Name: reconstitution of cell-cycle oscillations in microemulsions of cell-free xenopus egg extracts
Uploaded: 2018-09-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts at JoVE.com

Agradecemos a Madeleine Lu para a construção do plasmídeo securin-mCherry, colo homem Lee, Kenneth Ho e Allen P Liu para discussões sobre a geração de gotículas, Jeremy B. Chang e James E. Ferrell Jr para a prestação de QUE GFP-NLS construir. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation (início de carreira Grant #1553031), o National Institutes of Health (MIRA #GM119688) e uma bolsa de pesquisa do Sloan.

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) da Universidade de Michigan e institucional Cuidado Animal.
1. preparação de materiais para reconstituição do ciclo celular e detecção
<ol><li>
Montagem de Gibson clonagem para a construção de DNA do plasmídeo e purificação de mRNA da securin-mCherry
	<ol>
<li>Preparar três fragmentos de DNA, incluindo uma espinha dorsal de vetor de pMTB2, securin e mCherry através da reação em cadeia...

<ol>
	<li>Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+extracts.">Cell cycle extracts.</a> Methods in Cell Biology. 36, 581-605 (1991).</li><li>Hannak, E., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+mitotic+spindle+assembly+and+function+in+vitro+using+Xenopus+laevis+egg+extracts.">Investigating mitotic spindle assembly and function in vitro using Xenopus laevis egg extracts.</a> Nature Protocols. 1, 2305-2314 (2006).</li><li>Murray, A. W., Solomon, M. J., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cyclin+synthesis+and+degradation+in+the+control+of+maturation+promoting+factor+activity.">The role of cyclin synthesis and degradation in the control of maturation promoting factor activity.</a> Nature. 339, 280-286 (1989).</li><li>Yang, Q., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cdk1-APC/C+cell+cycle+oscillator+circuit+functions+as+a+time-delayed,+ultrasensitive+switch.">The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch.</a> Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).</li><li>Chang, J. B., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+trigger+waves+and+the+spatial+coordination+of+the+Xenopus+cell+cycle.">Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle.</a> Nature. 500, 603-607 (2013).</li><li>Trunnell, N. B., Poon, A. C., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitivity+in+the+Regulation+of+Cdc25C+by+Cdk1.">Ultrasensitivity in the Regulation of Cdc25C by Cdk1.</a> Molecular Cell. 41, 263-274 (2011).</li><li>Kim, S. Y., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+competition+as+a+source+of+ultrasensitivity+in+the+inactivation+of+Wee1.">Substrate competition as a source of ultrasensitivity in the inactivation of Wee1.</a> Cell. 128, 1133-1145 (2007).</li><li>Pomerening, J. R., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems-level+dissection+of+the+cell-cycle+oscillator:+bypassing+positive+feedback+produces+damped+oscillations.">Systems-level dissection of the cell-cycle oscillator: bypassing positive feedback produces damped oscillations.</a> Cell. 122, 565-578 (2005).</li><li>Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+a+cell+cycle+oscillator:+hysteresis+and+bistability+in+the+activation+of+Cdc2.">Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2.</a> Nature Cell Biology. 5, 346-351 (2003).</li><li>Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aster+migration+determines+the+length+scale+of+nuclear+separation+in+the+Drosophila+syncytial+embryo.">Aster migration determines the length scale of nuclear separation in the Drosophila syncytial embryo.</a> The Journal of Cell Biology. 197, 887-895 (2012).</li><li>Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+Drosophila+embryo+extract+for+the+study+of+mitosis+ex+vivo.">A single Drosophila embryo extract for the study of mitosis ex vivo.</a> Nature Protocols. 8, 310-324 (2013).</li><li>Tsai, T. Y. C., Theriot, J. A., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+Oscillatory+Dynamics+in+the+Cell+Cycle+of+Early+Xenopus+laevis+Embryos.">Changes in Oscillatory Dynamics in the Cell Cycle of Early Xenopus laevis Embryos.</a> PLoS Biology. 12, e1001788 (2014).</li><li>Chang, J. B., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+trigger+waves+and+the+spatial+coordination+of+the+Xenopus+cell+cycle.">Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle.</a> Nature. 500, 603-607 (2013).</li><li>Yang, Q., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cdk1-APC/C+cell+cycle+oscillator+circuit+functions+as+a+time-delayed,+ultrasensitive+switch.">The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch.</a> Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).</li><li>Kumagai, A., Dunphy, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claspin,+a+novel+protein+required+for+the+activation+of+Chk1+during+a+DNA+replication+checkpoint+response+in+Xenopus+egg+extracts.">Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts.</a> Molecular Cell. 6, 839-849 (2000).</li><li>Chen, R. H., Murray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+spindle+assembly+checkpoint+in+Xenopus+egg+extracts.">Characterization of spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts.</a> Methods in Enzymology. 283, 572-584 (1997).</li><li>Chen, R. H., Waters, J. C., Salmon, E. D., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+spindle+assembly+checkpoint+component+XMAD2+with+unattached+kinetochores.">Association of spindle assembly checkpoint component XMAD2 with unattached kinetochores.</a> Science. 274, 242-246 (1996).</li><li>Minshull, J., Sun, H., Tonks, N. K., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+MAP+kinase-dependent+spindle+assembly+checkpoint+in+Xenopus+egg+extracts.">A MAP kinase-dependent spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts.</a> Cell. 79, 475-486 (1994).</li><li>Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+Volume+Modulates+Spindle+Size+During+Embryogenesis.">Cytoplasmic Volume Modulates Spindle Size During Embryogenesis.</a> Science. 342, 856-860 (2013).</li><li>Hazel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+cytoplasmic+volume+are+sufficient+to+drive+spindle+scaling.">Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling.</a> Science. 342, 853-856 (2013).</li><li>Garibyan, L., Avashia, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+Techniques+Made+Simple:+Polymerase+Chain+Reaction+(PCR).">Research Techniques Made Simple: Polymerase Chain Reaction (PCR).</a> The Journal of Investigative Dermatology. 133, e6 (2013).</li><li>Hecker, K. H., Roux, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+and+low+annealing+temperatures+increase+both+specificity+and+yield+in+touchdown+and+stepdown+PCR.">High and low annealing temperatures increase both specificity and yield in touchdown and stepdown PCR.</a> BioTechniques. 20, 478-485 (1996).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6, 343-345 (2009).</li><li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Plasmid+DNA+into+E.+coli+Using+the+Heat+Shock+Method.">Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method.</a> Journal of Visualized Experiments. 6, e253 (2007).</li><li>Torreilles, S. L., McClure, D. E., Green, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+and+refinement+of+euthanasia+methods+for+Xenopus+laevis.">Evaluation and refinement of euthanasia methods for Xenopus laevis.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48, 512-516 (2009).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+Xenopus+laevis+Testes.">Isolating Xenopus laevis Testes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2007, (2007).</li><li>Showell, C., Conlon, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Egg+Collection+and+In+vitro+Fertilization+of+the+Western+Clawed+Frog+Xenopus+tropicalis.">Egg Collection and In vitro Fertilization of the Western Clawed Frog Xenopus tropicalis.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).</li><li>Wilson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 91, 236-247 (1983).</li><li>Schutze, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+protocol+for+emulsion+polymerase+chain+reaction+and+subsequent+purification.">A streamlined protocol for emulsion polymerase chain reaction and subsequent purification.</a> Analytical Biochemistry. 410, 155-157 (2011).</li><li>Weitz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+in+the+dynamical+behaviour+of+a+compartmentalized+programmable+biochemical+oscillator.">Diversity in the dynamical behaviour of a compartmentalized programmable biochemical oscillator.</a> Nature Chemistry. 6, 295-302 (2014).</li><li>Ho, K. K., Lee, J. W., Durand, G., Majumder, S., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+with+poly(vinyl)+alcohol+surfactant+reduces+double+emulsion-encapsulated+mammalian+cell-free+expression.">Protein aggregation with poly(vinyl) alcohol surfactant reduces double emulsion-encapsulated mammalian cell-free expression.</a> PloS One. 12, e0174689 (2017).</li><li>Nakajima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+circadian+oscillation+of+cyanobacterial+KaiC+phosphorylation+in+vitro.">Reconstitution of circadian oscillation of cyanobacterial KaiC phosphorylation in vitro.</a> Science. 308, 414-415 (2005).</li><li>Guan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+tunable+mitotic+oscillator+in+artificial+cells.">A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells.</a> eLife. 7, (2018).</li></ol>

Nós apresentamos um novo método para o desenvolvimento de um sistema de célula artificial de alto rendimento que permite em vitro reconstituição e acompanhamento a longo prazo do ciclo celular auto-sustentado oscilações no nível de célula única. Existem várias etapas críticas que fazem este método bem sucedido. Ovos de Xenopus espremidos, primeiros com uma boa qualidade, em comparação com ovos estabelecidos, tendem a produzir extratos com atividade de oscilação mais longer-lasting. Em s...

Citoplasmáticos extratos preparados a partir de ovos de Xenopus laevis representam um dos modelos mais predominantes para o estudo bioquímico da célula ciclos, dado o grande volume de oócitos, a progressão do ciclo celular rápido e a capacidade de reconstituir eventos mitótica em vitro1,2. Este sistema permitiu a descoberta inicial e caracterização mecanicista dos reguladores do ciclo celular essencial como fator de promoção da maturação (MPF), bem como a jusante processos mitóticos incluindo eixo montagem e cromossomo segregação1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11. Os extratos de ovos de Xenopus também têm sido utilizados para dissecação pormenorizada das redes reguladoras do ciclo celular relógio8,12,13,14 e para estudos sobre os danos do DNA /Replication posto15 e o fuso mitótico montagem de ponto de verificação16,17,18.
Estes estudos dos ciclos de célula usando os extratos de ovos de Xenopus foram baseados principalmente em medições de volume. No entanto, os ensaios de reação em massa convencional não podem imitar comportamentos de célula real, dados uma grande discrepância em suas dimensões e subcellular compartimentalização espacial das moléculas de reação. Além disso, medições de volume de actividade mitótica são propensas a dar um número limitado de ciclos antes rapidamente de amortecimento8. Estas desvantagens de reações em massa impediram que o sistema de extrato para fornecer mais compreensão do complexo relógio dinâmico Propriedades e funções. Estudos recentes têm encapsulado sem célula citostáticos (CSF) de fator-preso Xenopus extrai19,20 em compartimentos celulares, como definido pelo tamanho, que ajudaram a elucidar como o tamanho do eixo é modulado pelo volume citoplasmático. No entanto, este sistema em vitro é preso em metáfase da meiose II pela ação do fator citostáticos1, e é necessário um sistema capaz de oscilações sustentadas a longo prazo a nível de célula única para posterior investigação do ciclo celular oscilador.
Para estudar as oscilações do ciclo celular com resolução de célula única, nós desenvolvemos um sistema de alta produtividade para reconstituição e medição simultânea de vários processos mitóticos auto-sustentado oscilatórios em microemulsão individual, célula-escala gotas. Neste protocolo vídeo detalhado, demonstramos a criação do sistema de oscilação mitótica artificial encapsulando ciclismo Xenopus laevis citoplasma de ovo em microemulsões de tamanhos que variam de 10 a 300 µm. Neste sistema, foram mitóticas oscilações incluindo condensação cromossomo e de condensação, colapso do envelope nuclear e reforma e a degradação e síntese de substratos anáfase (por exemplo, securin-mCherry neste protocolo) reconstituído com êxito.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="593">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Xenopus laevis frogs</td>
			<td style="width:93px;">Xenopus-I Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">QIAprep spin miniprep kit</td>
			<td style="width:93px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">27104</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">QIAquick PCR Purification Kit (250)</td>
			<td style="width:93px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">28106</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td>
			<td style="width:93px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM1340</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">BL21 (DE3)-T-1 competent cell</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B2935</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Calcium ionophore</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A23187</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B2261</td>
			<td style="width:167px;">Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Trichloro</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">448931</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;">Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl) silane</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:215px;">PFPE-PEG surfactant</td>
			<td style="width:93px;">Ran Biotechnologies</td>
			<td style="width:119px;">008-FluoroSurfactant-2wtH-50G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">GE Healthcare Glutathione Sepharose 4B beads</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">GE17-0756-01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">PD-10 column</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">GE17-0851-01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">VitroCom miniature hollow glass tubing</td>
			<td style="width:93px;">VitroCom</td>
			<td style="width:119px;">5012</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Olympus SZ61 Stereo Microscope</td>
			<td style="width:93px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Olympus IX83 microscope</td>
			<td style="width:93px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Olympus FV1200 confocal microscope</td>
			<td style="width:93px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">NanoDrop spectrophotometer</td>
			<td style="width:93px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:119px;">ND-2000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">0.4 mL Snap-Cap Microtubes</td>
			<td style="width:93px;">E&#38;K Scientific</td>
			<td style="width:119px;">485050-B</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="54" rowspan="2" style="height:55px;width:215px;">&#160;PureLink RNA Mini Kit</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">ThermoFisher&#65288;Ambion&#65289;</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">12183018A</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Fisherbrand Analog Vortex Mixer</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">2215365</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Imaris</td>
			<td style="width:93px;">Bitplane</td>
			<td style="width:119px;">Version 7.3</td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of cell-cycle oscillations in microemulsions of cell-free xenopus egg extracts

Medição em tempo real das oscilações no nível de célula única é importante para desvendar os mecanismos de relógios biológicos. Apesar de extratos em massa preparados a partir de ovos de Xenopus laevis foram poderosos em dissecando redes bioquímicas subjacentes a progressão do ciclo celular, sua medida média ensemble normalmente leva a uma oscilação amortecida, apesar de cada um oscilador individual sendo sustentada. Isto é devido à dificuldade de sincronização perfeita entre os osciladores individuais em sistemas biológicos barulhentos. Para recuperar a dinâmica de célula única do oscilador, desenvolvemos um sistema de célula artificial baseada em gotículas que pode reconstituir ciclos mitóticos em compartimentos de célula, como encapsular ciclismo citoplasmáticos extratos de ovos de Xenopus laevis . Essas células somente citoplasmática simples apresentam oscilações sustentadas por mais de 30 ciclos. Para construir mais complicadas células com núcleos, nós adicionamos demembranated cromatina de espermatozoides para acionar núcleos auto-montagem no sistema. Observamos uma progressão periódica de cromossomo condensação/ocorre descondensação e núcleos envolvem avaria/reforma, como nas células reais. Isso indica que o oscilador mitótico fielmente as funções para conduzir vários eventos mitóticos a jusante. Seguimos simultaneamente a dinâmica do oscilador mitótico e processos a jusante em gotículas individuais usando microscopia de fluorescência de lapso de tempo de multi-canal. O sistema de ciclo celular artificial fornece uma estrutura de alto rendimento para manipulação quantitativa e análise das oscilações mitóticas com resolução de célula única, que provavelmente fornece insights importantes sobre as máquinas reguladoras e funções de o relógio.

Na Figura 2, mostramos que o presente protocolo produz oscilações mitóticas em células simples, livre de armas nucleares bem como complicadas células com núcleos, onde o oscilador conduz a alternância cíclica de formação de núcleos e deformação. As gotas de núcleos livres geram oscilações mitóticas acima de 30 ciclos undamped ao longo tempo de 92 horas, conforme indicado pelo periódico síntese e degradação de uma fluorescência repórter ...

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Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Nós apresentamos um método para a geração de em vitro auto-sustentado mitótica oscilações no nível de célula única encapsulando extratos de ovos de Xenopus laevis em microemulsões de água em óleo.

Reconstituição das oscilações do ciclo celular em microemulsões dos extratos de ovo sem célula Xenopus

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da biologia do sistema, como o mecanismo de regulação por trás da rede mitótica e as propriedades e funções dinâmicas do relógio de ciclo celular. A principal vantagem dessa técnica é que ela irá gerar uma grande quantidade de gotículas com múltiplos ciclos celulares em cada um, fornecendo-nos uma estrutura de alto rendimento para manipulação e análise quantitativa. Para começar, descarte lotes de ovos que não tenham limites claros entre postes animais e vegetais ou manchas brancas irregulares em cima de postes de animais.Em seguida, selecione um lote apropriado de ovos de uma sapo fêmea, e transfira os ovos para um béquer de 600 mililitros. Despeje um excesso de 0,2x de tampão MMR e adicione suavemente cisteína em 1x de tampão de extrato aos ovos. Depois disso, aperte o béquer vigorosamente à mão para remover as camadas de geleia dos ovos.Repita esta lavagem três vezes com um total de 800 mililitros de tampão de cisteína ou até que os ovos se agreguem e se acomodem no fundo do béquer. Depois que a camada de geleia for removida, lave os ovos quatro vezes em um litro de solução mmr de 0,2x. Use uma pipeta de vidro para pegar e descartar os ovos que ficam brancos.Despeje o tampão MMR do béquer e adicione 200 mililitros de solução de ionóforo de cálcio nos ovos. Use uma pipeta de vidro para agitar os ovos suavemente até que eles sejam ativados, e remova a solução de ionóforo de cálcio. Deixar os ovos na solução de ionóforo de cálcio por muito tempo iniciará apoptose.Agitamos os ovos por 1,5 minutos e verificamos a eficiência de ativação. Se eles não forem ativados, retome a agitação e verifique com mais frequência até que a ativação de 90% seja alcançada. Depois que os ovos se instalarem no fundo do béquer, verifique a eficiência de ativação.Ovos bem ativados têm aproximadamente 25% do polo animal e 75% do polo vegetal. Em seguida, lave os ovos duas vezes com um volume total de 50 mililitros de extrato tampão complementado com inibidores de protease. Em seguida, transfira cuidadosamente os ovos para um microtubo de 0,4 mililitros snap-cap.Centrifugar o microtubo por 60 segundos a 200 g e depois a 600 g por 30 segundos para embalar os ovos. Em seguida, use uma pipeta pasteur de vidro para remover o excesso de tampão em cima dos ovos após cada passo. Depois disso, esmague os ovos a 15.000 g por 10 minutos a quatro graus Celsius.Use uma lâmina de barbear para cortar os tubos para separar as três camadas de ovos esmagados e manter o citoplasma bruto na camada média. Em seguida, transfira o citoplasma bruto para limpar tubos ultracentrífugas. Suplemente o citoplasma com inibidores de protease e citochalasina B a 10 microgramas por mililitro cada.Centrifugar o citoplasma bruto a 15.000 g e quatro graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, use uma lâmina de barbear para cortar o tubo e manter o citoplasma na camada média. Coloque os extratos recém-preparados no gelo.Primeiro, adicione securin-mCherry mRNA aos extratos preparados. Em seguida, adicione 200 microliters de fluorosurfactant 2%PFPE-PEG à mistura de extrato mRNA. Use um misturador de vórtice para gerar gotículas, ajustando a velocidade e duração do vórtice conforme necessário.Em seguida, inspecione visualmente as gotículas para garantir que elas estejam uniformes em tamanho. Usando uma pipeta de 200 microliter, transfira as gotículas flutuando em cima e um volume igual de surfactante para um tubo PCR. Mergulhe um tubo de vidro na camada de gotícula e espere até que as gotículas encham aproximadamente 75% do tubo.Em seguida, empurre o tubo para dentro da camada surfactante, e encha o tubo completamente. Em seguida, encha um prato com fundo de vidro com óleo mineral. Em seguida, use pinças finas para imergir o tubo cheio de gotas no óleo.Use uma pipeta de vidro para remover detritos visíveis ou gotículas vazadas. Para evitar o movimento e o vazamento de gotículas, o tubo de vidro cheio de gotículas deve ser imerso sob o óleo mineral cuidadosamente. Podemos empurrar o tubo em ambas as extremidades com equilíbrio ou adicionar algumas gotas de óleo mineral nas extremidades do tubo simultaneamente primeiro.Depois disso, use um microscópio de epifluorescência equipado com um estágio xiy motorizado para visualizar as gotículas. Grave vídeos de lapso de tempo no campo brilhante e vários canais de fluorescência a cada seis a nove minutos até que as gotículas percam sua atividade. Usando este protocolo, foram produzidas oscilações mitóticas em células simples e livres de nucleares e células complicadas com núcleos.As gotículas sem núcleos geraram oscilação mitótica de até 30 ciclos não amostrados ao longo de 92 horas. A capacidade do oscilador mitótico de conduzir eventos mitóticos a jusante também foi examinada. O oscilador mitotístico autossustentado impulsionou as mudanças da morfologia nuclear observadas através da alteração autônoma de fases distintas do ciclo celular.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar da hora de fazer o extrato, pois é sensível ao tempo, e sempre manter os ovos e extrair no gelo. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da biologia do sistema explorarem princípios fundamentais de propriedades complexas do relógio, como a sintonia e a estocástica em Xenopus laevis.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Reconstituição de Nucleosomes com Histones irmã diferencialmente Isotope-rotulados

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Bioquímica

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Braçadeira de tensão Fluorometria em<em&gt; Xenopus</em&gt; Oócitos Usando Aminoácidos Fluorescentes Não-naturais

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Purificação e reconstituição de TRPV1 para análise espectroscópica

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Imagem latente da Live-pilha fluorescência de completa ciclo vegetativo celular do lento crescimento Social bactéria Myxococcus xanthus

Fluorescence live-cell imaging of bacterial cells is a key method in the analysis of the spatial and temporal dynamics of proteins and chromosomes ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstituição de auto-organização padrões de proteína na Bilayers do Lipid suportados

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Estudando o RNA interactianos de proteína quinase RNA-ativado durante o ciclo celular dos mamíferos

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Quantificação absoluta do metabolismo da síntese de proteínas livres de células por cromatografia líquida de fase reversa-espectrometria

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Enriquecimento de Tecidos mamíferos e Oócitos xenopus com colesterol

Cholesterol enrichment of mammalian tissues and cells, including Xenopus oocytes used for studying cell function, can be accomplished using a variety of ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Produção Livre de Células de Proteolipossomas para Análise Funcional e Desenvolvimento de Anticorpos Visando Proteínas de Membrana

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Lysine Acetilation specific de Histones para Reconstituição Nucleososome usando Expansão do Código Genético em Escherichia coli

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...