Name: reconstitution of cell-cycle oscillations in microemulsions of cell-free xenopus egg extracts
Uploaded: 2018-09-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts at JoVE.com

Agradecemos a Madeleine Lu para construir mCherry securin plásmido, vuelta hombre Lee, Kenneth Ho y Allen P Liu para los debates sobre la generación de gotas, Jeremy B. Chang y James E. Ferrell Jr para proporcionar la que construcción de GFP-NLS. Este trabajo fue financiado por la National Science Foundation (carrera temprana Grant #1553031), los institutos nacionales de salud (MIRA #GM119688) y una beca de investigación de Sloan.

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Michigan.
1. preparación de materiales para la reconstitución del ciclo celular y detección
<ol><li>
Asamblea de Gibson la clonación para la construcción de ADN de plásmido y purificación de mRNA de mCherry securin
	<ol>
<li>Preparar tres fragmentos de la DNA incluyendo una columna vertebral del vector pMTB2, securin y mCherry mediant...

<ol>
	<li>Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+extracts.">Cell cycle extracts.</a> Methods in Cell Biology. 36, 581-605 (1991).</li><li>Hannak, E., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+mitotic+spindle+assembly+and+function+in+vitro+using+Xenopus+laevis+egg+extracts.">Investigating mitotic spindle assembly and function in vitro using Xenopus laevis egg extracts.</a> Nature Protocols. 1, 2305-2314 (2006).</li><li>Murray, A. W., Solomon, M. J., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cyclin+synthesis+and+degradation+in+the+control+of+maturation+promoting+factor+activity.">The role of cyclin synthesis and degradation in the control of maturation promoting factor activity.</a> Nature. 339, 280-286 (1989).</li><li>Yang, Q., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cdk1-APC/C+cell+cycle+oscillator+circuit+functions+as+a+time-delayed,+ultrasensitive+switch.">The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch.</a> Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).</li><li>Chang, J. B., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+trigger+waves+and+the+spatial+coordination+of+the+Xenopus+cell+cycle.">Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle.</a> Nature. 500, 603-607 (2013).</li><li>Trunnell, N. B., Poon, A. C., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitivity+in+the+Regulation+of+Cdc25C+by+Cdk1.">Ultrasensitivity in the Regulation of Cdc25C by Cdk1.</a> Molecular Cell. 41, 263-274 (2011).</li><li>Kim, S. Y., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+competition+as+a+source+of+ultrasensitivity+in+the+inactivation+of+Wee1.">Substrate competition as a source of ultrasensitivity in the inactivation of Wee1.</a> Cell. 128, 1133-1145 (2007).</li><li>Pomerening, J. R., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems-level+dissection+of+the+cell-cycle+oscillator:+bypassing+positive+feedback+produces+damped+oscillations.">Systems-level dissection of the cell-cycle oscillator: bypassing positive feedback produces damped oscillations.</a> Cell. 122, 565-578 (2005).</li><li>Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+a+cell+cycle+oscillator:+hysteresis+and+bistability+in+the+activation+of+Cdc2.">Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2.</a> Nature Cell Biology. 5, 346-351 (2003).</li><li>Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aster+migration+determines+the+length+scale+of+nuclear+separation+in+the+Drosophila+syncytial+embryo.">Aster migration determines the length scale of nuclear separation in the Drosophila syncytial embryo.</a> The Journal of Cell Biology. 197, 887-895 (2012).</li><li>Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+Drosophila+embryo+extract+for+the+study+of+mitosis+ex+vivo.">A single Drosophila embryo extract for the study of mitosis ex vivo.</a> Nature Protocols. 8, 310-324 (2013).</li><li>Tsai, T. Y. C., Theriot, J. A., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+Oscillatory+Dynamics+in+the+Cell+Cycle+of+Early+Xenopus+laevis+Embryos.">Changes in Oscillatory Dynamics in the Cell Cycle of Early Xenopus laevis Embryos.</a> PLoS Biology. 12, e1001788 (2014).</li><li>Chang, J. B., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+trigger+waves+and+the+spatial+coordination+of+the+Xenopus+cell+cycle.">Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle.</a> Nature. 500, 603-607 (2013).</li><li>Yang, Q., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cdk1-APC/C+cell+cycle+oscillator+circuit+functions+as+a+time-delayed,+ultrasensitive+switch.">The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch.</a> Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).</li><li>Kumagai, A., Dunphy, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claspin,+a+novel+protein+required+for+the+activation+of+Chk1+during+a+DNA+replication+checkpoint+response+in+Xenopus+egg+extracts.">Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts.</a> Molecular Cell. 6, 839-849 (2000).</li><li>Chen, R. H., Murray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+spindle+assembly+checkpoint+in+Xenopus+egg+extracts.">Characterization of spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts.</a> Methods in Enzymology. 283, 572-584 (1997).</li><li>Chen, R. H., Waters, J. C., Salmon, E. D., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+spindle+assembly+checkpoint+component+XMAD2+with+unattached+kinetochores.">Association of spindle assembly checkpoint component XMAD2 with unattached kinetochores.</a> Science. 274, 242-246 (1996).</li><li>Minshull, J., Sun, H., Tonks, N. K., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+MAP+kinase-dependent+spindle+assembly+checkpoint+in+Xenopus+egg+extracts.">A MAP kinase-dependent spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts.</a> Cell. 79, 475-486 (1994).</li><li>Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+Volume+Modulates+Spindle+Size+During+Embryogenesis.">Cytoplasmic Volume Modulates Spindle Size During Embryogenesis.</a> Science. 342, 856-860 (2013).</li><li>Hazel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+cytoplasmic+volume+are+sufficient+to+drive+spindle+scaling.">Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling.</a> Science. 342, 853-856 (2013).</li><li>Garibyan, L., Avashia, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+Techniques+Made+Simple:+Polymerase+Chain+Reaction+(PCR).">Research Techniques Made Simple: Polymerase Chain Reaction (PCR).</a> The Journal of Investigative Dermatology. 133, e6 (2013).</li><li>Hecker, K. H., Roux, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+and+low+annealing+temperatures+increase+both+specificity+and+yield+in+touchdown+and+stepdown+PCR.">High and low annealing temperatures increase both specificity and yield in touchdown and stepdown PCR.</a> BioTechniques. 20, 478-485 (1996).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6, 343-345 (2009).</li><li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Plasmid+DNA+into+E.+coli+Using+the+Heat+Shock+Method.">Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method.</a> Journal of Visualized Experiments. 6, e253 (2007).</li><li>Torreilles, S. L., McClure, D. E., Green, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+and+refinement+of+euthanasia+methods+for+Xenopus+laevis.">Evaluation and refinement of euthanasia methods for Xenopus laevis.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48, 512-516 (2009).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+Xenopus+laevis+Testes.">Isolating Xenopus laevis Testes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2007, (2007).</li><li>Showell, C., Conlon, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Egg+Collection+and+In+vitro+Fertilization+of+the+Western+Clawed+Frog+Xenopus+tropicalis.">Egg Collection and In vitro Fertilization of the Western Clawed Frog Xenopus tropicalis.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).</li><li>Wilson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 91, 236-247 (1983).</li><li>Schutze, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+protocol+for+emulsion+polymerase+chain+reaction+and+subsequent+purification.">A streamlined protocol for emulsion polymerase chain reaction and subsequent purification.</a> Analytical Biochemistry. 410, 155-157 (2011).</li><li>Weitz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+in+the+dynamical+behaviour+of+a+compartmentalized+programmable+biochemical+oscillator.">Diversity in the dynamical behaviour of a compartmentalized programmable biochemical oscillator.</a> Nature Chemistry. 6, 295-302 (2014).</li><li>Ho, K. K., Lee, J. W., Durand, G., Majumder, S., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+with+poly(vinyl)+alcohol+surfactant+reduces+double+emulsion-encapsulated+mammalian+cell-free+expression.">Protein aggregation with poly(vinyl) alcohol surfactant reduces double emulsion-encapsulated mammalian cell-free expression.</a> PloS One. 12, e0174689 (2017).</li><li>Nakajima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+circadian+oscillation+of+cyanobacterial+KaiC+phosphorylation+in+vitro.">Reconstitution of circadian oscillation of cyanobacterial KaiC phosphorylation in vitro.</a> Science. 308, 414-415 (2005).</li><li>Guan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+tunable+mitotic+oscillator+in+artificial+cells.">A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells.</a> eLife. 7, (2018).</li></ol>

Hemos presentado un nuevo método para el desarrollo de un sistema celular artificial de alto rendimiento permite vitro en reconstitución y seguimiento a largo plazo de las oscilaciones de ciclo celular autosuficiente a nivel unicelular. Hay varios pasos fundamentales que hacen que este método exitoso. Huevos de Xenopus de primera, recién exprimidos con una buena calidad, en comparación con huevos establecidas, tienden a producir extractos con actividad de oscilación de mayor duración. En segundo ...

Citoplásmicos extractos preparados a partir de huevos de Xenopus laevis representan uno de los modelos más predominantes para el estudio bioquímico de los ciclos celulares, dado el gran volumen de ovocitos, la progresión del ciclo celular rápida y la capacidad de reconstituir eventos mitóticos en vitro1,2. Este sistema ha permitido el descubrimiento inicial y caracterización mecanicista de los reguladores de ciclo celular esencial como factor promotor de maduración (MPF) así como procesos mitotic posteriores incluyendo huso Asamblea y cromosoma segregación1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11. Los extractos de huevos de Xenopus también se han utilizado para la disección detallada de las redes reguladoras del ciclo celular reloj8,12,13,14 y para los estudios de los daños en el ADN /Replication de control15 y huso mitotic Asamblea checkpoint16,17,18.
Estos estudios de los ciclos celulares utilizando los extractos de huevos de Xenopus se han basado principalmente en mediciones masivas. Sin embargo, ensayos de reacción a granel convencional no pueden mímico comportamientos de celular real, dados una discrepancia importante en sus dimensiones y compartimentación subcelular espacial de las moléculas de reacción. Por otra parte, mediciones masivas de actividades mitotic son propensas a dar un número limitado de ciclos antes de amortiguación rápida8. Estas desventajas de reacciones a granel han impedido que el extracto de sistema para proporcionar más comprensión de funciones y propiedades dinámicas complejas de reloj. Estudios recientes han encapsulado citostáticos sin células factor detenido (CFS) Xenopus extractos19,20 en compartimentos de celular-como definido por el tamaño, que han ayudado a dilucidar cómo tamaño de husillo es modulada por el volumen citoplásmico. Sin embargo, este sistema in vitro es detenido en metafase de meiosis II por la acción del factor citostático1, y un sistema capaz de oscilaciones sostenidas a largo plazo en el nivel unicelular es necesaria investigación adicional del ciclo celular oscilador.
Para estudiar las oscilaciones del ciclo celular con una sola célula resolución, hemos desarrollado una escala celular, sistema de alto rendimiento para la reconstitución y la medida simultánea de múltiples procesos oscilatorios mitotic autosostenidos en microemulsión individual gotas. En este detallado video protocolo, demostramos la creación del sistema de oscilación mitotic artificial encapsulando ciclismo citoplasma de huevos de Xenopus laevis en microemulsiones de tamaños que van desde 10 a 300 μm. En este sistema, fueron mitotic oscilaciones como condensación del cromosoma y la condensación, ruptura de la envoltura nuclear y reforma y la degradación y síntesis de sustratos de la anafase (p. ej., securin-mCherry en este protocolo) reconstituido con éxito.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="593">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Xenopus laevis frogs</td>
			<td style="width:93px;">Xenopus-I Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">QIAprep spin miniprep kit</td>
			<td style="width:93px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">27104</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">QIAquick PCR Purification Kit (250)</td>
			<td style="width:93px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">28106</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td>
			<td style="width:93px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM1340</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">BL21 (DE3)-T-1 competent cell</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B2935</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Calcium ionophore</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A23187</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B2261</td>
			<td style="width:167px;">Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Trichloro</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">448931</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;">Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl) silane</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:215px;">PFPE-PEG surfactant</td>
			<td style="width:93px;">Ran Biotechnologies</td>
			<td style="width:119px;">008-FluoroSurfactant-2wtH-50G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">GE Healthcare Glutathione Sepharose 4B beads</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">GE17-0756-01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">PD-10 column</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">GE17-0851-01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">VitroCom miniature hollow glass tubing</td>
			<td style="width:93px;">VitroCom</td>
			<td style="width:119px;">5012</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Olympus SZ61 Stereo Microscope</td>
			<td style="width:93px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Olympus IX83 microscope</td>
			<td style="width:93px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Olympus FV1200 confocal microscope</td>
			<td style="width:93px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">NanoDrop spectrophotometer</td>
			<td style="width:93px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:119px;">ND-2000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">0.4 mL Snap-Cap Microtubes</td>
			<td style="width:93px;">E&#38;K Scientific</td>
			<td style="width:119px;">485050-B</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="54" rowspan="2" style="height:55px;width:215px;">&#160;PureLink RNA Mini Kit</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">ThermoFisher&#65288;Ambion&#65289;</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">12183018A</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Fisherbrand Analog Vortex Mixer</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">2215365</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Imaris</td>
			<td style="width:93px;">Bitplane</td>
			<td style="width:119px;">Version 7.3</td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of cell-cycle oscillations in microemulsions of cell-free xenopus egg extracts

Medición en tiempo real de las oscilaciones en el nivel unicelular es importante descubrir los mecanismos de los relojes biológicos. Aunque extractos bulto preparados de huevos de Xenopus laevis han sido poderosos en disección redes bioquímicas subyacentes a la progresión del ciclo celular, su medición promedio del conjunto por lo general conduce a una oscilación amortiguada, a pesar de cada uno cada oscilador está sostenida. Esto es debido a la dificultad de sincronización perfecta entre osciladores individuales en los sistemas biológicos ruidosos. Para recuperar la dinámica unicelular del oscilador, hemos desarrollado un sistema de célula artificial basada en gotas que puede reconstituir ciclos mitóticos en compartimentos de la célula-como encapsular ciclismo extractos citoplásmicos de los huevos de Xenopus laevis . Estas células sólo citoplasmáticas simples exhiben oscilaciones sostenidas durante más de 30 ciclos. Para construir más complicadas las células con los núcleos, agregamos demembranated la cromatina espermática para activar núcleos uno mismo-montaje en el sistema. Observamos una progresión periódica de cromosoma condensación/decondensation y núcleos envuelven descomposición/reforma, como en las células reales. Esto indica que el oscilador mitotic funcione fielmente para conducir varios eventos mitóticos aguas abajo. Simultáneamente realiza un seguimiento la dinámica del oscilador mitotic y procesos posteriores en gotas individuales utilizando microscopía de fluorescencia Time-lapse de multicanal. El sistema de ciclo celular artificial proporciona un marco de alto rendimiento para la manipulación cuantitativa y análisis de oscilaciones mitóticas con resolución unicelular, que probablemente proporciona penetraciones importantes en la maquinaria reguladora y las funciones de el reloj.

En la figura 2, mostramos que este protocolo produce oscilaciones mitóticas en células simples, libre de nucleares así como complicadas células con núcleo, donde el oscilador conduce la alternancia cíclica de la formación de núcleos y deformación. Las gotas libres de núcleos generan oscilaciones mitóticas hasta a 30 ciclos undamped sobre la duración de 92 horas, según lo indicado por el periódico síntesis y la degradación de una fluorescencia ...

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Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Se presenta un método para la generación de en vitro autosostenido mitotic las oscilaciones en el nivel unicelular encapsulando extractos de huevos de Xenopus laevis en microemulsiones agua en aceite.

Reconstitución de las oscilaciones del ciclo celular en microemulsiones de extractos de huevo libre de Xenopus

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología del sistema, como el mecanismo de regulación detrás de la red mitótica y las propiedades y funciones dinámicas del reloj del ciclo celular. La principal ventaja de esta técnica es que generará una gran cantidad de gotas con múltiples ciclos celulares en cada una, proporcionándonos un marco de alto rendimiento para la manipulación y análisis cuantitativo. Para empezar, deseche lotes de huevos que tengan límites poco claros entre los polos animales y vegetales o manchas blancas irregulares en la parte superior de los postes de animales.A continuación, seleccione un lote apropiado de huevos de una rana hembra y transfiera los huevos a un vaso de precipitados de 600 mililitros. Vierta un exceso de tampón MMR 0.2x, y agregue suavemente cisteína en tampón de extracto 1x a los huevos. Después de esto, agitar el vaso vigorosamente a mano para eliminar las capas de gelatina de los huevos.Repita este lavado tres veces con un total de 800 mililitros de tampones de cisteína o hasta que los huevos se agreguen y se asienten en la parte inferior del vaso de precipitados. Después de retirar la capa de jalea, lave los huevos cuatro veces en un litro de solución 0.2x MMR. Use una pipeta de vidrio para recoger y desechar los huevos que se vuelven blancos.Vierta el tampón MMR fuera del vaso de precipitados y agregue 200 mililitros de solución de ionóforo de calcio en los huevos. Use una pipeta de vidrio para agitar los huevos suavemente hasta que se activen y retire la solución de ionóforo de calcio. Dejar los huevos en solución de ionóforo de calcio durante demasiado tiempo iniciará la apoptosis.Remuevemos los huevos durante 1,5 minutos y comprobamos la eficiencia de activación. Si no están activados, reanude la agitación y compruebe con más frecuencia hasta que se logre una activación del 90%. Después de que los huevos se asienten en la parte inferior del vaso de precipitados, compruebe la eficiencia de activación.Los huevos bien activados tienen aproximadamente el 25% del polo animal y el 75% del polo vegetal. A continuación, lavar los huevos dos veces con un volumen total de 50 mililitros de tampón de extracto complementado con inhibidores de la proteasa. Luego, transfiera cuidadosamente los huevos a un microtubo de tapa de presión de 0,4 mililitros.Centrifugar el microtubo durante 60 segundos a 200 g y luego a 600 g durante 30 segundos para empacar los huevos. A continuación, utilice una pipeta Pasteur de vidrio para eliminar el exceso de tampón en la parte superior de los huevos después de cada paso. Después de esto, tritura los huevos a 15.000 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.Usa una cuchilla de afeitar para cortar los tubos para separar las tres capas de huevos triturados y mantener el citoplasma crudo en la capa media. A continuación, transfiera el citoplasma crudo para limpiar los tubos de ultracentrífuga. Complementar el citoplasma con inhibidores de la proteasa y citocaplasina B a 10 microgramos por mililitro cada uno.Centrifugar el citoplasma crudo a 15.000 g y cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Luego, usa una cuchilla de afeitar para cortar el tubo y mantener el citoplasma en la capa media. Coloque los extractos recién preparados sobre hielo.En primer lugar, agregue el ARNm securin-mCherry a los extractos preparados. A continuación, añada 200 microlitros de 2%fluorosurfactante PFPE-PEG a la mezcla de ARNm de extracto. Utilice un mezclador de vórtice para generar gotas, ajustando la velocidad del vórtice y la duración según sea necesario.A continuación, inspeccione visualmente las gotas para asegurarse de que son uniformes en tamaño. Usando una pipeta de 200 microlitros, transfiera las gotas flotando en la parte superior y un volumen igual de surfactante a un tubo pcR. Sumerja un tubo de vidrio en la capa de gotas y espere hasta que las gotas llenen aproximadamente el 75% del tubo.A continuación, empuje el tubo en la capa de surfactante, y llene el tubo por completo. A continuación, llene un plato con fondo de cristal con aceite mineral. Luego, usa pinzas finas para sumergir el tubo lleno de gotas en el aceite.Utilice una pipeta de vidrio para eliminar los restos visibles o las gotas con fugas. Para evitar el movimiento y la fuga de gotas, el tubo de vidrio lleno de gotas debe sumergirse debajo del aceite mineral con cuidado. Podemos empujar el tubo en ambos extremos con equilibrio o añadir unas gotas de aceite mineral en los extremos del tubo simultáneamente primero.Después de esto, utilice un microscopio de epifluorescencia equipado con una etapa xy motorizada para tomar imágenes de las gotas. Graba vídeos de lapso de tiempo en el campo brillante y múltiples canales de fluorescencia cada seis a nueve minutos hasta que las gotas pierdan su actividad. Usando este protocolo, se produjo una oscilación mitótica tanto en células simples y libres de energía nuclear como en células complicadas con núcleos.Las gotas libres de núcleos generaron oscilación mitótica de hasta 30 ciclos sin amortiguar durante 92 horas. También se examinó la capacidad del oscilador mitótico para conducir eventos mitóticos aguas abajo. El oscilador mitótico autosostenido impulsó los cambios de morfología nuclear observados a través de la alteración autónoma de distintas fases del ciclo celular.Al intentar este procedimiento, es importante recordar tener en cuenta el momento en que se hace el extracto, ya que es sensible al tiempo, y siempre mantener los huevos y extraer en hielo. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología del sistema exploraran los principios fundamentales de las propiedades complejas del reloj, como la tunabilidad y la estocástica en Xenopus laevis.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

La reconstitución de los nucleosomas con histonas hermanas marcadas con isótopos diferencialmente

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Investigación

Bioquímica

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Pinza de tensión Fluorometría en<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocitos Usando Fluorescentes Aminoácidos No Naturales

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Purificación y reconstitución de TRPV1 para análisis espectroscópico

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Imágenes en vivo de la célula de fluorescencia de ciclo completo de células vegetativas de la lento-crecimiento Social bacteria Myxococcus xanthus

Fluorescence live-cell imaging of bacterial cells is a key method in the analysis of the spatial and temporal dynamics of proteins and chromosomes ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitución de la uno mismo-organización de patrones de proteínas en bicapas lipídicas soportadas

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Estudio de interactianos de ARN de la proteína quinasa activada por ARN durante el ciclo de la célula mamífera

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Cuantificación absoluta del metabolismo de síntesis de proteínas sin células por cromatografía líquida de fase inversa-espectrometría de masas

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Enriquecimiento de los tejidos de los mamíferos y los ovocitos del xenopus con el colesterol

Cholesterol enrichment of mammalian tissues and cells, including Xenopus oocytes used for studying cell function, can be accomplished using a variety of ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Producción libre de células de proteoliposomas para análisis funcional y desarrollo de anticuerpos dirigidos a proteínas de membrana

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Sitio Específico De La Acetilación De Lisina De Histonas Para La Reconstitución De Nucleosomas Utilizando La Expansión Del Código Genético En Escherichia coli

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...