Name: reconstitution of cell-cycle oscillations in microemulsions of cell-free xenopus egg extracts
Uploaded: 2018-09-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts at JoVE.com

Vi takker Madeleine Lu konstruere securin mCherry plasmider, fanget mann Lee, Kenneth Ho og Allen P Liu for diskusjoner om slippverktøy generasjon, Jeremy B. Chang og James E. Ferrell Jr for å gi GFP-NLS konstruere. Dette arbeidet ble støttet av National Science Foundation (tidlige karriere Grant #1553031), National Institutes of Health (MIRA #GM119688) og en Sloan forskningsstipend.

Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) av University of Michigan.
1. utarbeidelse av materialer for cellen syklus rekonstituering og gjenkjenning
<ol><li>
Gibson montering kloning plasmider DNA og mRNA rensing av securin-mCherry
	<ol>
<li>Forberede tre DNA fragmenter inkludert pMTB2 vektor ryggraden, securin og mCherry gjennom polymerasekjedereaksjons (PCR) og gel rensing21,<s...

<ol>
	<li>Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+extracts.">Cell cycle extracts.</a> Methods in Cell Biology. 36, 581-605 (1991).</li><li>Hannak, E., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+mitotic+spindle+assembly+and+function+in+vitro+using+Xenopus+laevis+egg+extracts.">Investigating mitotic spindle assembly and function in vitro using Xenopus laevis egg extracts.</a> Nature Protocols. 1, 2305-2314 (2006).</li><li>Murray, A. W., Solomon, M. J., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cyclin+synthesis+and+degradation+in+the+control+of+maturation+promoting+factor+activity.">The role of cyclin synthesis and degradation in the control of maturation promoting factor activity.</a> Nature. 339, 280-286 (1989).</li><li>Yang, Q., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cdk1-APC/C+cell+cycle+oscillator+circuit+functions+as+a+time-delayed,+ultrasensitive+switch.">The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch.</a> Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).</li><li>Chang, J. B., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+trigger+waves+and+the+spatial+coordination+of+the+Xenopus+cell+cycle.">Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle.</a> Nature. 500, 603-607 (2013).</li><li>Trunnell, N. B., Poon, A. C., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitivity+in+the+Regulation+of+Cdc25C+by+Cdk1.">Ultrasensitivity in the Regulation of Cdc25C by Cdk1.</a> Molecular Cell. 41, 263-274 (2011).</li><li>Kim, S. Y., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+competition+as+a+source+of+ultrasensitivity+in+the+inactivation+of+Wee1.">Substrate competition as a source of ultrasensitivity in the inactivation of Wee1.</a> Cell. 128, 1133-1145 (2007).</li><li>Pomerening, J. R., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems-level+dissection+of+the+cell-cycle+oscillator:+bypassing+positive+feedback+produces+damped+oscillations.">Systems-level dissection of the cell-cycle oscillator: bypassing positive feedback produces damped oscillations.</a> Cell. 122, 565-578 (2005).</li><li>Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+a+cell+cycle+oscillator:+hysteresis+and+bistability+in+the+activation+of+Cdc2.">Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2.</a> Nature Cell Biology. 5, 346-351 (2003).</li><li>Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aster+migration+determines+the+length+scale+of+nuclear+separation+in+the+Drosophila+syncytial+embryo.">Aster migration determines the length scale of nuclear separation in the Drosophila syncytial embryo.</a> The Journal of Cell Biology. 197, 887-895 (2012).</li><li>Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+Drosophila+embryo+extract+for+the+study+of+mitosis+ex+vivo.">A single Drosophila embryo extract for the study of mitosis ex vivo.</a> Nature Protocols. 8, 310-324 (2013).</li><li>Tsai, T. Y. C., Theriot, J. A., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+Oscillatory+Dynamics+in+the+Cell+Cycle+of+Early+Xenopus+laevis+Embryos.">Changes in Oscillatory Dynamics in the Cell Cycle of Early Xenopus laevis Embryos.</a> PLoS Biology. 12, e1001788 (2014).</li><li>Chang, J. B., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+trigger+waves+and+the+spatial+coordination+of+the+Xenopus+cell+cycle.">Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle.</a> Nature. 500, 603-607 (2013).</li><li>Yang, Q., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cdk1-APC/C+cell+cycle+oscillator+circuit+functions+as+a+time-delayed,+ultrasensitive+switch.">The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch.</a> Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).</li><li>Kumagai, A., Dunphy, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claspin,+a+novel+protein+required+for+the+activation+of+Chk1+during+a+DNA+replication+checkpoint+response+in+Xenopus+egg+extracts.">Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts.</a> Molecular Cell. 6, 839-849 (2000).</li><li>Chen, R. H., Murray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+spindle+assembly+checkpoint+in+Xenopus+egg+extracts.">Characterization of spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts.</a> Methods in Enzymology. 283, 572-584 (1997).</li><li>Chen, R. H., Waters, J. C., Salmon, E. D., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+spindle+assembly+checkpoint+component+XMAD2+with+unattached+kinetochores.">Association of spindle assembly checkpoint component XMAD2 with unattached kinetochores.</a> Science. 274, 242-246 (1996).</li><li>Minshull, J., Sun, H., Tonks, N. K., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+MAP+kinase-dependent+spindle+assembly+checkpoint+in+Xenopus+egg+extracts.">A MAP kinase-dependent spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts.</a> Cell. 79, 475-486 (1994).</li><li>Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+Volume+Modulates+Spindle+Size+During+Embryogenesis.">Cytoplasmic Volume Modulates Spindle Size During Embryogenesis.</a> Science. 342, 856-860 (2013).</li><li>Hazel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+cytoplasmic+volume+are+sufficient+to+drive+spindle+scaling.">Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling.</a> Science. 342, 853-856 (2013).</li><li>Garibyan, L., Avashia, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+Techniques+Made+Simple:+Polymerase+Chain+Reaction+(PCR).">Research Techniques Made Simple: Polymerase Chain Reaction (PCR).</a> The Journal of Investigative Dermatology. 133, e6 (2013).</li><li>Hecker, K. H., Roux, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+and+low+annealing+temperatures+increase+both+specificity+and+yield+in+touchdown+and+stepdown+PCR.">High and low annealing temperatures increase both specificity and yield in touchdown and stepdown PCR.</a> BioTechniques. 20, 478-485 (1996).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6, 343-345 (2009).</li><li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Plasmid+DNA+into+E.+coli+Using+the+Heat+Shock+Method.">Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method.</a> Journal of Visualized Experiments. 6, e253 (2007).</li><li>Torreilles, S. L., McClure, D. E., Green, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+and+refinement+of+euthanasia+methods+for+Xenopus+laevis.">Evaluation and refinement of euthanasia methods for Xenopus laevis.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48, 512-516 (2009).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+Xenopus+laevis+Testes.">Isolating Xenopus laevis Testes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2007, (2007).</li><li>Showell, C., Conlon, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Egg+Collection+and+In+vitro+Fertilization+of+the+Western+Clawed+Frog+Xenopus+tropicalis.">Egg Collection and In vitro Fertilization of the Western Clawed Frog Xenopus tropicalis.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).</li><li>Wilson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 91, 236-247 (1983).</li><li>Schutze, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+protocol+for+emulsion+polymerase+chain+reaction+and+subsequent+purification.">A streamlined protocol for emulsion polymerase chain reaction and subsequent purification.</a> Analytical Biochemistry. 410, 155-157 (2011).</li><li>Weitz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+in+the+dynamical+behaviour+of+a+compartmentalized+programmable+biochemical+oscillator.">Diversity in the dynamical behaviour of a compartmentalized programmable biochemical oscillator.</a> Nature Chemistry. 6, 295-302 (2014).</li><li>Ho, K. K., Lee, J. W., Durand, G., Majumder, S., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+with+poly(vinyl)+alcohol+surfactant+reduces+double+emulsion-encapsulated+mammalian+cell-free+expression.">Protein aggregation with poly(vinyl) alcohol surfactant reduces double emulsion-encapsulated mammalian cell-free expression.</a> PloS One. 12, e0174689 (2017).</li><li>Nakajima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+circadian+oscillation+of+cyanobacterial+KaiC+phosphorylation+in+vitro.">Reconstitution of circadian oscillation of cyanobacterial KaiC phosphorylation in vitro.</a> Science. 308, 414-415 (2005).</li><li>Guan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+tunable+mitotic+oscillator+in+artificial+cells.">A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells.</a> eLife. 7, (2018).</li></ol>

Vi har presentert en roman metode for å utvikle et høy gjennomstrømming kunstig celle-system som muliggjør i vitro rekonstituering og lang-frist oppsporer av selvbilde vedvarende cellen syklus svingninger på encellede nivå. Det er flere viktige trinn som gjør denne metoden vellykket. Første, nypresset Xenopus egg med god kvalitet, sammenlignet med avslappet egg, tendens til å lage ekstrakter med mer langvarig oscillation aktivitet. Andre er innkapsling av ekstrakter innen surfactant-stabilisert...

Cytoplasmatiske ekstrakter forberedt Xenopus laevis egg representerer en av de mest dominerende modellene for biokjemiske studier av cellen sykluser, gitt det store volumet av oocytes, rask cellen syklus progresjon og evnen til å gjenoppbygge mitotisk hendelser i vitro1,2. Dette systemet har tillatt første oppdagelsen og mekanistisk karakteristikk av viktige cellen syklus regulatorer som modning-fremme faktor (MPF) samt nedstrøms mitotisk prosesser inkludert vri montering og kromosom raseskille1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11. Xenopus egg ekstrakter har også blitt brukt for detaljert Disseksjon av de regulatoriske nettverkene av13,14 for cellen syklus klokken8,-12,og studier av DNA skade /Replication kontrollpunkt15 og mitotisk spindelen montering checkpoint16,17,18.
Disse studiene av cellen sykluser med Xenopus egg ekstrakter har hovedsakelig vært basert på bulk målinger. Men kan konvensjonelle bulk reaksjon analyser ikke etterligne virkelige celle atferd, gitt et stort avvik i dimensjoner og subcellular romlige compartmentalization av reaksjon molekyler. Videre er bulk målinger av mitotisk aktiviteter liggende å ga et begrenset antall sykluser før raskt demping8. Disse ulempene av bulk reaksjoner ha forhindret ekstrakt systemet for å gi ytterligere forståelse av komplekse klokke dynamiske egenskaper og funksjoner. Nyere studier har innkapslet celle-fri cytostatic faktor-arrestert (CSF) Xenopus ekstrakter19,20 i størrelse brukerdefinert celle-lignende rom, som har bidratt til å belyse hvordan spindel størrelse modulert av den cytoplasmatiske volum. Men i vitro systemet er arrestert på metaphase av meiose II av cytostatic faktor1, og et system i stand til langsiktig vedvarende svingninger på encellede nivå er nødvendig for videre etterforskning av cellen syklus oscillator.
For å studere celle syklus svingninger med encellede oppløsning, har vi utviklet en celle skala, høy gjennomstrømming system for rekonstituering og samtidig måling av flere selvbilde vedvarende mitotisk oscillasjon prosesser i personlige microemulsion dråper. I denne detaljert video protokollen viser vi etableringen av kunstige mitotisk oscillation systemet ved å innkapsle sykling Xenopus laevis egg cytoplasma i mikroemulsjoner i størrelser fra 10 til 300 µm. I dette systemet var mitotisk svingninger inkludert kromosom kondens og de kondens, kjernefysiske konvolutten sammenbrudd og reformasjonen og fornedrelse og syntese av anaphase underlag (f.eks securin mCherry i denne protokollen) vellykket rekonstituert.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="593">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Xenopus laevis frogs</td>
			<td style="width:93px;">Xenopus-I Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">QIAprep spin miniprep kit</td>
			<td style="width:93px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">27104</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">QIAquick PCR Purification Kit (250)</td>
			<td style="width:93px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">28106</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td>
			<td style="width:93px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM1340</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">BL21 (DE3)-T-1 competent cell</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B2935</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Calcium ionophore</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A23187</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B2261</td>
			<td style="width:167px;">Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Trichloro</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">448931</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;">Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl) silane</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:215px;">PFPE-PEG surfactant</td>
			<td style="width:93px;">Ran Biotechnologies</td>
			<td style="width:119px;">008-FluoroSurfactant-2wtH-50G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">GE Healthcare Glutathione Sepharose 4B beads</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">GE17-0756-01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">PD-10 column</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">GE17-0851-01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">VitroCom miniature hollow glass tubing</td>
			<td style="width:93px;">VitroCom</td>
			<td style="width:119px;">5012</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Olympus SZ61 Stereo Microscope</td>
			<td style="width:93px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Olympus IX83 microscope</td>
			<td style="width:93px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Olympus FV1200 confocal microscope</td>
			<td style="width:93px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">NanoDrop spectrophotometer</td>
			<td style="width:93px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:119px;">ND-2000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">0.4 mL Snap-Cap Microtubes</td>
			<td style="width:93px;">E&#38;K Scientific</td>
			<td style="width:119px;">485050-B</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="54" rowspan="2" style="height:55px;width:215px;">&#160;PureLink RNA Mini Kit</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">ThermoFisher&#65288;Ambion&#65289;</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">12183018A</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Fisherbrand Analog Vortex Mixer</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">2215365</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Imaris</td>
			<td style="width:93px;">Bitplane</td>
			<td style="width:119px;">Version 7.3</td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of cell-cycle oscillations in microemulsions of cell-free xenopus egg extracts

Sanntids måling av svingninger på encellede nivå er viktig å avdekke mekanismer for biologiske klokker. Selv om bulk ekstrakter forberedt Xenopus laevis egg har blitt kraftig i dissekere biokjemiske nettverk underliggende celle syklus progresjon, fører deres ensemble gjennomsnittlig målingen vanligvis til en dempet oscillation, til tross for hver individuelle oscillator blir vedvarende. Dette skyldes problemer med perfekt synkronisering mellom individuelle oscillatorer i støyende biologiske systemer. For å gjenerverve encellede dynamikken i oscillator, utviklet vi et slippverktøy-basert kunstig celle-system som kan gjeninnføre mitotisk sykluser i celle-lignende rom innkapsle sykling cytoplasmatiske ekstrakter av Xenopus laevis egg. Disse enkle bare cytoplasmatiske cellene utstilling vedvarende svingninger for over 30 sykluser. For å bygge mer komplisert celler med kjerner, lagt vi demembranated sperm chromatin utløse kjerner selvtillit forsamlingen i systemet. Vi observerte en periodisk progresjon av kromosom kondens/decondensation og kjerner innhylle sammenbrudd/reformasjonen, som i ekte celler. Dette indikerer at mitotisk oscillator fungerer trofast for å kjøre flere nedstrøms mitotisk hendelser. Vi spores samtidig dynamikken mitotisk oscillator og nedstrøms prosesser i individuelle dråper med flerkanals time-lapse fluorescens mikroskopi. Kunstig celle-syklusen systemet gir en høy gjennomstrømming ramme for kvantitative manipulasjon og analyse av mitotisk svingninger med encellede oppløsning, som sannsynlig gir viktig innsikt i regulatoriske maskiner og funksjoner klokken.

I figur 2viser vi at denne protokollen gir mitotisk svingninger i både enkle, atomvåpenfritt celler i tillegg til kompliserte celler med kjerner, der oscillator kjører syklisk veksling av kjerner formasjon og deformasjon. Kjerner-fri dråpene generere mitotisk svingninger opp til 30 undamped sykluser over tidsrommet 92 timer, som angitt av den periodiske syntese og nedbrytning av en fluorescens reporter securin-mCherry (figur 2A</stron...

Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts at JoVE.com

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Vi presenterer en metode for generering av i vitro selvbilde vedvarende mitotisk svingninger på encellede nivå ved å innkapsle egg ekstrakter av Xenopus laevis i vann-i-olje mikroemulsjoner.

Rekonstituering i cellen syklus svingninger i mikroemulsjoner Cell-free Xenopus egg ekstrakter

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål i systembiologifeltet, for eksempel reguleringsmekanismen bak det mititotiske nettverket og de dynamiske egenskapene og funksjonene til cellesyklusklokken. Den største fordelen med denne teknikken er at den vil generere en stor mengde dråper med flere cellesykluser i hver, noe som gir oss et rammeverk med høy gjennomstrømning for kvantitativ manipulasjon og analyse. Til å begynne med, kast grupper av egg som har uklare grenser mellom dyre- og vegetale poler eller uregelmessige hvite flekker på toppen av dyrestenger.Deretter velger du en passende gruppe egg fra en kvinnelig frosk, og overfører eggene til et 600-milliliter beger. Hell ut et overskudd på 0,2x MMR buffer, og legg forsiktig cystein i 1x ekstraktbuffer til eggene. Etter dette rister du begeret kraftig for hånd for å fjerne geléstrøkene på eggene.Gjenta denne vasken tre ganger med totalt 800 milliliter cysteinbuffer eller til eggene aggregerer og legger seg på bunnen av begeret. Etter at geléfrakken er fjernet, vask eggene fire ganger i en liter 0, 2x MMR-løsning. Bruk en glasspipette til å plukke opp og kaste eggene som blir hvite.Hell MMR-bufferen ut av begeret, og tilsett 200 milliliter kalsiumionophore-løsning i eggene. Bruk en glasspipette til å røre eggene forsiktig til de er aktivert, og fjern kalsiumionophore-løsningen. Å forlate eggene i kalsiumionophore løsning for lenge vil initiere apoptose.Vi rører eggene i 1, 5 minutter og kontrollerer aktiveringseffektiviteten. Hvis de ikke er aktivert, gjenopptar du omrøringen og kontrollerer oftere til 90% aktivering er oppnådd. Etter at eggene har lagt seg på bunnen av begeret, kontroller aktiveringseffektiviteten.Velaktiverte egg har ca. 25% av dyrestangen og 75% av vegetalstangen. Deretter vasker du eggene to ganger med et totalt volum på 50 milliliter ekstraktbuffer supplert med proteasehemmere. Deretter overfører du forsiktig eggene til et 0, 4-milliliter snap-cap mikrorør.Sentrifuger mikrorøret i 60 sekunder ved 200 g og deretter ved 600 g i 30 sekunder for å pakke eggene. Deretter bruker du et glass Pasteur pipette for å fjerne overflødig buffer på toppen av eggene etter hvert trinn. Etter dette knuser du eggene ved 15.000 g i 10 minutter ved fire grader Celsius.Bruk et barberblad til å kutte rørene for å skille de tre lagene med knuste egg og holde den grove cytoplasma i det midterste laget. Deretter overfører du den grove cytoplasma til rene ultracentrifuge rør. Supplere cytoplasma med protease hemmere og cytochalasin B på 10 mikrogram per milliliter hver.Sentrifuger rå cytoplasma på 15,000 g og fire grader Celsius i fem minutter. Deretter bruker du et barberblad til å kutte røret og holde cytoplasma i det midterste laget. Legg de nyberederte ekstraktene på is.Først legger securin-mCherry mRNA til de tilberedte ekstraktene. Deretter legger du til 200 mikroliter på 2 % PFPE-PEG fluorosurfactant til ekstraktmRNA-blandingen. Bruk en vortex mikser til å generere dråper, justere virvelhastighet og varighet etter behov.Deretter visuelt inspisere dråpene for å sikre at de er ensartede i størrelse. Bruk en pipette på 200 mikroliter, og overfør dråpene som flyter på toppen og et likt volum av overflateaktivt middel til et PCR-rør. Dypp et glassrør i dråpelaget, og vent til dråpene fyller ca. 75% av røret.Skyv deretter røret inn i overflateaktivt lag, og fyll røret helt. Fyll deretter en glassbunnet tallerken med mineralolje. Deretter bruker du fine pinsett for å senke dråperøret i oljen.Bruk en glasspipette til å fjerne synlige rester eller lekkede dråper. For å unngå bevegelse og lekkasje av dråper, bør glassrøret fylt med dråper senkes ned under mineralolje forsiktig. Vi kan enten skyve røret på begge ender med balanse eller legge til noen dråper mineralolje på endene av røret samtidig først.Etter dette, bruk et epifluorescence mikroskop utstyrt med et motorisert xy stadium for å bilde dråpene. Ta opp tidsforløpsvideoer i det lyse feltet og flere fluorescenskanaler hvert sjette til ni minutter til dråpene mister aktiviteten. Ved hjelp av denne protokollen ble mitotisk oscillasjon i både enkle, kjernefysiske celler og kompliserte celler med kjerner produsert.De nukleifrie dråpene genererte mitotisk oscillasjon opptil 30 uampede sykluser over 92 timer. Den mititotiske oscillatorens evne til å kjøre nedstrøms mititotiske hendelser ble også undersøkt. Den selvbærende mitotiske oscillatoren drev endringene av kjernefysisk morfologi observert gjennom den autonome endringen av forskjellige cellesyklusfaser.Mens du prøver denne prosedyren, er det viktig å huske på tiden når du lager ekstraktet, da det er tidsfølsomt, og alltid holde eggene og trekke ut på is. Etter utviklingen banet denne teknikken vei for forskere innen systembiologi for å utforske grunnleggende prinsipper for komplekse klokkeegenskaper, som tunabilitet og stokastiskhet i Xenopus laevis.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Tilberedning av nukleosomer med Forskjellig Isotop-merket Sister Histoner

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Spenningsklemme Fluorometri i<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocytter ved hjelp av fluorescerende unaturlige aminosyrer

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Rensing og rekonstituering av TRPV1 for Spectroscopic analyse

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Fluorescens Live-celle Imaging av komplett Vegetative cellen syklus av langsom voksende sosial bakterie en cellemembran

Fluorescence live-cell imaging of bacterial cells is a key method in the analysis of the spatial and temporal dynamics of proteins and chromosomes ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Rekonstituering selv organisere Protein mønstre på støttede Lipid Bilayers

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Studere RNA interaktører av Protein Kinase RNA-aktivert under pattedyr cellen syklus

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Absolutt kvantifisering av Cell-fri protein syntese metabolisme av reversert-fase flytende kromatografi-Mass massespektrometri

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Berikelse av pattedyrvev og Xenopus oocytter med kolesterol

Cholesterol enrichment of mammalian tissues and cells, including Xenopus oocytes used for studying cell function, can be accomplished using a variety of ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Cellefri produksjon av proteoliposomer for funksjonell analyse og antistoffutvikling rettet mot membranproteiner

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Stedsspesifikk lysinacetylering av histoner for nukleosomrekonstituering ved bruk av genetisk kodeutvidelse i Escherichia coli

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...