Name: reconstitution of cell-cycle oscillations in microemulsions of cell-free xenopus egg extracts
Uploaded: 2018-09-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts at JoVE.com

Vi tackar Madeleine Lu för att konstruera securin-mCherry plasmid, varv Man Lee, Kenneth Ho och Allen P Liu för diskussioner om droplet generation, Jeremy B. Chang och James E. Ferrell Jr för att tillhandahålla GFP-NLS konstruera. Detta arbete stöds av National Science Foundation (tidiga karriär Grant nr 1553031), National Institutes of Health (MIRA #GM119688) och en Sloan Research Fellowship.

Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) från University of Michigan.
1. beredning av material för cellcykeln beredning och upptäckt
<ol><li>
Gibson församlingen kloning för plasmid DNA konstruktion och mRNA rening av securin-mCherry
	<ol>
<li>Förbered tre DNA-fragment med pMTB2 vector ryggraden, securin och mCherry genom polymeras-kedjereaktion (PCR) och gel rening21<sup...

<ol>
	<li>Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+extracts.">Cell cycle extracts.</a> Methods in Cell Biology. 36, 581-605 (1991).</li><li>Hannak, E., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+mitotic+spindle+assembly+and+function+in+vitro+using+Xenopus+laevis+egg+extracts.">Investigating mitotic spindle assembly and function in vitro using Xenopus laevis egg extracts.</a> Nature Protocols. 1, 2305-2314 (2006).</li><li>Murray, A. W., Solomon, M. J., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cyclin+synthesis+and+degradation+in+the+control+of+maturation+promoting+factor+activity.">The role of cyclin synthesis and degradation in the control of maturation promoting factor activity.</a> Nature. 339, 280-286 (1989).</li><li>Yang, Q., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cdk1-APC/C+cell+cycle+oscillator+circuit+functions+as+a+time-delayed,+ultrasensitive+switch.">The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch.</a> Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).</li><li>Chang, J. B., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+trigger+waves+and+the+spatial+coordination+of+the+Xenopus+cell+cycle.">Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle.</a> Nature. 500, 603-607 (2013).</li><li>Trunnell, N. B., Poon, A. C., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitivity+in+the+Regulation+of+Cdc25C+by+Cdk1.">Ultrasensitivity in the Regulation of Cdc25C by Cdk1.</a> Molecular Cell. 41, 263-274 (2011).</li><li>Kim, S. Y., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+competition+as+a+source+of+ultrasensitivity+in+the+inactivation+of+Wee1.">Substrate competition as a source of ultrasensitivity in the inactivation of Wee1.</a> Cell. 128, 1133-1145 (2007).</li><li>Pomerening, J. R., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems-level+dissection+of+the+cell-cycle+oscillator:+bypassing+positive+feedback+produces+damped+oscillations.">Systems-level dissection of the cell-cycle oscillator: bypassing positive feedback produces damped oscillations.</a> Cell. 122, 565-578 (2005).</li><li>Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+a+cell+cycle+oscillator:+hysteresis+and+bistability+in+the+activation+of+Cdc2.">Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2.</a> Nature Cell Biology. 5, 346-351 (2003).</li><li>Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aster+migration+determines+the+length+scale+of+nuclear+separation+in+the+Drosophila+syncytial+embryo.">Aster migration determines the length scale of nuclear separation in the Drosophila syncytial embryo.</a> The Journal of Cell Biology. 197, 887-895 (2012).</li><li>Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+Drosophila+embryo+extract+for+the+study+of+mitosis+ex+vivo.">A single Drosophila embryo extract for the study of mitosis ex vivo.</a> Nature Protocols. 8, 310-324 (2013).</li><li>Tsai, T. Y. C., Theriot, J. A., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+Oscillatory+Dynamics+in+the+Cell+Cycle+of+Early+Xenopus+laevis+Embryos.">Changes in Oscillatory Dynamics in the Cell Cycle of Early Xenopus laevis Embryos.</a> PLoS Biology. 12, e1001788 (2014).</li><li>Chang, J. B., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+trigger+waves+and+the+spatial+coordination+of+the+Xenopus+cell+cycle.">Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle.</a> Nature. 500, 603-607 (2013).</li><li>Yang, Q., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cdk1-APC/C+cell+cycle+oscillator+circuit+functions+as+a+time-delayed,+ultrasensitive+switch.">The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch.</a> Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).</li><li>Kumagai, A., Dunphy, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claspin,+a+novel+protein+required+for+the+activation+of+Chk1+during+a+DNA+replication+checkpoint+response+in+Xenopus+egg+extracts.">Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts.</a> Molecular Cell. 6, 839-849 (2000).</li><li>Chen, R. H., Murray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+spindle+assembly+checkpoint+in+Xenopus+egg+extracts.">Characterization of spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts.</a> Methods in Enzymology. 283, 572-584 (1997).</li><li>Chen, R. H., Waters, J. C., Salmon, E. D., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+spindle+assembly+checkpoint+component+XMAD2+with+unattached+kinetochores.">Association of spindle assembly checkpoint component XMAD2 with unattached kinetochores.</a> Science. 274, 242-246 (1996).</li><li>Minshull, J., Sun, H., Tonks, N. K., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+MAP+kinase-dependent+spindle+assembly+checkpoint+in+Xenopus+egg+extracts.">A MAP kinase-dependent spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts.</a> Cell. 79, 475-486 (1994).</li><li>Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+Volume+Modulates+Spindle+Size+During+Embryogenesis.">Cytoplasmic Volume Modulates Spindle Size During Embryogenesis.</a> Science. 342, 856-860 (2013).</li><li>Hazel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+cytoplasmic+volume+are+sufficient+to+drive+spindle+scaling.">Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling.</a> Science. 342, 853-856 (2013).</li><li>Garibyan, L., Avashia, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+Techniques+Made+Simple:+Polymerase+Chain+Reaction+(PCR).">Research Techniques Made Simple: Polymerase Chain Reaction (PCR).</a> The Journal of Investigative Dermatology. 133, e6 (2013).</li><li>Hecker, K. H., Roux, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+and+low+annealing+temperatures+increase+both+specificity+and+yield+in+touchdown+and+stepdown+PCR.">High and low annealing temperatures increase both specificity and yield in touchdown and stepdown PCR.</a> BioTechniques. 20, 478-485 (1996).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6, 343-345 (2009).</li><li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Plasmid+DNA+into+E.+coli+Using+the+Heat+Shock+Method.">Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method.</a> Journal of Visualized Experiments. 6, e253 (2007).</li><li>Torreilles, S. L., McClure, D. E., Green, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+and+refinement+of+euthanasia+methods+for+Xenopus+laevis.">Evaluation and refinement of euthanasia methods for Xenopus laevis.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48, 512-516 (2009).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+Xenopus+laevis+Testes.">Isolating Xenopus laevis Testes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2007, (2007).</li><li>Showell, C., Conlon, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Egg+Collection+and+In+vitro+Fertilization+of+the+Western+Clawed+Frog+Xenopus+tropicalis.">Egg Collection and In vitro Fertilization of the Western Clawed Frog Xenopus tropicalis.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).</li><li>Wilson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 91, 236-247 (1983).</li><li>Schutze, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+protocol+for+emulsion+polymerase+chain+reaction+and+subsequent+purification.">A streamlined protocol for emulsion polymerase chain reaction and subsequent purification.</a> Analytical Biochemistry. 410, 155-157 (2011).</li><li>Weitz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+in+the+dynamical+behaviour+of+a+compartmentalized+programmable+biochemical+oscillator.">Diversity in the dynamical behaviour of a compartmentalized programmable biochemical oscillator.</a> Nature Chemistry. 6, 295-302 (2014).</li><li>Ho, K. K., Lee, J. W., Durand, G., Majumder, S., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+with+poly(vinyl)+alcohol+surfactant+reduces+double+emulsion-encapsulated+mammalian+cell-free+expression.">Protein aggregation with poly(vinyl) alcohol surfactant reduces double emulsion-encapsulated mammalian cell-free expression.</a> PloS One. 12, e0174689 (2017).</li><li>Nakajima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+circadian+oscillation+of+cyanobacterial+KaiC+phosphorylation+in+vitro.">Reconstitution of circadian oscillation of cyanobacterial KaiC phosphorylation in vitro.</a> Science. 308, 414-415 (2005).</li><li>Guan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+tunable+mitotic+oscillator+in+artificial+cells.">A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells.</a> eLife. 7, (2018).</li></ol>

Vi har lagt fram en roman metod för att utveckla en hög genomströmning konstgjorda cellsystem som möjliggör in vitro beredning och långsiktiga spårning av självunderhållande cell-cykel svängningar på enskild cell nivå. I området i närheten finns det flera kritiska steg som gör denna metod framgångsrika. Första, färskpressad Xenopus ägg med en god kvalitet, jämfört med lagda ägg, tenderar att producera extrakt med längre svängning aktivitet. Andra är inkapsling av extrakter inom ...

Cytoplasmiska extrakt beredd från Xenopus laevis ägg representerar en av de mest dominerande modellerna för biokemiska studier av cell cykler, med tanke på den stora volymen av oocyter, den snabba Cellcykelprogression och förmåga beredning mitotiska händelser in vitro-1,2. Detta system har tillåtit första upptäckten och mekanistiska karakterisering av väsentliga cellcykeln-regulatorer som mognad-främjande faktor (MPF) samt nedströms mitotiska processer inklusive spindel montering och kromosom segregation1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11. Xenopus ägg extrakt har också använts för detaljerad dissektion av de regulatoriska nätverk av cellcykeln klockan8,12,13,14 och för studier av de DNA-skadan /Replication checkpoint15 och den mitotiska spindel montering checkpoint16,17,18.
Dessa studier av cell cykler med Xenopus ägg extrakt har främst baserats på bulk mätningar. Konventionella bulk reaktion analyser kan dock inte efterlikna verkliga cellen beteenden, ges en större diskrepans i sina mått och subcellulär rumslig uppdelning av reaktion molekyler. Dessutom är bulk mätningar av mitotiska aktiviteter benägna att ge ett begränsat antal cykler innan snabbt dämpning8. Dessa nackdelar av bulk reaktioner har förhindrat extrakt systemet för att ge ytterligare förståelse av komplexa klocka dynamiska egenskaper och funktioner. Nyligen genomförda studier har inkapslade cellfria cytostatika faktor-greps (CSF) Xenopus extrakt19,20 i storlek-definierad cell-liknande fack, vilket har bidragit till att belysa hur spindeln storlek moduleras av den cytoplasmiska volym. Men detta in vitro -system anhålls på metafas av meios II av cytostatika faktor1och behövs ett system som är kapabel av långsiktigt hållbar svängningar på enskild cell nivå för vidare utredning av cellcykeln oscillator.
För att studera cellcykeln svängningar med encelliga upplösning, har vi utvecklat en cell-skala, hög genomströmning system för beredning och samtidig mätning av flera självbärande mitotiska oscillerande processer i enskilda mikroemulsion droppar. I detta detaljerad video protokoll visar vi skapandet av konstgjorda mitotiska svängning systemet genom att kapsla in cykling Xenopus laevis ägg cytoplasman i mikroemulsioner i storlekar från 10 till 300 µm. I det här systemet var mitotiska svängningar inklusive kromosom kondens och avinstallation kondens, nuclear envelope uppdelning och reformationen, och nedbrytning och syntes av Anaphasen substrat (t.ex. securin-mCherry i detta protokoll) framgångsrikt ombildade.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="593">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Xenopus laevis frogs</td>
			<td style="width:93px;">Xenopus-I Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">QIAprep spin miniprep kit</td>
			<td style="width:93px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">27104</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">QIAquick PCR Purification Kit (250)</td>
			<td style="width:93px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">28106</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td>
			<td style="width:93px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM1340</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">BL21 (DE3)-T-1 competent cell</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B2935</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Calcium ionophore</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A23187</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B2261</td>
			<td style="width:167px;">Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Trichloro</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">448931</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;">Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl) silane</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:215px;">PFPE-PEG surfactant</td>
			<td style="width:93px;">Ran Biotechnologies</td>
			<td style="width:119px;">008-FluoroSurfactant-2wtH-50G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">GE Healthcare Glutathione Sepharose 4B beads</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">GE17-0756-01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">PD-10 column</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">GE17-0851-01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">VitroCom miniature hollow glass tubing</td>
			<td style="width:93px;">VitroCom</td>
			<td style="width:119px;">5012</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Olympus SZ61 Stereo Microscope</td>
			<td style="width:93px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Olympus IX83 microscope</td>
			<td style="width:93px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Olympus FV1200 confocal microscope</td>
			<td style="width:93px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">NanoDrop spectrophotometer</td>
			<td style="width:93px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:119px;">ND-2000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">0.4 mL Snap-Cap Microtubes</td>
			<td style="width:93px;">E&#38;K Scientific</td>
			<td style="width:119px;">485050-B</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="54" rowspan="2" style="height:55px;width:215px;">&#160;PureLink RNA Mini Kit</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">ThermoFisher&#65288;Ambion&#65289;</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">12183018A</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Fisherbrand Analog Vortex Mixer</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">2215365</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Imaris</td>
			<td style="width:93px;">Bitplane</td>
			<td style="width:119px;">Version 7.3</td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of cell-cycle oscillations in microemulsions of cell-free xenopus egg extracts

Realtid mätning av svängningar på enskild cell nivå är viktigt att avslöja mekanismerna av biologiska klockor. Även bulk extrakt beredd från Xenopus laevis ägg varit kraftfull i dissekera biokemiska nätverk bakom Cellcykelprogression, leder deras ensemble genomsnittliga mätning vanligtvis till en dämpad svängning, trots alla enskilda oscillator är ihållande. Detta beror på svårigheten att perfekt synkronisering bland enskilda oscillatorer i bullriga biologiska system. För att hämta encelliga dynamiken i oscillatorn, utvecklat vi ett droplet-baserade konstgjorda cellsystem som kan rekonstruera mitotiska cykler i cell-liknande fack encapsulating cykling cytoplasmiska extrakt av Xenopus laevis ägg. Dessa enkla endast cytoplasmiska celler uppvisar ihållande svängningar för över 30 cykler. För att bygga mer komplicerade celler med kärnor, vi lagt till demembranated spermier kromatin för att utlösa atomkärnor självmontering i systemet. Vi observerade en periodisk progression av kromosom kondens/decondensation och atomkärnor omsluta uppdelning/reformationen, som i riktiga celler. Detta indikerar att den mitotiska oscillatorn fungerar troget för att driva flera nedströms mitotiska händelser. Vi spårade samtidigt dynamiken i den mitotiska oscillator och nedströmsprocesser i enskilda droppar med flerkanaligt time-lapse fluorescensmikroskopi. Konstgjorda cellcykeln-systemet ger en hög genomströmning ram för kvantitativa manipulation och analys av mitotiska svängningar med encelliga upplösning, vilket sannolikt ger viktiga insikter i de föreskrivande maskiner och funktioner av klockan.

I figur 2visar vi att detta protokoll ger mitotiska svängningar i både enkel, kärnkraft celler samt komplicerade celler med kärnor, där oscillatorn driver cykliska växlingen mellan atomkärnor bildandet och deformation. Atomkärnor-fri droppar generera mitotiska svängningar upp till 30 odämpad cykler över tidsrymden 92 timmar, som indikeras av periodiska syntes och nedbrytning av en fluorescens reporter securin-mCherry (figur 2A<...

Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts at JoVE.com

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Vi presenterar en metod för generering av in vitro- självbärande mitotiska svängningar på enskild cell nivå genom att kapsla in ägg extrakt av Xenopus laevis i vatten-i-olja mikroemulsioner.

Beredning av cellcykeln svängningar i mikroemulsioner av cellfria Xenopus ägg extrakt

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor inom systembiologiområdet, såsom den reglerande mekanismen bakom det mitotiska nätverket och cellcykelklockans dynamiska egenskaper och funktioner. Den största fördelen med denna teknik är att det kommer att generera en stor mängd droppar med flera cellcykler i varje, vilket ger oss en hög genomströmning ram för kvantitativ manipulation och analys. Till att börja kasta partier av ägg som har oklara gränser mellan djur och vegetal stolpar eller oregelbundna vita fläckar ovanpå djurstänger.Välj därefter en lämplig sats ägg från en kvinnlig groda och överför äggen till en 600-milliliter bägare. Häll ut ett överskott av 0.2x MMR buffert, och försiktigt lägga cystein i 1x extrakt buffert till äggen. Efter detta, skaka bägaren kraftigt för hand för att ta bort gelé rockar av äggen.Upprepa denna tvätt tre gånger med totalt 800 milliliter cysteinbuffert eller tills äggen aggregerar och lägger sig i botten av bägaren. Efter gelé pälsen tas bort, tvätta äggen fyra gånger i en liter 0,2 x MMR lösning. Använd en glaspipett för att plocka upp och kasta äggen som blir vita.Häll MMR-bufferten ur bägaren och tillsätt 200 milliliter kalciumjonoforlösning i äggen. Använd en glaspipett för att röra äggen försiktigt tills de aktiveras, och ta bort kalciumjonofalösningen. Lämnar äggen i kalciumjonoforlösning för länge kommer att inleda apoptos.Vi rör äggen i 1,5 minuter och kontrollerar aktiveringseffektiviteten. Om de inte aktiveras, återuppta omrörning, och kontrollera oftare tills 90%aktivering uppnås. Efter äggen bosätta sig i botten av bägaren, kontrollera aktiveringen effektivitet.Välaktiverade ägg har cirka 25%av djurpolen och 75%av vegetal polen. Därefter tvätta äggen två gånger med en total volym på 50 milliliter extraktbuffert kompletterat med proteashämmare. Sedan, försiktigt överföra äggen till en 0,4-milliliter snap-cap microtube.Centrifugera mikroröret i 60 sekunder vid 200 g och sedan vid 600 g i 30 sekunder för att packa äggen. Använd sedan en pasteurpipett av glas för att ta bort överskottsbufferten ovanpå äggen efter varje steg. Efter detta, krossa äggen vid 15, 000 g i 10 minuter vid fyra grader Celsius.Använd ett rakblad för att skära rören för att separera de tre skikten av krossade ägg och hålla rå cytoplasma i mellanskiktet. Sedan överföra rå cytoplasma till rena ultracentrifugrör. Komplettera cytoplasman med proteashämmare och cytochalasin B vid 10 mikrogram per milliliter vardera.Centrifugera den råa cytoplasman vid 15, 000 g och fyra grader Celsius i fem minuter. Använd sedan ett rakblad för att skära röret och hålla cytoplasman i mellanskiktet. Placera de nyberedda extrakten på is.Lägg först till Securin-mCherry mRNA till de beredda extrakten. Därefter lägger du till 200 mikroliter av 2%PFPE-PEG fluorsurfaktant till extraktet mRNA-blandningen. Använd en vortex mixer för att generera droppar, justera virvelhastighet och varaktighet efter behov.Sedan, inspektera visuellt dropparna för att säkerställa att de är enhetliga i storlek. Med hjälp av en 200-mikroliterpipett överför du dropparna som flyter ovanpå och en lika stor volym ytaktivt vatten till ett PCR-rör. Doppa ett glasrör i droppskiktet, och vänta tills dropparna fyller ungefär 75%av röret.Tryck sedan in röret i det ytaktiva lagret och fyll röret helt. Fyll därefter en glasbottnad maträtt med mineralolja. Använd sedan finpincett för att sänka ner droppfyllda röret i oljan.Använd en glaspipett för att ta bort eventuellt synligt skräp eller läckta droppar. För att undvika förflyttning och läckage av droppar bör glasröret fyllt med droppar sänkas ned under mineralolja försiktigt. Vi kan antingen driva röret på båda ändarna med balans eller tillsätt några droppar mineralolja på ändarna av röret samtidigt först.Efter detta, använd ett epifluorescens mikroskop utrustad med en motoriserad xy-stadiet för att avbilda dropparna. Record time-lapse videor i det ljusa fältet och flera fluorescens kanaler var sjätte till nio minuter tills dropparna förlorar sin verksamhet. Med hjälp av detta protokoll producerades mitotiska svängning i både enkla, kärnfria celler och komplicerade celler med atomkärnor.De kärnorfria dropparna genererade mitotisk svängning upp till 30 undamped cykler under 92 timmar. Mitotiska oscillatorns förmåga att köra nedströms mitotiska händelser undersöktes också. Den självihållande mitotiska oscillator körde förändringar av nukleärmorfologi observeras genom den autonoma förändringen av distinkta cell-cykel faser.Medan du försöker detta förfarande, Det är viktigt att komma ihåg den tid när du gör extraktet, eftersom det är tidskänsliga, och alltid hålla ägg och extrakt på is. Efter dess utveckling banade denna teknik vägen för forskare inom systembiologi att utforska grundläggande principer för komplexa klockegenskaper, som tunbarhet och stokastik i Xenopus laevis.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Beredning av Nukleosomer med differentiellt isotopmärkt Sister Histoner

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Spänningsklämma Fluorometry in<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocyter Användande Fluorescerande Onaturliga Aminosyror

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Rening och beredning av TRPV1 för spektroskopisk analys

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Fluorescens Live-cell Imaging av komplett vegetativ cellcykeln av den långsamt växande sociala bakterien Myxococcus xanthus

Fluorescence live-cell imaging of bacterial cells is a key method in the analysis of the spatial and temporal dynamics of proteins and chromosomes ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Beredning av självorganiserande Protein mönster på stöds Lipid lipidmonolager

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Studera RNA interactmedlemmar av proteinkinas RNA-aktiverad under däggdjur cellcykeln

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Absolut kvantifiering av cellfri protein syntes metabolism genom omvänd fas vätskekromatografi-masspektrometri

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Anrikning av däggdjursvävnader och Xenopus Oocyter med kolesterol

Cholesterol enrichment of mammalian tissues and cells, including Xenopus oocytes used for studying cell function, can be accomplished using a variety of ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Cellfri produktion av proteoliposomer för funktionell analys och antikroppsutveckling riktad mot membranproteiner

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Platsspecifik lysin acetylering av histoner för nukleosomkonstitution med hjälp av genetisk kodexpansion i Escherichia coli

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...