Name: reconstitution of cell-cycle oscillations in microemulsions of cell-free xenopus egg extracts
Uploaded: 2018-09-27T14:30:00
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우리 감사 마들렌 루 securin mCherry 플라스 미드, 무릎 남자 리, 케네스 호 및 물방울 생성에 대 한 토론을 위한 알 렌 P Liu, 제레미 B. 장과 제임스 E. Ferrell Jr GFP NLS 구성 제공 하기 위한 건설. 이 작품은 국립 과학 재단에 의해 지원 되었다 (이른 경력 그랜트 #1553031), 건강의 국가 학회 (미 라 #GM119688), 및 슬론 연구 장학금.

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 미시간 대학에 의해 승인 되었습니다.
1. 세포 주기 재구성 및 탐지에 대 한 자료의 준비
<ol><li>
플라스 미드 DNA 건설과 securin mCherry의 mRNA 정화에 대 한 복제 깁슨 어셈블리
	<ol>
<li>PMTB2 벡터 백본, securin, 그리고 연쇄 반응 (PCR)을 통해 mCherry를 포함 하 여 3 개의 DNA 조각을 준비 하 고 정화<sup clas...

<ol>
	<li>Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+extracts.">Cell cycle extracts.</a> Methods in Cell Biology. 36, 581-605 (1991).</li><li>Hannak, E., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+mitotic+spindle+assembly+and+function+in+vitro+using+Xenopus+laevis+egg+extracts.">Investigating mitotic spindle assembly and function in vitro using Xenopus laevis egg extracts.</a> Nature Protocols. 1, 2305-2314 (2006).</li><li>Murray, A. W., Solomon, M. J., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cyclin+synthesis+and+degradation+in+the+control+of+maturation+promoting+factor+activity.">The role of cyclin synthesis and degradation in the control of maturation promoting factor activity.</a> Nature. 339, 280-286 (1989).</li><li>Yang, Q., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cdk1-APC/C+cell+cycle+oscillator+circuit+functions+as+a+time-delayed,+ultrasensitive+switch.">The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch.</a> Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).</li><li>Chang, J. B., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+trigger+waves+and+the+spatial+coordination+of+the+Xenopus+cell+cycle.">Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle.</a> Nature. 500, 603-607 (2013).</li><li>Trunnell, N. B., Poon, A. C., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitivity+in+the+Regulation+of+Cdc25C+by+Cdk1.">Ultrasensitivity in the Regulation of Cdc25C by Cdk1.</a> Molecular Cell. 41, 263-274 (2011).</li><li>Kim, S. Y., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+competition+as+a+source+of+ultrasensitivity+in+the+inactivation+of+Wee1.">Substrate competition as a source of ultrasensitivity in the inactivation of Wee1.</a> Cell. 128, 1133-1145 (2007).</li><li>Pomerening, J. R., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems-level+dissection+of+the+cell-cycle+oscillator:+bypassing+positive+feedback+produces+damped+oscillations.">Systems-level dissection of the cell-cycle oscillator: bypassing positive feedback produces damped oscillations.</a> Cell. 122, 565-578 (2005).</li><li>Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+a+cell+cycle+oscillator:+hysteresis+and+bistability+in+the+activation+of+Cdc2.">Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2.</a> Nature Cell Biology. 5, 346-351 (2003).</li><li>Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aster+migration+determines+the+length+scale+of+nuclear+separation+in+the+Drosophila+syncytial+embryo.">Aster migration determines the length scale of nuclear separation in the Drosophila syncytial embryo.</a> The Journal of Cell Biology. 197, 887-895 (2012).</li><li>Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+Drosophila+embryo+extract+for+the+study+of+mitosis+ex+vivo.">A single Drosophila embryo extract for the study of mitosis ex vivo.</a> Nature Protocols. 8, 310-324 (2013).</li><li>Tsai, T. Y. C., Theriot, J. A., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+Oscillatory+Dynamics+in+the+Cell+Cycle+of+Early+Xenopus+laevis+Embryos.">Changes in Oscillatory Dynamics in the Cell Cycle of Early Xenopus laevis Embryos.</a> PLoS Biology. 12, e1001788 (2014).</li><li>Chang, J. B., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+trigger+waves+and+the+spatial+coordination+of+the+Xenopus+cell+cycle.">Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle.</a> Nature. 500, 603-607 (2013).</li><li>Yang, Q., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cdk1-APC/C+cell+cycle+oscillator+circuit+functions+as+a+time-delayed,+ultrasensitive+switch.">The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch.</a> Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).</li><li>Kumagai, A., Dunphy, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claspin,+a+novel+protein+required+for+the+activation+of+Chk1+during+a+DNA+replication+checkpoint+response+in+Xenopus+egg+extracts.">Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts.</a> Molecular Cell. 6, 839-849 (2000).</li><li>Chen, R. H., Murray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+spindle+assembly+checkpoint+in+Xenopus+egg+extracts.">Characterization of spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts.</a> Methods in Enzymology. 283, 572-584 (1997).</li><li>Chen, R. H., Waters, J. C., Salmon, E. D., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+spindle+assembly+checkpoint+component+XMAD2+with+unattached+kinetochores.">Association of spindle assembly checkpoint component XMAD2 with unattached kinetochores.</a> Science. 274, 242-246 (1996).</li><li>Minshull, J., Sun, H., Tonks, N. K., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+MAP+kinase-dependent+spindle+assembly+checkpoint+in+Xenopus+egg+extracts.">A MAP kinase-dependent spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts.</a> Cell. 79, 475-486 (1994).</li><li>Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+Volume+Modulates+Spindle+Size+During+Embryogenesis.">Cytoplasmic Volume Modulates Spindle Size During Embryogenesis.</a> Science. 342, 856-860 (2013).</li><li>Hazel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+cytoplasmic+volume+are+sufficient+to+drive+spindle+scaling.">Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling.</a> Science. 342, 853-856 (2013).</li><li>Garibyan, L., Avashia, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+Techniques+Made+Simple:+Polymerase+Chain+Reaction+(PCR).">Research Techniques Made Simple: Polymerase Chain Reaction (PCR).</a> The Journal of Investigative Dermatology. 133, e6 (2013).</li><li>Hecker, K. H., Roux, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+and+low+annealing+temperatures+increase+both+specificity+and+yield+in+touchdown+and+stepdown+PCR.">High and low annealing temperatures increase both specificity and yield in touchdown and stepdown PCR.</a> BioTechniques. 20, 478-485 (1996).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6, 343-345 (2009).</li><li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Plasmid+DNA+into+E.+coli+Using+the+Heat+Shock+Method.">Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method.</a> Journal of Visualized Experiments. 6, e253 (2007).</li><li>Torreilles, S. L., McClure, D. E., Green, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+and+refinement+of+euthanasia+methods+for+Xenopus+laevis.">Evaluation and refinement of euthanasia methods for Xenopus laevis.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48, 512-516 (2009).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+Xenopus+laevis+Testes.">Isolating Xenopus laevis Testes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2007, (2007).</li><li>Showell, C., Conlon, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Egg+Collection+and+In+vitro+Fertilization+of+the+Western+Clawed+Frog+Xenopus+tropicalis.">Egg Collection and In vitro Fertilization of the Western Clawed Frog Xenopus tropicalis.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).</li><li>Wilson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 91, 236-247 (1983).</li><li>Schutze, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+protocol+for+emulsion+polymerase+chain+reaction+and+subsequent+purification.">A streamlined protocol for emulsion polymerase chain reaction and subsequent purification.</a> Analytical Biochemistry. 410, 155-157 (2011).</li><li>Weitz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+in+the+dynamical+behaviour+of+a+compartmentalized+programmable+biochemical+oscillator.">Diversity in the dynamical behaviour of a compartmentalized programmable biochemical oscillator.</a> Nature Chemistry. 6, 295-302 (2014).</li><li>Ho, K. K., Lee, J. W., Durand, G., Majumder, S., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+with+poly(vinyl)+alcohol+surfactant+reduces+double+emulsion-encapsulated+mammalian+cell-free+expression.">Protein aggregation with poly(vinyl) alcohol surfactant reduces double emulsion-encapsulated mammalian cell-free expression.</a> PloS One. 12, e0174689 (2017).</li><li>Nakajima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+circadian+oscillation+of+cyanobacterial+KaiC+phosphorylation+in+vitro.">Reconstitution of circadian oscillation of cyanobacterial KaiC phosphorylation in vitro.</a> Science. 308, 414-415 (2005).</li><li>Guan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+tunable+mitotic+oscillator+in+artificial+cells.">A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells.</a> eLife. 7, (2018).</li></ol>

우리는 그 수에 체 외 재구성 및 단일 세포 수준에서 자체 지속적인된 세포 주기 진동의 장기 추적 높은 처리량 인공 세포 시스템을 개발 하기 위한 새로운 방법을 제시 했습니다. 이 메서드를 성공 하는 몇 가지 중요 한 단계가 있습니다. 좋은 품질을 가진 첫 번째, 갓 Xenopus 달걀 누워 계란에 비해, 오래 지속 진동 활동 추출 물을 생산 하는 경향이 있다. 둘째, 계면 안정화 microenvironmen...

Xenopus laevis 계란에서 준비 하는 세포질 추출 물 중 가장 주된 모델 oocytes, 급속 한 세포 주기 진행 및 재구성 하는 능력의 큰 볼륨을 주어 세포 주기의 생화학 연구에 대 한 대표 mitotic 이벤트 체 외에서1,2. 이 시스템 초기 발견과 필수적인 세포 주기 레 귤 레이 터의 기계적 특성 등 다운스트림 mitotic 프로세스 뿐 아니라 성숙 촉진 인자 (MPF) 스핀 들 어셈블리 및 염색체 분리1 같은 수 있다 ,2,3,,45,6,7,8,9,10, 11. Xenopus 달걀 추출 물 또한 세포 주기 시계8,12,,1314 의 규제 네트워크의 상세한 해 부 및 DNA 손상의 연구에 대 한 사용 되었습니다. /replication 검사점15 그리고 mitotic 스핀 들 어셈블리 검사점16,,1718.
Xenopus 달걀 추출 물을 사용 하 여 셀의 이러한 연구는 주로 되었습니다 기반으로 대량 측정 합니다. 그러나, 기존의 대량 반응 분석 실제 셀 동작, 그들의 크기 및 반응 분자의 subcellular 공간 구획에 큰 차이가 주어 모방 하지 않을 수 있습니다. 또한, mitotic 활동의 대량 측정 전에 신속 하 게 감쇠8사이클의 제한 된 수를 주는 경향이 있다. 대량 반응의 이러한 단점 추가 복잡 한 시계 동적 속성 및 기능에 대 한 이해를 제공 하기 위해 추출 시스템을 방지 했습니다. 최근 연구는 셀 무료 cytostatic 요인 체포 (CSF) Xenopus 추출 물19,20 크기 정의 셀 같은 구획에 의해 스핀 들 크기는 변조 하는 방법을 명료 하 게 도운로 캡슐화는 세포질 볼륨입니다. 그러나,이 생체 외에서 시스템은 cytostatic 요소1의 행동에 의해 감수 제 2 분열의 분열에서 체포 하 고 세포 주기의 추가 조사에 대 한 단일 셀 수준에서 장기 지속적인된 진동 수 있는 시스템 필요 발진기입니다.
공부 하 고 단일 셀 해상도 세포 주기 진동, 우리 셀 규모, 재구성 및 개별 아사카에 여러 자기 지속적인된 mitotic 진동 프로세스의 동시 측정을 위한 높은 처리량의 시스템 개발 작은 물방울. 이 상세한 비디오 프로토콜에 10에서 300 µ m에 배열 하는 크기의 microemulsions에서 자전거 Xenopus laevis 계란 세포질을 캡슐화 하 여 인공 mitotic 진동 시스템의 창조를 설명 합니다. 이 시스템에서는, 염색체 응축과 드 응축, 핵 붕괴와 개혁, 그리고 저하 고 anaphase 기판 (예: securin-mCherry이 프로토콜에서)의 합성 등 mitotic 진동 했다 성공적으로 재구성 된다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="593">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Xenopus laevis frogs</td>
			<td style="width:93px;">Xenopus-I Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">QIAprep spin miniprep kit</td>
			<td style="width:93px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">27104</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">QIAquick PCR Purification Kit (250)</td>
			<td style="width:93px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">28106</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td>
			<td style="width:93px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM1340</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">BL21 (DE3)-T-1 competent cell</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B2935</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Calcium ionophore</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A23187</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B2261</td>
			<td style="width:167px;">Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Trichloro</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">448931</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;">Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl) silane</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:215px;">PFPE-PEG surfactant</td>
			<td style="width:93px;">Ran Biotechnologies</td>
			<td style="width:119px;">008-FluoroSurfactant-2wtH-50G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">GE Healthcare Glutathione Sepharose 4B beads</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">GE17-0756-01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">PD-10 column</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">GE17-0851-01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">VitroCom miniature hollow glass tubing</td>
			<td style="width:93px;">VitroCom</td>
			<td style="width:119px;">5012</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Olympus SZ61 Stereo Microscope</td>
			<td style="width:93px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Olympus IX83 microscope</td>
			<td style="width:93px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Olympus FV1200 confocal microscope</td>
			<td style="width:93px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">NanoDrop spectrophotometer</td>
			<td style="width:93px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:119px;">ND-2000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">0.4 mL Snap-Cap Microtubes</td>
			<td style="width:93px;">E&#38;K Scientific</td>
			<td style="width:119px;">485050-B</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="54" rowspan="2" style="height:55px;width:215px;">&#160;PureLink RNA Mini Kit</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">ThermoFisher&#65288;Ambion&#65289;</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">12183018A</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Fisherbrand Analog Vortex Mixer</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">2215365</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Imaris</td>
			<td style="width:93px;">Bitplane</td>
			<td style="width:119px;">Version 7.3</td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of cell-cycle oscillations in microemulsions of cell-free xenopus egg extracts

단일 셀 수준에서 진동의 실시간 측정 생물 시계의 메커니즘을 밝히기 위해서 중요 하다. 대량 추출 Xenopus laevis 계란에서 준비는 되어 있지만 생화학 네트워크 기본 세포 주기 진행을 해 부에 강력한, 그들의 앙상블 평균 측정 일반적으로 이끌어 각에 불구 하 고 감쇠 진동 지속 되는 개별 발진기 시끄러운 생물 학적 시스템에서 개별 발진기 간의 완벽 한 동기화의 어려움 때문입니다. 검색 하려면 발진기의 단일 셀 역학, 우리 셀 같은 구획 Xenopus laevis 계란의 자전거 세포질 추출 물을 캡슐화에 mitotic 사이클을 다시 구성할 수 있는 물방울 기반 인공 세포 시스템을 개발. 이러한 간단한 세포질 전용 셀 30 사이클에 대 한 지속적인된 진동 전시. 핵을 가진 더 복잡 한 세포를 구축, 우리는 demembranated 정자 염색 질 시스템에서 자기 조립 핵을 방 아 쇠를 추가. 우리 염색체 응축/decondensation의 정기적인 진행을 관찰 하 고 핵 실제 셀에 같은 고장/개혁, 봉투. 이 mitotic 발진기 여러 다운스트림 mitotic 이벤트를 충실 하 게 기능을 나타냅니다. 우리는 동시에 mitotic 발진기 및 다중 채널 시간 경과 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 개별 방울에 다운스트림 프로세스의 역학을 추적 합니다. 양적 조작 및 가능성이 규제 기계와의 기능에 중요 한 통찰력을 제공 하는 단일 셀 해상도, mitotic 진동의 분석을 위한 높은 처리량 프레임 워크를 제공 하는 인공 세포 주기 시스템 시계입니다.

그림 2, 우리는이 프로토콜 모두 간단 하 고, 핵 없는 세포로 핵, 복잡 한 셀 어디 발진기 핵 형성과 변형의 주기적 교체 드라이브 mitotic 진동 생산 표시 됩니다. 핵 없는 물방울 생성 mitotic 진동 최대 30 undamped 사이클에 92 시간의 기간 동안 정기적인 합성 한 형광 기자 securin-mCherry (그림 2A)의 저하에 의해 표시 된 대로. 복잡 한 APC/...

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Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

달걀 추출 물 물에서 기름 microemulsions에서 Xenopus laevis 의 캡슐화 하 여 방법을 생체 외에서 자기 지속적인된 mitotic 진동 단일 세포 수준에서의 세대를 위한 선물이.

Microemulsions 셀 무료 Xenopus 달걀 추출 물에서 세포 주기 진동의 재구성

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

이 방법은 미토성 네트워크 뒤에 있는 조절 기계장치 및 세포 주기 시계의 동적 속성 및 기능과 같은 시스템 생물학 필드에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 각각 다중 세포 주기가 있는 대량의 물방울을 생성하여 정량적 조작 및 분석을 위한 높은 처리량 프레임워크를 제공한다는 것입니다. 시작하려면 동물과 식물극 사이의 경계가 불분명한 계란의 배치 또는 동물 극 위에 불규칙한 흰색 반점이 있는 것을 폐기하십시오.다음으로, 한 여성 개구리에서 계란의 적절 한 배치를 선택 하 고 600 밀리 리터 비커에 계란을 전송. 0.2배MMR 버퍼를 과도하게 붓고, 1배 추출 버퍼에 시스테인을 달걀에 부드럽게 넣습니다. 그 후, 비커를 손으로 힘차게 흔들어 계란의 젤리 코트를 제거합니다.시스테인 버퍼의 총 800 밀리리터와 또는 계란이 집계하고 비커의 바닥에 정착 할 때까지세 번 이 세척을 반복합니다. 젤리 코트를 제거한 후 0.2x MMR 용액 1리터로 계란을 4회 세척합니다. 유리 파이펫을 사용하여 흰색으로 변하는 알을 집어 들고 버립니다.비커에서 MMR 버퍼를 붓고 200 밀리리터의 칼슘 이오노포어 용액을 계란에 넣습니다. 유리 파이펫을 사용하여 계란이 활성화될 때까지 부드럽게 저어주고, 칼슘 이오노포어 용액을 제거합니다. 너무 오랫동안 칼슘 이오노포어 용액에 계란을 두면 멸망을 시작할 수 있습니다.계란을 1.5분 간 저어서 활성화 효율을 확인합니다. 활성화되지 않은 경우 교반을 다시 시작하고 90%의 활성화가 이루어질 때까지 더 자주 확인합니다. 계란이 비커의 바닥에 정착 한 후 활성화 효율성을 확인하십시오.잘 활성화 된 계란은 동물 극의 약 25 %와 식물극의 75 %를 가지고 있습니다. 다음으로, 프로테아제 억제제로 보충된 추출물 버퍼의 총 부피 50 밀리리터로 계란을 두 번 씻으시면 됩니다. 그런 다음 계란을 0.4 밀리리터 스냅 캡 마이크로튜브로 조심스럽게 옮기습니다.마이크로튜브를 200g에서 60초 간 원심분리한 다음 600g에서 30초 간 계란을 포장합니다. 그런 다음 유리 파스퇴르 파이펫을 사용하여 각 단계 후 계란 위에 과도한 버퍼를 제거합니다. 그 후, 15, 000 g에서 4섭씨에서 10분간 계란을 분쇄하십시오.면도날을 사용하여 튜브를 잘라 서 세 겹의 으깬 달걀을 분리하고 중간 층에 조잡한 세포질을 유지합니다. 그런 다음, 조질 세포질을 옮겨 초원심분리기 튜브를 청소합니다. 프로테아제 억제제와 사이토찰라신 B를 각각 밀리리터당 10 마이크로그램으로 보충합니다.원유 세포질을 15, 000g, 섭씨 4도에서 5분간 원심분리합니다. 그런 다음 면도날을 사용하여 튜브를 자르고 중간 층에 세포질을 유지합니다. 갓 준비한 추출물을 얼음 위에 놓습니다.먼저, 준비된 추출물에 세큐린-mCherry mRNA를 첨가한다. 다음으로, 추출물 mRNA 혼합물에 2%PFPE-PEG 형광활성제의 200마이크로리터를 추가한다. 소용돌이 믹서를 사용하여 물방울을 생성하여 필요에 따라 소용돌이 속도와 지속 시간을 조정합니다.그런 다음 방울을 육안으로 검사하여 크기가 균일했는지 확인합니다. 200 마이크로리터 파이펫을 사용하여 위에 떠 있는 액적과 동일한 계면활성제를 PCR 튜브로 옮습니다. 유리 튜브를 물방울 층에 담그고 물방울이 튜브의 약 75 %를 채울 때까지 기다립니다.그런 다음 튜브를 계면활성제 층으로 밀어 넣고 튜브를 완전히 채웁니다. 다음으로, 유리 바닥 접시에 미네랄 오일을 채웁니다. 그런 다음 미세 핀셋을 사용하여 액적으로 채워진 튜브를 오일에 담급다.유리 파이펫을 사용하여 눈에 보이는 이물질이나 유출된 물방울을 제거합니다. 물방울의 움직임과 누출을 피하기 위해 물방울로 채워진 유리 튜브는 미네랄 오일 아래에 조심스럽게 침지되어야합니다. 양 끝에서 균형을 맞추거나 튜브 끝에 미네랄 오일 몇 방울을 동시에 추가할 수 있습니다.그 후, 전동식 xy 스테이지를 장착한 피형성 현미경을 사용하여 물방울을 이미지화한다. 물방울이 활동을 잃을 때까지 밝은 필드에 시간 경과 비디오를 기록하고 6 ~ 9 분마다 여러 형광 채널을 기록합니다. 이 프로토콜을 사용하여, 핵을 가진 간단한, 핵 없는 세포 및 복잡한 세포 둘 다에 있는 미토성 진동이 생성되었습니다.핵없는 방울은 92 시간 동안 최대 30 개의 무양 식 사이클을 생성했습니다. 하류 미토틱 이벤트를 구동하는 미토틱 발진기의 능력도 조사되었다. 자기 지탱된 미토틱 발진기는 뚜렷한 세포 주기 단계의 자율적 변경을 통해 관찰된 핵 형태학의 변화를 주도했습니다.이 절차를 시도하는 동안, 그것은 시간에 민감한, 추출을 만들 때 시간을 염두에 기억하는 것이 중요합니다, 항상 계란을 유지하고 얼음에 추출. 개발 후, 이 기술은 제노푸스 laevis의 튜닝성과 스토세서티와 같은 복잡한 시계 특성의 기본 원칙을 탐구하는 시스템 생물학 분야의 연구자들이 길을 열었습니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

된 유의 동위 원소 표지 자매 히스톤과 뉴 클레오의 재구성

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

연구

생화학

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

전압 클램프 형광 측정법<em&gt; Xenopus</em&gt; 형광성 비 자연 아미노산을 이용한 난 모세포

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

정화 및 분 광 분석에 대 한 TRPV1의 재구성

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

형광 라이브 셀 이미징의 완전 한 식물 세포의 주기 느린 성장 사회 박테리아 Myxococcus xanthus

Fluorescence live-cell imaging of bacterial cells is a key method in the analysis of the spatial and temporal dynamics of proteins and chromosomes ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

생체 외에서 자가 지원된 지질 Bilayers에 단백질 패턴 구성의 재구성

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

공부 하는 단백질 키 니 아 제 RNA 포유류 세포 주기 동안 활성의 RNA 인터

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

역상 액체 크로마토그래피-질량 분광법에 의한 무세포 단백질 합성 대사의 절대 정량화

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

포유류 조직과 콜레스테롤을 함유한 제노푸스 우세포의 농축

Cholesterol enrichment of mammalian tissues and cells, including Xenopus oocytes used for studying cell function, can be accomplished using a variety of ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

막 단백질을 표적으로 하는 기능 분석 및 항체 개발을 위한 프로테올리포좀의 무세포 생산

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

에체리치아 대장균의 유전코드 확장을 이용한 뉴클레오소성 재구성을 위한 히스톤의 특정 리신 아세틸화

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...