Name: reconstitution of cell-cycle oscillations in microemulsions of cell-free xenopus egg extracts
Uploaded: 2018-09-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts at JoVE.com

Madeleine Lu securin mCherry plazmid, kucak adam Lee, Kenneth Ho ve Allen P Liu damlacık üretimi hakkında tartışmalar için Jeremy B. Chang ve James E. Ferrell Jr GFP NLS oluşturmak sağlamak için inşa için teşekkür ediyoruz. Bu eser Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir (erken kariyer Grant #1553031), Ulusal Sağlık Enstitüleri (MIRA #GM119688) ve Sloan araştırma bursu.

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) University of Michigan tarafından onaylanmıştır.
1. hücre döngüsü sulandırma ve algılama için malzemeler hazırlanması
<ol><li>
Gibson plazmid DNA İnşaat ve securin-mCherry mRNA arıtma için klonlama derleme
	<ol>
<li>Bir pMTB2 vektör omurga, securin ve mCherry polimeraz zincir tepkimesi (PCR) ile de dahil olmak üzere üç DNA parçalarının hazırlamak ve arıtma<sup class...

<ol>
	<li>Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+extracts.">Cell cycle extracts.</a> Methods in Cell Biology. 36, 581-605 (1991).</li><li>Hannak, E., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+mitotic+spindle+assembly+and+function+in+vitro+using+Xenopus+laevis+egg+extracts.">Investigating mitotic spindle assembly and function in vitro using Xenopus laevis egg extracts.</a> Nature Protocols. 1, 2305-2314 (2006).</li><li>Murray, A. W., Solomon, M. J., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cyclin+synthesis+and+degradation+in+the+control+of+maturation+promoting+factor+activity.">The role of cyclin synthesis and degradation in the control of maturation promoting factor activity.</a> Nature. 339, 280-286 (1989).</li><li>Yang, Q., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cdk1-APC/C+cell+cycle+oscillator+circuit+functions+as+a+time-delayed,+ultrasensitive+switch.">The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch.</a> Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).</li><li>Chang, J. B., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+trigger+waves+and+the+spatial+coordination+of+the+Xenopus+cell+cycle.">Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle.</a> Nature. 500, 603-607 (2013).</li><li>Trunnell, N. B., Poon, A. C., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitivity+in+the+Regulation+of+Cdc25C+by+Cdk1.">Ultrasensitivity in the Regulation of Cdc25C by Cdk1.</a> Molecular Cell. 41, 263-274 (2011).</li><li>Kim, S. Y., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+competition+as+a+source+of+ultrasensitivity+in+the+inactivation+of+Wee1.">Substrate competition as a source of ultrasensitivity in the inactivation of Wee1.</a> Cell. 128, 1133-1145 (2007).</li><li>Pomerening, J. R., Kim, S. Y., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems-level+dissection+of+the+cell-cycle+oscillator:+bypassing+positive+feedback+produces+damped+oscillations.">Systems-level dissection of the cell-cycle oscillator: bypassing positive feedback produces damped oscillations.</a> Cell. 122, 565-578 (2005).</li><li>Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+a+cell+cycle+oscillator:+hysteresis+and+bistability+in+the+activation+of+Cdc2.">Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2.</a> Nature Cell Biology. 5, 346-351 (2003).</li><li>Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aster+migration+determines+the+length+scale+of+nuclear+separation+in+the+Drosophila+syncytial+embryo.">Aster migration determines the length scale of nuclear separation in the Drosophila syncytial embryo.</a> The Journal of Cell Biology. 197, 887-895 (2012).</li><li>Telley, I. A., Gaspar, I., Ephrussi, A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+Drosophila+embryo+extract+for+the+study+of+mitosis+ex+vivo.">A single Drosophila embryo extract for the study of mitosis ex vivo.</a> Nature Protocols. 8, 310-324 (2013).</li><li>Tsai, T. Y. C., Theriot, J. A., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+Oscillatory+Dynamics+in+the+Cell+Cycle+of+Early+Xenopus+laevis+Embryos.">Changes in Oscillatory Dynamics in the Cell Cycle of Early Xenopus laevis Embryos.</a> PLoS Biology. 12, e1001788 (2014).</li><li>Chang, J. B., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+trigger+waves+and+the+spatial+coordination+of+the+Xenopus+cell+cycle.">Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle.</a> Nature. 500, 603-607 (2013).</li><li>Yang, Q., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cdk1-APC/C+cell+cycle+oscillator+circuit+functions+as+a+time-delayed,+ultrasensitive+switch.">The Cdk1-APC/C cell cycle oscillator circuit functions as a time-delayed, ultrasensitive switch.</a> Nature Cell Biology. 15, 519-525 (2013).</li><li>Kumagai, A., Dunphy, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claspin,+a+novel+protein+required+for+the+activation+of+Chk1+during+a+DNA+replication+checkpoint+response+in+Xenopus+egg+extracts.">Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts.</a> Molecular Cell. 6, 839-849 (2000).</li><li>Chen, R. H., Murray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+spindle+assembly+checkpoint+in+Xenopus+egg+extracts.">Characterization of spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts.</a> Methods in Enzymology. 283, 572-584 (1997).</li><li>Chen, R. H., Waters, J. C., Salmon, E. D., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+spindle+assembly+checkpoint+component+XMAD2+with+unattached+kinetochores.">Association of spindle assembly checkpoint component XMAD2 with unattached kinetochores.</a> Science. 274, 242-246 (1996).</li><li>Minshull, J., Sun, H., Tonks, N. K., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+MAP+kinase-dependent+spindle+assembly+checkpoint+in+Xenopus+egg+extracts.">A MAP kinase-dependent spindle assembly checkpoint in Xenopus egg extracts.</a> Cell. 79, 475-486 (1994).</li><li>Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+Volume+Modulates+Spindle+Size+During+Embryogenesis.">Cytoplasmic Volume Modulates Spindle Size During Embryogenesis.</a> Science. 342, 856-860 (2013).</li><li>Hazel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+cytoplasmic+volume+are+sufficient+to+drive+spindle+scaling.">Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling.</a> Science. 342, 853-856 (2013).</li><li>Garibyan, L., Avashia, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+Techniques+Made+Simple:+Polymerase+Chain+Reaction+(PCR).">Research Techniques Made Simple: Polymerase Chain Reaction (PCR).</a> The Journal of Investigative Dermatology. 133, e6 (2013).</li><li>Hecker, K. H., Roux, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+and+low+annealing+temperatures+increase+both+specificity+and+yield+in+touchdown+and+stepdown+PCR.">High and low annealing temperatures increase both specificity and yield in touchdown and stepdown PCR.</a> BioTechniques. 20, 478-485 (1996).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6, 343-345 (2009).</li><li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Plasmid+DNA+into+E.+coli+Using+the+Heat+Shock+Method.">Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method.</a> Journal of Visualized Experiments. 6, e253 (2007).</li><li>Torreilles, S. L., McClure, D. E., Green, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+and+refinement+of+euthanasia+methods+for+Xenopus+laevis.">Evaluation and refinement of euthanasia methods for Xenopus laevis.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48, 512-516 (2009).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+Xenopus+laevis+Testes.">Isolating Xenopus laevis Testes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2007, (2007).</li><li>Showell, C., Conlon, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Egg+Collection+and+In+vitro+Fertilization+of+the+Western+Clawed+Frog+Xenopus+tropicalis.">Egg Collection and In vitro Fertilization of the Western Clawed Frog Xenopus tropicalis.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).</li><li>Wilson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 91, 236-247 (1983).</li><li>Schutze, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+protocol+for+emulsion+polymerase+chain+reaction+and+subsequent+purification.">A streamlined protocol for emulsion polymerase chain reaction and subsequent purification.</a> Analytical Biochemistry. 410, 155-157 (2011).</li><li>Weitz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+in+the+dynamical+behaviour+of+a+compartmentalized+programmable+biochemical+oscillator.">Diversity in the dynamical behaviour of a compartmentalized programmable biochemical oscillator.</a> Nature Chemistry. 6, 295-302 (2014).</li><li>Ho, K. K., Lee, J. W., Durand, G., Majumder, S., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+with+poly(vinyl)+alcohol+surfactant+reduces+double+emulsion-encapsulated+mammalian+cell-free+expression.">Protein aggregation with poly(vinyl) alcohol surfactant reduces double emulsion-encapsulated mammalian cell-free expression.</a> PloS One. 12, e0174689 (2017).</li><li>Nakajima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+circadian+oscillation+of+cyanobacterial+KaiC+phosphorylation+in+vitro.">Reconstitution of circadian oscillation of cyanobacterial KaiC phosphorylation in vitro.</a> Science. 308, 414-415 (2005).</li><li>Guan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+and+tunable+mitotic+oscillator+in+artificial+cells.">A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells.</a> eLife. 7, (2018).</li></ol>

Biz yüksek üretilen iş yapay hücre sistemi geliştirmek için bir roman yöntemi o olanaklı kılmak içinde vitro sulandırma ve uzun vadeli kendini sürekli hücre döngüsü salınımlarını tek hücre düzeyinde izlenmesine sundu. Bu yöntem başarılı yapmak birkaç kritik adım vardır. İyi bir kalite ile ilk, taze sıkılmış Xenopus yumurta koydu yumurta ile karşılaştırıldığında, özleri ile uzun süreli salınım etkinliğini üretmek eğilimindedir. İkinci olarak, kapsülleme ...

Sitoplazmik özleri Xenopus laevis yumurtadan hazırlanan hücre döngüsü, yumurta, Hızlı hücre döngüsü ilerleme ve başlamaktan yeteneğine büyük miktarda verilen biyokimyasal çalışma için en baskın modellerinden birini temsil mitotik olaylar vitro1,2. Derleme ve kromozom ayrımı1 de dahil olmak üzere aşağı akım mitotik işlemlerin yanı sıra faktör (MPF) olgunlaşma teşvik iğ gibi bu sistemi ilk keşif ve mekanik temel hücre döngüsü düzenleyiciler karakterizasyonu izin verdi ,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11. Xenopus yumurta özleri da çalışmalar DNA hasarı ve hücre döngüsü saat8,12,13,14 düzenleyici ağların ayrıntılı diseksiyon için kullanılmıştır /Replication denetim noktası15 ve mitotik Milli Meclis denetim noktası16,17,18.
Hücre döngüsü Xenopus yumurta özleri kullanarak bu çalışmaları esas olarak toplu ölçümler dayalı olmuştur. Ancak, geleneksel toplu tepki deneyleri değil taklit gerçek hücre davranışları, kendi boyutları ve reaksiyon moleküller hücre altı kayma compartmentalization büyük bir farklılık göz önüne alındığında. Ayrıca, mitotik aktiviteleri toplu ölçümleri hızlı bir şekilde8sönümleme önce döngüleri sınırlı sayıda vererek yatkındır. Bu dezavantajları toplu tepkiler daha fazla karmaşık saat dinamik özellikler ve işlevler anlayışı sağlamak için özü sistem engellemiş. Son yıllarda yapılan çalışmalarda faktör tutuklandı (CSF) Xenopus içine nasıl iğ boyutu tarafından modüle aydınlatmak yardım boyut tanımlı hücre benzeri bölmeleri,19,20 ayıklar boş hücre sitostatik kapsüllenmiş sitoplazmik birim. Ancak, bu vitro sistem mayoz II metafaz sitostatik faktörü1eylem tarafından tutuklandı ve bir sistemi uzun vadeli sürekli salınım tek hücre düzeyinde daha fazla araştırma yapılması hücre döngüsü için gereklidir osilatör.
Hücre döngüsü salınımlarını tek hücreli çözünürlük ile çalışmak için geliştirdiğimiz bir hücre ölçekli, sulandırma ve aynı anda birden çok kendini sürekli mitotik salınım işlemlerinde bireysel microemulsion ölçümü için yüksek üretilen iş sistem damlacıkları. Bu ayrıntılı video protokol için biz Bisiklete binme Xenopus laevis yumurta sitoplazma microemulsions 10'dan 300 µm arasında değişen boyutlarda Kapsüllenen tarafından yapay mitotik salınım sisteminin oluşturulması göstermektedir. Bu sistemde, mitotik salınımlarını kromozom yoğunlaşma ve de-yoğunlaşma, nükleer zarf arıza ve reform ve bozulma ve anafaz yüzeylerde (Örneğin, securin-mCherry bu protokolü) sentezi gibi olduğunu başarılı bir şekilde yeniden düzenlendi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="593">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Xenopus laevis frogs</td>
			<td style="width:93px;">Xenopus-I Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">QIAprep spin miniprep kit</td>
			<td style="width:93px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">27104</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">QIAquick PCR Purification Kit (250)</td>
			<td style="width:93px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">28106</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td>
			<td style="width:93px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM1340</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">BL21 (DE3)-T-1 competent cell</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B2935</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Calcium ionophore</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A23187</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B2261</td>
			<td style="width:167px;">Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Trichloro</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">448931</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;">Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl) silane</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:215px;">PFPE-PEG surfactant</td>
			<td style="width:93px;">Ran Biotechnologies</td>
			<td style="width:119px;">008-FluoroSurfactant-2wtH-50G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">GE Healthcare Glutathione Sepharose 4B beads</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">GE17-0756-01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">PD-10 column</td>
			<td style="width:93px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">GE17-0851-01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">VitroCom miniature hollow glass tubing</td>
			<td style="width:93px;">VitroCom</td>
			<td style="width:119px;">5012</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Olympus SZ61 Stereo Microscope</td>
			<td style="width:93px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Olympus IX83 microscope</td>
			<td style="width:93px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">Olympus FV1200 confocal microscope</td>
			<td style="width:93px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">NanoDrop spectrophotometer</td>
			<td style="width:93px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:119px;">ND-2000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:215px;">0.4 mL Snap-Cap Microtubes</td>
			<td style="width:93px;">E&#38;K Scientific</td>
			<td style="width:119px;">485050-B</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="54" rowspan="2" style="height:55px;width:215px;">&#160;PureLink RNA Mini Kit</td>
			<td rowspan="2" style="width:93px;">ThermoFisher&#65288;Ambion&#65289;</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">12183018A</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Fisherbrand Analog Vortex Mixer</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">2215365</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Imaris</td>
			<td style="width:93px;">Bitplane</td>
			<td style="width:119px;">Version 7.3</td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of cell-cycle oscillations in microemulsions of cell-free xenopus egg extracts

Gerçek zamanlı ölçüm salınımlarını tek hücre düzeyinde biyolojik saatler mekanizmaları ortaya çıkarmak önemlidir. Xenopus laevis yumurtadan hazırlanan toplu özleri biyokimyasal ağlar hücre döngüsü ilerleme temel anatomi güçlü olmasına rağmen kendi topluluğu ortalama ölçüm genellikle her rağmen damped bir salınım yol açar bireysel osilatör sürekli. Bu bireysel osilatörler arasında mükemmel senkronizasyon zorluk gürültülü biyolojik sistemlerde kaynaklanmaktadır. Osilatör tek hücre dinamiği almak için mitotik döngüleri hücre benzeri bölmeleri Xenopus laevis yumurta Bisiklete binme sitoplazmik özleri Kapsüllenen sulandırmak bir yapay hücre damlacık tabanlı sistem geliştirdi. Bu basit salt sitoplazmik hücreler sürekli salınım 30'dan fazla devredir sergi. Çekirdeği ile daha karmaşık hücreleri oluşturmak için demembranated sperm kromatin çekirdeği, kendinden montajlı sistemdeki tetiklemek için eklendi. Biz kromozom yoğunlaşma/decondensation periyodik bir ilerleme gözlenen ve çekirdek dökümü/reformasyon, gibi gerçek hücrelerde örtmek. Bu mitotik osilatör sadakatle birden çok akış aşağı mitotik olay sürücü çalışmasını gösterir. Aynı anda mitotik osilatör ve bireysel damlacıkları çok kanallı hızlandırılmış floresans mikroskobu kullanarak karşıdan akış süreçlerinde dinamiklerini tespit ettik. Yapay hücre döngüsü sistem yüksek üretilen iş çerçeve nicel manipülasyon ve mitotik salınımlarını ile büyük olasılıkla önemli anlayışlar düzenleyici makine ve fonksiyonları sağlar tek hücreli kararlılık analizi için sağlar saat.

Şekil 2' de, biz bu protokolü hem basit, nükleer özgür hücreleri hem de nereye osilatör çekirdek oluşumu ve deformasyon çevrimsel değişim sürücüler çekirdeği, karmaşık hücrelerle mitotik salınımları üretir gösterir. Çekirdeği-Alerjik damlacıkları mitotik salınımlarını kadar 30 undamped devir için 92 saat, zaman span üzerinden periyodik sentez ve bir floresan muhabir securin-mCherry (Şekil 2A) b...

Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts at JoVE.com

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Biz petrol su microemulsions içinde Xenopus laevis yumurta özleri Kapsüllenen tarafından vitro kendini sürekli mitotik salınımlarını tek hücre düzeyinde nesil için bir yöntem mevcut.

Microemulsions boş hücre Xenopus yumurtanın hücre döngüsü salınımlarını sulandırma ayıklar

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Bu yöntem, mitotik ağın arkasındaki düzenleyici mekanizma ve hücre döngüsü saatinin dinamik özellikleri ve işlevleri gibi sistem biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, her birinde birden fazla hücre döngüsü olan büyük miktarda damlacık üreterek bize nicel manipülasyon ve analiz için yüksek işlem çerçevesi sağlamasıdır. Başlamak için, hayvan ve bitkisel direkler veya hayvan direkleri üstüne düzensiz beyaz noktalar arasında belirsiz sınırları olan yumurta toplu atın.Daha sonra, bir dişi kurbağa dan uygun bir yumurta toplu seçin ve 600 mililitrelik bir kabına yumurta aktarın. 0,2x MMR tampon fazla dökün ve yavaşça yumurta 1x özü tampon sistein ekleyin. Bundan sonra, yumurta jöle kat kaldırmak için elle şiddetle beher sallayın.Bu yıkamayı toplam 800 mililitre sistein tamponuyla veya yumurtalar toplayıp kabın dibine yerleşene kadar üç kez tekrarlayın. Jöle kat çıkarıldıktan sonra, 0.2x MMR çözeltisi bir litre yumurta dört kez yıkayın. Almak ve beyaz açmak yumurta atmak için bir cam pipet kullanın.Kabın içinden MMR tamponu dökün ve yumurtaların içine 200 mililitre kalsiyum iyonofon çözeltisi ekleyin. Onlar aktive olana kadar yavaşça yumurta karıştırın ve kalsiyum iyonofçözeltisi solüsyonu kaldırmak için bir cam pipet kullanın. Çok uzun süre kalsiyum iyonofor çözeltisi yumurta bırakarak apoptoz başlatacaktır.Yumurtaları 1,5 dakika karıştırıyoruz ve aktivasyon verimliliğini kontrol ediyoruz. Etkinleştirilmedikleri takdirde karıştırmaya devam edin ve %90 etkinleştirme elde edilene kadar daha sık kontrol edin. Yumurtalar kabın dibine yerleştikten sonra aktivasyon verimliliğini kontrol edin.İyi aktive edilmiş yumurtalar hayvan direğinin yaklaşık %25'ine ve bitkisel direğin %75'ine sahiptir. Daha sonra, proteaz inhibitörleri ile desteklenen ekstresi tampon toplam hacmi ile iki kez yumurta yıkayın. Daha sonra yumurtaları dikkatlice 0.4 mililitrelik bir mikrotüpe aktarın.200 g 60 saniye ve sonra 600 g 30 saniye yumurta paketi için mikrotüp santrifüj. Daha sonra, her adımdan sonra yumurta üstüne fazla tampon kaldırmak için bir cam Pasteur pipet kullanın. Bundan sonra, 15,000 g dört santigrat derece 10 dakika yumurta ezmek.Ezilmiş yumurta üç kat ayırmak ve orta tabakada ham sitoplazma tutmak için tüpleri kesmek için bir jilet kullanın. Sonra, ultracentrifuge tüpleri temizlemek için ham sitoplazma aktarın. Her mililitre başına 10 mikrogram proteaz inhibitörleri ve sitokasin B ile sitoplazma tamam.Ham sitoplazmayı 15, 000 g ve dört santigrat derecede beş dakika santrifüj edin. Sonra, tüp kesmek ve orta tabakada sitoplazma tutmak için bir jilet kullanın. Buz üzerine taze hazırlanmış özler yerleştirin.Öncelikle hazırlanan ekstrelere securin-mCherry mRNA ekleyin. Daha sonra, ekstrakt mRNA karışımına %2 PFPE-PEG florosüraktif 200 mikrolitre ekleyin. Damlacıklar oluşturmak için bir girdap karıştırıcı kullanın, girdap hızını ve süresini gerektiği gibi ayarlayarak.Daha sonra, damlacıkları görsel olarak inceleyerek boyutlarının düzgün olduğundan emin olun. 200 mikrolitrelik pipet kullanarak, üstte yüzen damlacıkları ve eşit hacimli yüzey aktif maddeyi PCR tüpüne aktarın. Damlacık tabakasıiçine cam bir tüp batırın ve damlacıkları tüpün yaklaşık% 75 doldurun kadar bekleyin.Sonra, yüzey aktif tabaka içine tüp itin ve tüp tamamen doldurun. Sonra, mineral yağ ile cam dipli çanak doldurun. Daha sonra, damlacık dolu tüpü yağa batırmak için ince cımbız kullanın.Görünür enkaz veya sızdırılmış damlacıkları kaldırmak için cam bir pipet kullanın. Damlacıkların hareket etmesini ve sızmasını önlemek için damlacıklarla dolu cam tüp mineral yağın altına dikkatlice daldırılmalıdır. Biz ya denge ile her iki ucunda tüp itebilir ya da aynı anda ilk tüpün uçlarında mineral yağ birkaç damla ekleyebilirsiniz.Bundan sonra, damlacıkları görüntülemek için motorlu xy aşaması ile donatılmış bir epifloresan mikroskobu kullanın. Damlacıklar aktivitelerini kaybedene kadar her altı ila dokuz dakikada bir parlak alanda ve birden fazla floresan kanalında hızlandırılmış videolar kaydedin. Bu protokol kullanılarak hem basit, hem nükleer içermeyen hücrelerde hem de çekirdekli komplike hücrelerde mitotik salınım üretildi.Çekirdeksiz damlacıklar 92 saat boyunca 30'a kadar mitotik salınım yarattı. Mitotik osilatörün mitotik olayları aşağı doğru sürme yeteneği de incelendi. Kendi kendini idame ettiren mitotik osilatör, farklı hücre döngüsü evrelerinin otonom değişimi ile gözlenen nükleer morfolojideğişikliklerine yol açmaktadır.Bu prosedürü çalışırken, zaman ayarı yaparken zaman akla almak önemlidir, zamana duyarlı olduğu gibi, ve her zaman yumurta tutmak ve buz üzerinde ayıklamak. Bu teknik, geliştirildikten sonra, sistem biyolojisi alanında araştırmacıların Xenopus laevis'te alabilme ve stochastisite gibi karmaşık saat özelliklerinin temel ilkelerini keşfetmelerinin önünü açmıştır.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Farklı Olarak izotopla işaretli Kardeş histonlarla nükleozomlann Sulandırma

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Voltaj kelepçesi florometrisi<em&gt; Xenopus</emFloresan Doğal Olmayan Amino Asitler Kullanan Oositler

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Arıtma ve TRPV1 sulandırma spektroskopik analizi için

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Floresans Live-hücre görüntüleme, tam bitkisel hücre döngüsü yavaş büyüyen sosyal bakteri Myxococcus xanthus

Fluorescence live-cell imaging of bacterial cells is a key method in the analysis of the spatial and temporal dynamics of proteins and chromosomes ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

Vitro Sulandırma Protein kalıpları üzerinde desteklenen Lipid Bilayers kendi kendini düzenleme

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

RNA Interactors Protein kinaz memeli hücre döngüsü sırasında RNA-harekete geçirmek, eğitim

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Ters Faz Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi Ile Hücresiz Protein Sentezmetabolizmasının Mutlak Niceliği

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Memeli Dokuları ve Kenopus Oositlerinin Kolesterol ile Zenginleşmesi

Cholesterol enrichment of mammalian tissues and cells, including Xenopus oocytes used for studying cell function, can be accomplished using a variety of ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Membran Proteinlerini Hedefleyen Fonksiyonel Analiz ve Antikor Gelişimi için Proteolipozomların Hücresiz Üretimi

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Escherichia coli'de Genetik Kod Genişlemesi Kullanılarak Nükleozom Rekonses için Histonların Siteye Özgü Lizin Asetilasyonu

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...