Name: reconstitution of cell-cycle oscillations in microemulsions of cell-free xenopus egg extracts
Uploaded: 2018-09-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts at JoVE.com

Мы благодарим Lu Мадлен для построения securin mCherry плазмиды, коленях человек ли, Кеннет Хо и Аллен P Лю для дискуссий о поколении капелька, Джереми б. Чанг и Джеймс э. Ferrell Jr для предоставления GFP-NLS построить. Эта работа была поддержана национального научного фонда (начало карьеры Грант #1553031), национальные институты здравоохранения (MIRA #GM119688) и Слоун исследовательских стипендий.

Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) из университета штата Мичиган.
1. Подготовка материалов для клеточного цикла и обнаружения
<ol><li>
Гибсон Ассамблеи клонирования для плазмида ДНК строительство и о?...

<ol>
	<li>Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+extracts.">Cell cycle extracts.</a> Methods in Cell Biology. 36, 581-605 (1991).</li><li>Hannak, E., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+mitotic+spindle+assembly+and+function+in+vitro+using+Xenopus+laevis+egg+extracts.">Investigating mitotic spindle assembly and function in vitro using Xenopus laevis egg extracts.</a> Nature Protocols. 1, 2305-2314 (2006).</li><li>Murray, A. W., Solomon, M. J., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cyclin+synthesis+and+degradation+in+the+control+of+maturation+promoting+factor+activity.">The role of cyclin synthesis and degradation in the control of maturation promoting factor activity.</a> Nature. 339, 280-286 (1989).</li><li>Yang, Q., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cdk1-APC/C+cell+cycle+oscillator+circuit+functions+as+a+time-delayed,+ultrasensitive+switch.">The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch.</a> Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).</li><li>Chang, J. B., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+trigger+waves+and+the+spatial+coordination+of+the+Xenopus+cell+cycle.">Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle.</a> Nature. 500, 603-607 (2013).</li><li>Trunnell, N. B., Poon, A. C., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitivity+in+the+Regulation+of+Cdc25C+by+Cdk1.">Ultrasensitivity in the Regulation of Cdc25C by Cdk1.</a> Molecular Cell. 41, 263-274 (2011).</li><li>Kim, S. Y., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+competition+as+a+source+of+ultrasensitivity+in+the+inactivation+of+Wee1.">Substrate competition as a source of ultrasensitivity in the inactivation of Wee1.</a> Cell. 128, 1133-1145 (2007).</li><li>Pomerening, J. R., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems-level+dissection+of+the+cell-cycle+oscillator:+bypassing+positive+feedback+produces+damped+oscillations.">Systems-level dissection of the cell-cycle oscillator: bypassing positive feedback produces damped oscillations.</a> Cell. 122, 565-578 (2005).</li><li>Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+a+cell+cycle+oscillator:+hysteresis+and+bistability+in+the+activation+of+Cdc2.">Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2.</a> Nature Cell Biology. 5, 346-351 (2003).</li><li>Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aster+migration+determines+the+length+scale+of+nuclear+separation+in+the+Drosophila+syncytial+embryo.">Aster migration determines the length scale of nuclear separation in the Drosophila syncytial embryo.</a> The Journal of Cell Biology. 197, 887-895 (2012).</li><li>Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+Drosophila+embryo+extract+for+the+study+of+mitosis+ex+vivo.">A single Drosophila embryo extract for the study of mitosis ex vivo.</a> Nature Protocols. 8, 310-324 (2013).</li><li>Tsai, T. Y. C., Theriot, J. A., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+Oscillatory+Dynamics+in+the+Cell+Cycle+of+Early+Xenopus+laevis+Embryos.">Changes in Oscillatory Dynamics in the Cell Cycle of Early Xenopus laevis Embryos.</a> PLoS Biology. 12, e1001788 (2014).</li><li>Chang, J. B., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+trigger+waves+and+the+spatial+coordination+of+the+Xenopus+cell+cycle.">Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle.</a> Nature. 500, 603-607 (2013).</li><li>Yang, Q., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cdk1-APC/C+cell+cycle+oscillator+circuit+functions+as+a+time-delayed,+ultrasensitive+switch.">The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch.</a> Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).</li><li>Kumagai, A., Dunphy, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claspin,+a+novel+protein+required+for+the+activation+of+Chk1+during+a+DNA+replication+checkpoint+response+in+Xenopus+egg+extracts.">Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts.</a> Molecular Cell. 6, 839-849 (2000).</li><li>Chen, R. H., Murray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+spindle+assembly+checkpoint+in+Xenopus+egg+extracts.">Characterization of spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts.</a> Methods in Enzymology. 283, 572-584 (1997).</li><li>Chen, R. H., Waters, J. C., Salmon, E. D., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+spindle+assembly+checkpoint+component+XMAD2+with+unattached+kinetochores.">Association of spindle assembly checkpoint component XMAD2 with unattached kinetochores.</a> Science. 274, 242-246 (1996).</li><li>Minshull, J., Sun, H., Tonks, N. K., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+MAP+kinase-dependent+spindle+assembly+checkpoint+in+Xenopus+egg+extracts.">A MAP kinase-dependent spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts.</a> Cell. 79, 475-486 (1994).</li><li>Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+Volume+Modulates+Spindle+Size+During+Embryogenesis.">Cytoplasmic Volume Modulates Spindle Size During Embryogenesis.</a> Science. 342, 856-860 (2013).</li><li>Hazel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+cytoplasmic+volume+are+sufficient+to+drive+spindle+scaling.">Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling.</a> Science. 342, 853-856 (2013).</li><li>Garibyan, L., Avashia, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+Techniques+Made+Simple:+Polymerase+Chain+Reaction+(PCR).">Research Techniques Made Simple: Polymerase Chain Reaction (PCR).</a> The Journal of Investigative Dermatology. 133, e6 (2013).</li><li>Hecker, K. H., Roux, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+and+low+annealing+temperatures+increase+both+specificity+and+yield+in+touchdown+and+stepdown+PCR.">High and low annealing temperatures increase both specificity and yield in touchdown and stepdown PCR.</a> BioTechniques. 20, 478-485 (1996).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6, 343-345 (2009).</li><li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Plasmid+DNA+into+E.+coli+Using+the+Heat+Shock+Method.">Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method.</a> Journal of Visualized Experiments. 6, e253 (2007).</li><li>Torreilles, S. L., McClure, D. E., Green, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+and+refinement+of+euthanasia+methods+for+Xenopus+laevis.">Evaluation and refinement of euthanasia methods for Xenopus laevis.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48, 512-516 (2009).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+Xenopus+laevis+Testes.">Isolating Xenopus laevis Testes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2007, (2007).</li><li>Showell, C., Conlon, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Egg+Collection+and+In+vitro+Fertilization+of+the+Western+Clawed+Frog+Xenopus+tropicalis.">Egg Collection and In vitro Fertilization of the Western Clawed Frog Xenopus tropicalis.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).</li><li>Wilson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 91, 236-247 (1983).</li><li>Schutze, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+protocol+for+emulsion+polymerase+chain+reaction+and+subsequent+purification.">A streamlined protocol for emulsion polymerase chain reaction and subsequent purification.</a> Analytical Biochemistry. 410, 155-157 (2011).</li><li>Weitz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+in+the+dynamical+behaviour+of+a+compartmentalized+programmable+biochemical+oscillator.">Diversity in the dynamical behaviour of a compartmentalized programmable biochemical oscillator.</a> Nature Chemistry. 6, 295-302 (2014).</li><li>Ho, K. K., Lee, J. W., Durand, G., Majumder, S., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+with+poly(vinyl)+alcohol+surfactant+reduces+double+emulsion-encapsulated+mammalian+cell-free+expression.">Protein aggregation with poly(vinyl) alcohol surfactant reduces double emulsion-encapsulated mammalian cell-free expression.</a> PloS One. 12, e0174689 (2017).</li><li>Nakajima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+circadian+oscillation+of+cyanobacterial+KaiC+phosphorylation+in+vitro.">Reconstitution of circadian oscillation of cyanobacterial KaiC phosphorylation in vitro.</a> Science. 308, 414-415 (2005).</li><li>Guan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+tunable+mitotic+oscillator+in+artificial+cells.">A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells.</a> eLife. 7, (2018).</li></ol>

Мы представили новый метод для разработки высокопроизводительных искусственных клеток системы, что позволяет в пробирке растворения и долгосрочного отслеживания колебаний хозрасчетных цикла клетки на уровне одной ячейки. Есть несколько важных шагов, которые делают этот метод у...

Цитоплазматическая экстрактов, приготовленные из яиц Xenopus laevis представляют собой один из наиболее основных моделей для биохимического исследования клеток циклов, учитывая большой объем ооцитов, прогрессирование быстрого клеточного цикла и возможность воссоздания Митотическая события в пробирке1,2. Эта система позволила первоначального обнаружения и механистических характеристик регуляторов основных цикла клетки как фактор содействия созревания (MPF), а также течению mitotic процессов, в том числе шпинделя собраний и хромосомы сегрегации1 ,2,3,4,5,6,,78,9,10, 11. Экстракты яйцо Xenopus также были использованы для подробного рассечение регулирования сетей клеточного цикла часов8,12,13,14 и исследования повреждений ДНК /Replication контрольно-пропускного пункта15 и митотического шпинделя Ассамблеи контрольно-пропускного пункта16,17,18.
Эти исследования клеток циклов с использованием экстрактов яйцо Xenopus главным образом были основаны на массовых измерений. Однако реакция обычных массовых анализов не могут имитировать реальные ячейки поведения, учитывая крупные расхождения в их размеры и внутриклеточных пространственной разобщенности реакции молекул. Кроме того измерения массовых митотическая деятельности склонны дать ограниченное количество циклов перед быстро демпфирования8. Эти недостатки массовых реакций помешали экстракт системы для дальнейшего понимания сложных часов динамических свойств и функций. Недавние исследования инкапсулированные клетки бесплатно цитостатическим фактор арестован (CSF) Xenopus извлекает19,20 в определенных размер ячейки как отсеков, которые помогли прояснить, как размер шпинделя модулируется цитоплазматическая объем. Однако эта система в vitro арестован в метафаза мейоз II под действием цитостатического фактор1, и системы, способной долгосрочных устойчивых колебаний на уровне одной ячейки необходим для дальнейшего расследования клеточного цикла осциллятор.
Для изучения клеточного цикла колебаний с одной ячейкой резолюции, мы разработали клетки шкала, высокой пропускной способности системы для растворения и одновременное измерение нескольких хозрасчетных митотическая колебательных процессов в отдельных микроэмульсия капельки. В этом подробные видео-протокол мы продемонстрировать создание системы искусственного митотическая колебание, инкапсулируя Велоспорт Xenopus laevis яйцо цитоплазмы в микроэмульсий размером от 10 до 300 мкм. В этой системе были митотическая колебаний, включая конденсация хромосом де конденсации, ядерная оболочка разбивка и Реформации и деградации и синтез анафазе субстратов (например, securin-mCherry в настоящем протоколе) успешно восстановлена.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="593">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Xenopus laevis frogs</td>
			<td style="width:93px;">Xenopus-I Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">QIAprep spin miniprep kit</td>
			<td style="width:93px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">27104</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">QIAquick PCR Purification Kit (250)</td>
			<td style="width:93px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">28106</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td>
			<td style="width:93px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM1340</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">BL21 (DE3)-T-1 competent cell</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B2935</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Calcium ionophore</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A23187</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B2261</td>
			<td style="width:167px;">Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Trichloro</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">448931</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;">Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl) silane</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:215px;">PFPE-PEG surfactant</td>
			<td style="width:93px;">Ran Biotechnologies</td>
			<td style="width:119px;">008-FluoroSurfactant-2wtH-50G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">GE Healthcare Glutathione Sepharose 4B beads</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">GE17-0756-01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">PD-10 column</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">GE17-0851-01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">VitroCom miniature hollow glass tubing</td>
			<td style="width:93px;">VitroCom</td>
			<td style="width:119px;">5012</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Olympus SZ61 Stereo Microscope</td>
			<td style="width:93px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Olympus IX83 microscope</td>
			<td style="width:93px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Olympus FV1200 confocal microscope</td>
			<td style="width:93px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">NanoDrop spectrophotometer</td>
			<td style="width:93px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:119px;">ND-2000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">0.4 mL Snap-Cap Microtubes</td>
			<td style="width:93px;">E&#38;K Scientific</td>
			<td style="width:119px;">485050-B</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="54" rowspan="2" style="height:55px;width:215px;">&#160;PureLink RNA Mini Kit</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">ThermoFisher&#65288;Ambion&#65289;</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">12183018A</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Fisherbrand Analog Vortex Mixer</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">2215365</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Imaris</td>
			<td style="width:93px;">Bitplane</td>
			<td style="width:119px;">Version 7.3</td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of cell-cycle oscillations in microemulsions of cell-free xenopus egg extracts

В реальном времени измерение колебаний на уровне одной ячейки имеет важное значение для выявления механизмов биологические часы. Хотя массовых экстрактов из Xenopus laevis яйца были мощные в рассекает биохимических сетей, лежащие в основе прогрессирования клеточного цикла, среднее измерение их ансамбль обычно приводит к затухающих колебаний, несмотря на каждый Индивидуальные осциллятор имелось. Это из-за сложности идеальной синхронизации между отдельными осцилляторов в шумной биологических систем. Чтобы получить одноклеточных динамика осциллятора, мы разработали систему на основе капельки искусственные клетки, которая может воссоздать митотического цикла в отсеках клеток как инкапсуляция Велоспорт цитоплазматических экстракты Xenopus laevis яиц. Эти простые только цитоплазмы клетки демонстрируют устойчивый колебания для более чем 30 циклов. Для построения более сложных клетки с ядрами, мы добавили demembranated хроматина спермы для самостоятельной сборки вызывают ядер в системе. Мы наблюдали периодических прогрессии хромосома конденсации/decondensation и ядер окутывать разбивка/Реформации, как в реальных клеток. Это означает, что митотическая осциллятор функции добросовестно управлять несколько ниже по течению митотическая события. Мы одновременно отслеживать динамику митотическая осциллятор и технологических процессов в отдельных капель, с помощью микроскопии флуоресцирования многоканальный промежуток времени. Система искусственного клеточного цикла обеспечивает рамки высокой пропускной способностью для количественной обработки и анализа митотическая колебаний с одной ячейкой резолюции, которая вероятно обеспечивает важное понимание механизма регулирования и функции Часы.

Рисунок 2мы показываем, что этот протокол производит митотическая колебания в простой, свободной от-клетки, а также сложные клетки с ядрами, где осциллятор диски циклическое чередование формирования ядер и деформации. Свободных ядрах капель генериров?...

Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts at JoVE.com

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Мы представляем метод для генерации в vitro хозрасчетных митотическая колебаний на уровне одной ячейки, инкапсулируя яйцо экстрактов Xenopus laevis в воду в масло микроэмульсий.

Восстановление клеточного цикла колебаний в микроэмульсий свободных клеток Xenopus яйцо экстрактов

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области системной биологии, такие как механизм регулирования митотической сети и динамические свойства и функции часов клеточного цикла. Основным преимуществом этого метода является то, что он будет генерировать большое количество капель с несколькими циклами клеток в каждом, предоставляя нам высокую пропускную способность для количественных манипуляций и анализа. Для начала отбросьте партии яиц, которые имеют неясные границы между животными и вегетативными полюсами или нерегулярными белыми пятнами поверх полюсов животных.Затем выберите соответствующую партию яиц из одной самки лягушки и перенесите яйца в стакан на 600 миллилитров. Вылейте избыток 0,2x MMR буфера, и осторожно добавить цистеин в 1x буфер экстракт яйца. После этого, встряхнуть стакан энергично вручную, чтобы удалить желе пальто яиц.Повторите эту стирку три раза в общей сложности 800 миллилитров буфера цистеин или до тех пор, пока яйца агрегат и поселиться в нижней части стакана. После того, как желе пальто удаляется, мыть яйца четыре раза в один литр 0,2x MMR раствора. Используйте стеклянную пипету, чтобы забрать и отказаться от яиц, которые побелеют.Налейте буфер MMR из стакана, и добавить 200 миллилитров раствора ионофора кальция в яйца. Используйте стеклянную пипетку, чтобы аккуратно перемешать яйца, пока они не активированы, и удалить раствор ионофора кальция. Оставляя яйца в растворе ионофора кальция слишком долго будет инициировать апоптоз.Мы перемешиваем яйца в течение 1,5 минут и проверяем эффективность активации. Если они не активированы, возобновите перемешивание и проверяйте чаще, пока не будет достигнуто 90%активация. После того, как яйца оседают на дне стакана, проверьте эффективность активации.Хорошо активированные яйца имеют примерно 25% полюса животных и 75% растительного полюса. Затем мыть яйца дважды с общим объемом 50 миллилитров экстракт буфера дополняется ингибиторами протеазы. Затем осторожно перенесите яйца на микротрубку на 0,4 миллилитров.Центрифуга микротрубки в течение 60 секунд при 200 г, а затем при 600 г в течение 30 секунд, чтобы упаковать яйца. Затем используйте стеклянную пипетку Pasteur, чтобы удалить избыток буфера поверх яиц после каждого шага. После этого измельчите яйца при 15 000 г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия.Используйте лезвие бритвы, чтобы разрезать трубки, чтобы отделить три слоя измельченных яиц и сохранить сырую цитоплазму в среднем слое. Затем перенесите сырую цитоплазму для очистки ультрацентрифуговых трубок. Дополнить цитоплазму ингибиторами протеазы и цитохалазином В по 10 микрограммов на миллилитр каждый.Центрифуга сырой цитоплазмы при 15 000 г и 4 градусах Цельсия в течение пяти минут. Затем используйте лезвие бритвы, чтобы вырезать трубку и сохранить цитоплазму в среднем слое. Поместите свежеприготовленные экстракты на лед.Во-первых, добавить securin-mCherry mRNA к подготовленным экстрактам. Далее добавьте 200 микролитров 2%PFPE-PEG фторсурфактанта в смесь экстракта мРНК. Используйте вихревой смеситель для генерации капель, регулируя скорость вихря и продолжительность по мере необходимости.Затем визуально осмотрите капли, чтобы убедиться, что они однородны по размеру. Используя 200-микролитровую пипетку, перенесите плавающие сверху капли и равный объем сурфактанта в трубку ПЦР. Опустите стеклянную трубку в слой капель и подождите, пока капли заполнят примерно 75% трубки.Затем, нажмите трубку в слой сурфактанта, и заполнить трубку полностью. Затем заполните блюдо со стеклянным дном минеральным маслом. Затем используйте тонкие пинцеты, чтобы погрузить заполненные каплями трубки в масле.Используйте стеклянную пипету для удаления видимых обломков или протекающих капель. Чтобы избежать движения и утечки капель, стеклянная трубка, наполненная каплями, должна быть тщательно погружена под минеральное масло. Мы можем либо нажать трубку на обоих концах с балансом или добавить несколько капель минерального масла на концах трубки одновременно в первую очередь.После этого используйте эпифлюоресценции микроскоп оснащен моторизованной стадии XY для изображения капель. Запись замедленного видео в ярком поле и несколько каналов флуоресценции каждые шесть-девять минут, пока капли теряют свою активность. Используя этот протокол, были произведены митотические колебания как в простых, безядерных клетках, так и в сложных клетках с ядрами.Безядерные капли генерируют митотические колебания до 30 неутмперированных циклов в течение 92 часов. Была также изучена способность митотического осциллятора управлять митотичами ниже по течению. Самостоятельный митотический осциллятор привел к изменениям ядерной морфологии, наблюдаемым в результате автономного изменения различных фаз клеточного цикла.При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы помнить время при принятии экстракта, так как это время чувствительных, и всегда держать яйца и экстракт на льду. После своего развития, этот метод проложил путь для исследователей в области системной биологии, чтобы исследовать фундаментальные принципы сложных свойств часов, таких как настройки и стохастичность в Xenopus laevis.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Воссоздание нуклеосом с Дифференциально меченый изотопом побратимов гистонов

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Флуорометрия с фиксацией напряжения в<em&gt; Xenopus</em&gt; Ооциты с использованием флуоресцентных неестественных аминокислот

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Очистка и восстановление TRPV1 для спектроскопического анализа

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Флуоресценции Live клеточной изображений полный вегетативных клеточный цикл из медленно растущих социальных бактерия Myxococcus Ксанф

Fluorescence live-cell imaging of bacterial cells is a key method in the analysis of the spatial and temporal dynamics of proteins and chromosomes ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

В пробирке Воссоздание самоорганизующихся структур белков на поддерживаемых липидных бислоев

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Изучая РНК посредники РНК активирована во время цикла Mammalian клетки киназы протеина

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Абсолютная количественная количественная количественная количественная метания белка без клеток путем обратной фазы жидкой хроматографии-масс-спектрометрии

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Обогащение тканей млекопитающих и ксенопусов с холестерином

Cholesterol enrichment of mammalian tissues and cells, including Xenopus oocytes used for studying cell function, can be accomplished using a variety of ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Бесклеточная продукция протеолипосом для функционального анализа и разработки антител, нацеленных на мембранные белки

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Сайт Конкретные лизин ацетиляции гистонов для нуклеосомы Восстановление с использованием генетического расширения кода в Escherichia coli

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...