド DNA 構築と securin mCherry の mRNA 精製のクローニング
	<ol>
<li>PMTB2 ベクター バックボーン、securin、およびポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) を mCherry を含む 3 つ?...

<ol>
	<li>Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+extracts.">Cell cycle extracts.</a> Methods in Cell Biology. 36, 581-605 (1991).</li><li>Hannak, E., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+mitotic+spindle+assembly+and+function+in+vitro+using+Xenopus+laevis+egg+extracts.">Investigating mitotic spindle assembly and function in vitro using Xenopus laevis egg extracts.</a> Nature Protocols. 1, 2305-2314 (2006).</li><li>Murray, A. W., Solomon, M. J., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cyclin+synthesis+and+degradation+in+the+control+of+maturation+promoting+factor+activity.">The role of cyclin synthesis and degradation in the control of maturation promoting factor activity.</a> Nature. 339, 280-286 (1989).</li><li>Yang, Q., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cdk1-APC/C+cell+cycle+oscillator+circuit+functions+as+a+time-delayed,+ultrasensitive+switch.">The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch.</a> Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).</li><li>Chang, J. B., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+trigger+waves+and+the+spatial+coordination+of+the+Xenopus+cell+cycle.">Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle.</a> Nature. 500, 603-607 (2013).</li><li>Trunnell, N. B., Poon, A. C., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitivity+in+the+Regulation+of+Cdc25C+by+Cdk1.">Ultrasensitivity in the Regulation of Cdc25C by Cdk1.</a> Molecular Cell. 41, 263-274 (2011).</li><li>Kim, S. Y., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+competition+as+a+source+of+ultrasensitivity+in+the+inactivation+of+Wee1.">Substrate competition as a source of ultrasensitivity in the inactivation of Wee1.</a> Cell. 128, 1133-1145 (2007).</li><li>Pomerening, J. R., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems-level+dissection+of+the+cell-cycle+oscillator:+bypassing+positive+feedback+produces+damped+oscillations.">Systems-level dissection of the cell-cycle oscillator: bypassing positive feedback produces damped oscillations.</a> Cell. 122, 565-578 (2005).</li><li>Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+a+cell+cycle+oscillator:+hysteresis+and+bistability+in+the+activation+of+Cdc2.">Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2.</a> Nature Cell Biology. 5, 346-351 (2003).</li><li>Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aster+migration+determines+the+length+scale+of+nuclear+separation+in+the+Drosophila+syncytial+embryo.">Aster migration determines the length scale of nuclear separation in the Drosophila syncytial embryo.</a> The Journal of Cell Biology. 197, 887-895 (2012).</li><li>Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+Drosophila+embryo+extract+for+the+study+of+mitosis+ex+vivo.">A single Drosophila embryo extract for the study of mitosis ex vivo.</a> Nature Protocols. 8, 310-324 (2013).</li><li>Tsai, T. Y. C., Theriot, J. A., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+Oscillatory+Dynamics+in+the+Cell+Cycle+of+Early+Xenopus+laevis+Embryos.">Changes in Oscillatory Dynamics in the Cell Cycle of Early Xenopus laevis Embryos.</a> PLoS Biology. 12, e1001788 (2014).</li><li>Chang, J. B., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+trigger+waves+and+the+spatial+coordination+of+the+Xenopus+cell+cycle.">Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle.</a> Nature. 500, 603-607 (2013).</li><li>Yang, Q., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cdk1-APC/C+cell+cycle+oscillator+circuit+functions+as+a+time-delayed,+ultrasensitive+switch.">The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch.</a> Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).</li><li>Kumagai, A., Dunphy, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claspin,+a+novel+protein+required+for+the+activation+of+Chk1+during+a+DNA+replication+checkpoint+response+in+Xenopus+egg+extracts.">Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts.</a> Molecular Cell. 6, 839-849 (2000).</li><li>Chen, R. H., Murray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+spindle+assembly+checkpoint+in+Xenopus+egg+extracts.">Characterization of spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts.</a> Methods in Enzymology. 283, 572-584 (1997).</li><li>Chen, R. H., Waters, J. C., Salmon, E. D., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+spindle+assembly+checkpoint+component+XMAD2+with+unattached+kinetochores.">Association of spindle assembly checkpoint component XMAD2 with unattached kinetochores.</a> Science. 274, 242-246 (1996).</li><li>Minshull, J., Sun, H., Tonks, N. K., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+MAP+kinase-dependent+spindle+assembly+checkpoint+in+Xenopus+egg+extracts.">A MAP kinase-dependent spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts.</a> Cell. 79, 475-486 (1994).</li><li>Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+Volume+Modulates+Spindle+Size+During+Embryogenesis.">Cytoplasmic Volume Modulates Spindle Size During Embryogenesis.</a> Science. 342, 856-860 (2013).</li><li>Hazel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+cytoplasmic+volume+are+sufficient+to+drive+spindle+scaling.">Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling.</a> Science. 342, 853-856 (2013).</li><li>Garibyan, L., Avashia, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+Techniques+Made+Simple:+Polymerase+Chain+Reaction+(PCR).">Research Techniques Made Simple: Polymerase Chain Reaction (PCR).</a> The Journal of Investigative Dermatology. 133, e6 (2013).</li><li>Hecker, K. H., Roux, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+and+low+annealing+temperatures+increase+both+specificity+and+yield+in+touchdown+and+stepdown+PCR.">High and low annealing temperatures increase both specificity and yield in touchdown and stepdown PCR.</a> BioTechniques. 20, 478-485 (1996).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6, 343-345 (2009).</li><li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Plasmid+DNA+into+E.+coli+Using+the+Heat+Shock+Method.">Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method.</a> Journal of Visualized Experiments. 6, e253 (2007).</li><li>Torreilles, S. L., McClure, D. E., Green, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+and+refinement+of+euthanasia+methods+for+Xenopus+laevis.">Evaluation and refinement of euthanasia methods for Xenopus laevis.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48, 512-516 (2009).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+Xenopus+laevis+Testes.">Isolating Xenopus laevis Testes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2007, (2007).</li><li>Showell, C., Conlon, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Egg+Collection+and+In+vitro+Fertilization+of+the+Western+Clawed+Frog+Xenopus+tropicalis.">Egg Collection and In vitro Fertilization of the Western Clawed Frog Xenopus tropicalis.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).</li><li>Wilson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 91, 236-247 (1983).</li><li>Schutze, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+protocol+for+emulsion+polymerase+chain+reaction+and+subsequent+purification.">A streamlined protocol for emulsion polymerase chain reaction and subsequent purification.</a> Analytical Biochemistry. 410, 155-157 (2011).</li><li>Weitz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+in+the+dynamical+behaviour+of+a+compartmentalized+programmable+biochemical+oscillator.">Diversity in the dynamical behaviour of a compartmentalized programmable biochemical oscillator.</a> Nature Chemistry. 6, 295-302 (2014).</li><li>Ho, K. K., Lee, J. W., Durand, G., Majumder, S., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+with+poly(vinyl)+alcohol+surfactant+reduces+double+emulsion-encapsulated+mammalian+cell-free+expression.">Protein aggregation with poly(vinyl) alcohol surfactant reduces double emulsion-encapsulated mammalian cell-free expression.</a> PloS One. 12, e0174689 (2017).</li><li>Nakajima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+circadian+oscillation+of+cyanobacterial+KaiC+phosphorylation+in+vitro.">Reconstitution of circadian oscillation of cyanobacterial KaiC phosphorylation in vitro.</a> Science. 308, 414-415 (2005).</li><li>Guan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+tunable+mitotic+oscillator+in+artificial+cells.">A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells.</a> eLife. 7, (2018).</li></ol>

有効の試験管内再構成、単一細胞レベルで自律的な細胞周期振動の長期的な追跡高スループット人工細胞システムを開発するための手法を提案しました。このメソッドが成功するいくつかの重要な手順があります。良い品質で最初、絞りたてのアフリカツメガエル卵は卵と比較して、長く持続振動活動とエキスを生産する傾向があります。第二に、界面活性剤安定化微小内抽出?...

アフリカツメガエル卵から調製した細胞質のエキスを表す大量の卵母細胞、急速な細胞周期進行および再構成の機能を与え、細胞周期に関する生化学的研究の最も支配的なモデルの一つ分裂イベント体外1,2。初期検索と本質的な細胞周期調節因子の性質を含む下流の分裂プロセスと同様に成熟促進因子 (MPF) 紡錘アセンブリおよび染色体分離1 のようにこのシステムを許可しています。 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10、 11。アフリカツメガエル卵抽出液は、細胞周期クロック8,12,13,14の調節ネットワークの詳細な解剖、DNA 損傷の研究にも使用されています。/replication チェックポイント15と紡錘アセンブリ チェックポイント16,17,18。
アフリカツメガエル卵抽出液を用いた細胞周期のこれらの研究は、一括測定を主にに基づいています。しかし、従来のバルク反応アッセイは寸法、反応分子の細胞内空間区画の大きな矛盾を与えられた本当のセル動作をまねるかもしれない。また、分裂活動の一括測定は8をすばやく減衰する前にサイクルの限られた数を与えることになりやすいです。バルク反応のこれらの欠点は、さらに複雑なクロックの動的プロパティは、関数の理解を提供する抽出システムを妨げています。最近の研究を無細胞 cytostatic 要因逮捕 (CSF)アフリカツメガエルサイズ定義セルのような区画は、によってスピンドルのサイズを調整する方法の解明に貢献しているに19,20を抽出しカプセル化、細胞質の体積。しかし、この生体外でシステムは1は細胞増殖抑制因子との作用により減数分裂 II の中期で逮捕され、単一細胞レベルで長期的な持続的な振動の対応システムが細胞周期の研究の必要発振器。
単一セルの解像度と細胞周期振動の研究、細胞規模、再構成と複数の自律的な核分裂振動プロセスは個々 のマイクロエマル ジョンの同時測定のための高スループット システムを開発しました。水滴。この詳細なビデオ プロトコルでサイクリングアフリカツメガエル卵細胞質に至る 10 300 μ m サイズのマイクロエマル ジョンをカプセル化して人工細胞分裂振動システムの作成を示しています。このシステムは、染色体凝縮と解消凝縮、核膜崩壊と改革と合成と分解の後期基板 (例えば、 securin-mCherry このプロトコルで) を含む分裂の振動だった正常に再構成。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="593">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Xenopus laevis frogs</td>
			<td style="width:93px;">Xenopus-I Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">QIAprep spin miniprep kit</td>
			<td style="width:93px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">27104</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">QIAquick PCR Purification Kit (250)</td>
			<td style="width:93px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">28106</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td>
			<td style="width:93px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM1340</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">BL21 (DE3)-T-1 competent cell</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B2935</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Calcium ionophore</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A23187</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B2261</td>
			<td style="width:167px;">Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Trichloro</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">448931</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;">Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl) silane</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:215px;">PFPE-PEG surfactant</td>
			<td style="width:93px;">Ran Biotechnologies</td>
			<td style="width:119px;">008-FluoroSurfactant-2wtH-50G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">GE Healthcare Glutathione Sepharose 4B beads</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">GE17-0756-01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">PD-10 column</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">GE17-0851-01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">VitroCom miniature hollow glass tubing</td>
			<td style="width:93px;">VitroCom</td>
			<td style="width:119px;">5012</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Olympus SZ61 Stereo Microscope</td>
			<td style="width:93px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Olympus IX83 microscope</td>
			<td style="width:93px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Olympus FV1200 confocal microscope</td>
			<td style="width:93px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">NanoDrop spectrophotometer</td>
			<td style="width:93px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:119px;">ND-2000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">0.4 mL Snap-Cap Microtubes</td>
			<td style="width:93px;">E&#38;K Scientific</td>
			<td style="width:119px;">485050-B</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="54" rowspan="2" style="height:55px;width:215px;">&#160;PureLink RNA Mini Kit</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">ThermoFisher&#65288;Ambion&#65289;</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">12183018A</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Fisherbrand Analog Vortex Mixer</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">2215365</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Imaris</td>
			<td style="width:93px;">Bitplane</td>
			<td style="width:119px;">Version 7.3</td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of cell-cycle oscillations in microemulsions of cell-free xenopus egg extracts

単一細胞レベルの振動の実時間測定は、生物時計のメカニズムを明らかにすることが重要です。アフリカツメガエル卵から調製した一括抽出物は、細胞周期の進行を基になる生化学的なネットワークを切り裂くことに強力なされているが、彼らのアンサンブル平均測定が通常にもかかわらずそれぞれの減衰振動につながる個々 の発振器は支えられています。これは騒々しい生物システムで個々 の発振器の間で完全に同期の難しさのためです。発振器の単一細胞ダイナミクスを取得、アフリカツメガエル卵の細胞質抽出物サイクリングをカプセル化細胞のようなコンパートメントで分裂サイクルを再構築できる液滴を利用した人工細胞システムを開発しました。これらの単純型細胞質だけの細胞は、以上 30 サイクルの持続的な振動を展示します。複雑な細胞核を構築するには、我々 は自己組織システムの核をトリガーする鞭毛精子クロマチンを追加しました。私たちは染色体凝縮/decondensation の定期的な進行を観察し、核が実際の細胞のような内訳/改革を包みます。これは細胞分裂の発振器に複数のダウン ストリーム分裂イベントを駆動する忠実に機能することを示します。我々 は同時に分裂の発振器とマルチ チャネル タイムラプス蛍光顕微鏡を用いた個々 のしぶきの下流プロセスのダイナミクスを追跡しました。人工細胞周期システム定量的操作と単一セルの解像度、おそらく規制機械との機能に重要な洞察を提供する分裂振動解析の高スループット フレームワークを提供します。クロック。

図 2でこのプロトコルが複雑な細胞核、発振器が核形成と変形の繰返しの交替をドライブと同様、両方のシンプルで無料の核細胞における有糸分裂振動を生成することを示します。核無料液滴生成細胞分裂の振動を 30 不減衰サイクルに 92 時間の時間にわたって定期的な合成と、蛍光レポーター securin-mCherry (図 2 a) の劣化に...

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Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

油中水マイクロエマル ジョンのアフリカツメガエルの卵抽出液をカプセル化して単一細胞レベルでの細胞分裂自律振動体外の生成法を提案します。

携帯無料ツメガエル卵抽出液のマイクロエマル ジョンにおける細胞周期振動の再構成

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

この方法は、有糸分裂ネットワークの背後にある調節メカニズムや細胞周期時計の動的特性と機能など、システム生物学分野の主要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、それぞれに複数の細胞周期を持つ大量の液滴を生成し、定量的な操作と分析のためのハイスループットフレームワークを提供することです。まず、動物と植物の極の間に不明瞭な境界を持つ卵のバッチ、または動物の極の上に不規則な白い斑点を捨てます。次に、1匹のメスのカエルから卵の適切なバッチを選択し、卵を600ミリリットルのビーカーに移します。0.2倍のMMRバッファーを過剰に注ぎ、卵に1xエキスバッファーにシステインを静かに加えます。その後、ビーカーを手で激しく振って、卵のゼリーコートを取り除きます。合計800ミリリットルのシステインバッファーで、または卵が凝集し、ビーカーの底に落ち着くまで、この洗浄を3回繰り返します。ゼリーコートを取り除いた後、卵を0.2倍MMR溶液の1リットルで4回洗います。ガラスピペットを使用して、白くなる卵を拾って捨てます。ビーカーからMMRバッファーを注ぎ、卵に200ミリリットルのイオノフォア溶液を加えます。ガラスピペットを使用して卵が活性化されるまで軽くかき混ぜ、イオノフォアカルシウム溶液を取り除きます。卵をあまりにも長くイオノフォア溶液に残すと、アポトーシスが始まります。卵を1.5分間かき混ぜ、活性化効率を確認します。活性化されていない場合は、撹拌を再開し、90%活性化が達成されるまでより頻繁に確認してください。卵がビーカーの底に落ち着いたら、活性化効率を確認してください。よく活性化された卵は、動物の極の約25%と植物極の75%を有する。次に、プロテアーゼ阻害剤を添加した抽出バッファーの総容量50ミリリットルで卵を2回洗浄する。その後、慎重に0.4ミリリットルのスナップキャップマイクロチューブに卵を転送します。マイクロチューブを200gで60秒間遠心分離し、その後600gで30秒間送心して卵を詰めます。次に、ガラスパスツールピペットを使用して、各ステップの後に卵の上に余分なバッファーを取り除きます。この後、卵を摂氏4度で10分間10分間15,000gで粉砕します。カミソリの刃を使用してチューブを切断し、破砕卵の3層を分離し、粗い細胞質を中間層に保ちます。次いで、粗い細胞質を超遠心チューブを洗浄するために移します。細胞質をプロテアーゼ阻害剤とサイトカラシンBをそれぞれ1ミリリットルあたり10マイクログラムで補います。粗細胞質を15,000g、摂氏4度で5分間遠心します。次に、カミソリの刃を使用してチューブを切断し、中間層に細胞質を保ちます。作りたてのエキスを氷の上に置きます。まず、準備した抽出物にセクチン-mCherry mRNAを加えます。次に、抽出液mRNA混合物に2%PFPE-PEGフルオロサーファクタントの200マイクロリットルを加える。渦ミキサーを使用して液滴を生成し、必要に応じて渦の速度と持続時間を調整します。次に、液滴を視覚的に検査して、サイズが均一であることを確認します。200マイクロリットルのピペットを使用して、上に浮かぶ液滴と同量の界面活性剤をPCRチューブに移します。ガラス管を液滴層に浸し、液滴がチューブの約75%を満たすまで待ちます。次いで、チューブを界面活性剤層に押し込み、チューブを完全に充填します。次に、ガラス底の皿にミネラルオイルを入れます。次に、細かいピンセットを使用して、液滴入りチューブを油に浸します。ガラスピペットを使用して、目に見える破片や漏れた液滴を取り除きます。液滴の動きや漏れを避けるために、液滴で満たされたガラス管は慎重に鉱物油の下に浸漬する必要があります。バランスで両端のチューブを押すか、最初にチューブの端にミネラルオイルを数滴同時に加えることができます。この後、電動のキシステージを搭載した蛍光顕微鏡を使用して、液滴を画像化します。明るいフィールドと複数の蛍光チャンネルで、液滴が活動を失うまで、6〜9分ごとにタイムラプスビデオを記録します。このプロトコルを用いて、核を持つ単純な核のない細胞と複雑な細胞の両方で有糸振動が生じ出された。核のない液滴は、92時間にわたって最大30回の未減衰サイクルの有糸分裂を発生させた。また、下流の有糸分裂性事象を駆動する有糸発振器の能力も調べた。自立した有糸球体発振器は、異なる細胞周期相の自律的変化を通じて観察された核形態の変化を推進した。この手順を試みる間、それは時間に敏感であるように、抽出物を作るときの時間を覚えておくことが重要であり、常に氷の上に卵と抽出物を保ちます。その開発後、この技術は、システム生物学の分野の研究者が、ゼノプス・ラエビスのタンタンビリティやストカスティシティのような複雑な時計特性の基本原理を探求する道を開いた。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

示差同位体で標識された姉妹ヒストンとヌクレオソームの再構成

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

電圧クランプ<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;蛍光性の非天然アミノ酸を用いた卵母細胞

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

精製と TRPV1 の分光学的解析のための再構成

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

蛍光住セル完全の栄養細胞周期の遅い成長社会細菌Myxococcus ザンサス

Fluorescence live-cell imaging of bacterial cells is a key method in the analysis of the spatial and temporal dynamics of proteins and chromosomes ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

体外自己組織化人工脂質膜上のタンパク質パターンの再構成

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

哺乳類の細胞周期中に RNA 活性化蛋白質キナーゼの RNA インターアクターを勉強

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

逆相液体クロマトグラフィー-質量分析法による無細胞タンパク質合成代謝の絶対定量

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

哺乳類組織の富化とコレステロールを伴うゼノプス卵母細胞

Cholesterol enrichment of mammalian tissues and cells, including Xenopus oocytes used for studying cell function, can be accomplished using a variety of ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

膜タンパク質を標的とした機能解析と抗体開発のためのプロテオリポソームの無細胞生産

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

大腸菌の遺伝子コード拡張を用いた核組換えのためのヒストンの特異的なリジンアセチル化

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...

携帯無料ツメガエル卵抽出液のマイクロエマル ジョンにおける細胞周期振動の再構成

携帯無料ツメガエル卵抽出液のマイクロエマルジョンにおける細胞周期振動の再構成