Name: generating homo- and heterografts between watermelon and bottle gourd for the study of cold-responsive micrornas
Uploaded: 2018-11-20T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generating Homo- and Heterografts Between Watermelon and Bottle Gourd for the Study of Cold-responsive MicroRNAs at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (31772191), forskningsprojekt for offentlighedens interesse i Zhejiang provinsen (2017C 32027), den nøglen videnskab projekt af planteavl i Zhejiang (2016C 02051) og det nationale Program for Understøttelse af Top-notch unge fagfolk (til P.X.).

1. seed sterilisation og spiring
<ol><li>For overflade sterilisation, sættetid flasken græskar frø i et 500 mL bægerglas fyldt med vand ved 58 ° C med lejlighedsvise omrøring, indtil vandets temperatur falder til 40 ° C.</li>
	<li>I mellemtiden, sætte 3 kg af tørv jord ind i en nylon pose og sterilisere, autoklave det ved 120 ° C/0.5 MPa i 20 min.</li>
	<li>Holde iblødsætning flasken græskar frø i 4-5 timer mere med ingen omrøring.<ol>
<li>Når vandet når stuetemperatur, skyl frøene 2 x - 3 x med desti...

<ol>
	<li>Schwarz, D., Rouphael, Y., Colla, G., Venema, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grafting+as+a+tool+to+improve+tolerance+of+vegetables+to+abiotic+stresses:+Thermal+stress,+water+stress+and+organic+pollutants.">Grafting as a tool to improve tolerance of vegetables to abiotic stresses: Thermal stress, water stress and organic pollutants.</a> Scientia Horticulturae. 127, 162-171 (2010).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+tolerance+differences+in+cucumber+seedlings+grafted+on+rootstocks+with+different+tolerance+to+low+temperature+and+weak+light+stresses.">Mechanisms of tolerance differences in cucumber seedlings grafted on rootstocks with different tolerance to low temperature and weak light stresses.</a> Turkish Journal of Botany. 39 (4), 606-614 (2015).</li><li>Li, C. H., Li, Y. S., Bai, L. Q., He, C. X., Yu, X. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Expression+of+miRNAs+and+Their+Targets+in+the+Response+to+Drought+Stress+of+Grafted+Cucumber+Seedlings.">Dynamic Expression of miRNAs and Their Targets in the Response to Drought Stress of Grafted Cucumber Seedlings.</a> Horticultural Plant Journal. 2 (1), 41-49 (2016).</li><li>Rouphael, Y., Cardarelli, M., Colla, G., Rea, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yield,+mineral+composition,+water+relations,+and+water+use+efficiency+of+grafted+mini-watermelon+plants+under+deficit+irrigation.">Yield, mineral composition, water relations, and water use efficiency of grafted mini-watermelon plants under deficit irrigation.</a> HortScience. 43 (3), 730-736 (2008).</li><li>Savvas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactive+effects+of+grafting+and+manganese+supply+on+growth,+yield,+and+nutrient+uptake+by+tomato.">Interactive effects of grafting and manganese supply on growth, yield, and nutrient uptake by tomato.</a> HortScience. 44 (7), 1978-1982 (2009).</li><li>Aloni, B., Cohen, R., Karni, L., Aktas, H., Edelstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+signaling+in+rootstock-scion+interactions.">Hormonal signaling in rootstock-scion interactions.</a> Scientia Horticulturae. 127, 119-126 (2010).</li><li>Rouphael, Y., Caradrelli, M., Rea, E., Colla, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+melon+and+cucumber+photosynthetic+activity,+mineral+composition,+and+growth+performance+under+salinity+stress+by+grafting+onto+Cucurbita+hybrid+rootstocks.">Improving melon and cucumber photosynthetic activity, mineral composition, and growth performance under salinity stress by grafting onto Cucurbita hybrid rootstocks.</a> Photosynthetica. 50 (2), 180-188 (2012).</li><li>Louws, F. J., Rivard, C. L., Kubota, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grafting+fruiting+vegetables+to+manage+soilborne+pathogens,+foliar+pathogens,+arthropods+and+weeds.">Grafting fruiting vegetables to manage soilborne pathogens, foliar pathogens, arthropods and weeds.</a> Scientia Horticulturae. 127 (2), 127-146 (2010).</li><li>Asins, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+rootstock-mediated+nitrogen+(N)+uptake+and+root-to-shoot+signalling+at+contrasting+N+availabilities+in+tomato.">Genetic analysis of rootstock-mediated nitrogen (N) uptake and root-to-shoot signalling at contrasting N availabilities in tomato.</a> Plant Science. 263, 94-106 (2017).</li><li>Yin, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+protective+enzymes+in+tomato+rootstocks+to+resist+root+knot+nematodes.">Role of protective enzymes in tomato rootstocks to resist root knot nematodes.</a> Acta Horticulturae. 1086 (1086), 213-218 (2015).</li><li>Gaion, L. A., Carvalho, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Distance+Signaling:+what+grafting+has+revealed?.">Long-Distance Signaling: what grafting has revealed?.</a> Journal of Plant Growth Regulation. 37 (2), 694-704 (2018).</li><li>Turnbull, C. G., Hennig, L., K&#246;hler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grafting+as+a+research+tool.">Grafting as a research tool.</a> Plant Developmental Biology. , 11-26 (2010).</li><li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grafting-responsive+miRNAs+in+cucumber+and+pumpkin+seedlings+identified+by+high-throughput+sequencing+at+whole+genome+level.">Grafting-responsive miRNAs in cucumber and pumpkin seedlings identified by high-throughput sequencing at whole genome level.</a> Physiologia Plantarum. 151 (4), 406-422 (2014).</li><li>Lakhotia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+miRNAome+in+root,+stem,+leaf+and+tuber+developmental+stages+of+potato+(Solanum+tuberosum+L.)+by+high-throughput+sequencing.">Identification and characterization of miRNAome in root, stem, leaf and tuber developmental stages of potato (Solanum tuberosum L.) by high-throughput sequencing.</a> BMC Plant Biology. 14 (1), 6 (2014).</li><li>Jones-Rhoades, M. W., Bartel, D. P., Bartel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+and+their+regulatory+roles+in+plants.">MicroRNAs and their regulatory roles in plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 57, 19-53 (2006).</li><li>Puzey, J. R., Kramer, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+conserved+Aquilegia+coerulea+microRNAs+and+their+targets.">Identification of conserved Aquilegia coerulea microRNAs and their targets.</a> Genetic. 448 (1), 46-56 (2009).</li><li>Matthewman, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR395+is+a+general+component+of+the+sulfate+assimilation+regulatory+network+in+Arabidopsis.">miR395 is a general component of the sulfate assimilation regulatory network in Arabidopsis.</a> FEBS Letters. 586 (19), 3242-3248 (2012).</li><li>Ali, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+of+RNA+silencing+signal+through+grafting+confers+virus+resistance+from+transgenically+silenced+tobacco+rootstocks+to+non-transgenic+tomato+and+tobacco+scions.">Transmission of RNA silencing signal through grafting confers virus resistance from transgenically silenced tobacco rootstocks to non-transgenic tomato and tobacco scions.</a> Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology. 25 (3), 245-252 (2016).</li><li>Li, Y. S., Li, C. H., Bai, L. Q., He, C. X., Yu, X. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+and+target+gene+responses+to+salt+stress+in+grafted+cucumber+seedlings.">MicroRNA and target gene responses to salt stress in grafted cucumber seedlings.</a> Acta Physiologiae Plantarum. 38 (2), 1-12 (2016).</li><li>Pagliarani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+accumulation+of+miRNAs+differentially+modulated+by+drought+stress+is+affected+by+grafting+in+grapevine.">The accumulation of miRNAs differentially modulated by drought stress is affected by grafting in grapevine.</a> Plant Physiology. 173 (4), 2180-2195 (2017).</li><li>Liu, N., Yang, J. H., Guo, S. G., Xu, Y., Zhang, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+and+comparative+analysis+of+conserved+and+novel+microRNAs+in+grafted+watermelon+by+high-throughput+sequencing.">Genome-wide identification and comparative analysis of conserved and novel microRNAs in grafted watermelon by high-throughput sequencing.</a> PLoS One. 8 (2), e57359 (2013).</li><li>Song, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+2JC-350+automatic+grafting+machine+with+cut+grafting+method+for+vegetable+seedling.">Development of 2JC-350 automatic grafting machine with cut grafting method for vegetable seedling.</a> Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering. 22 (12), 103-106 (2006).</li><li>Kumar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+leaf+rust+responsive+miRNAs+in+wheat+(triticum+aestivum+l.)+using+high-throughput+sequencing+and+prediction+of+their+targets+through+degradome+analysis.">Uncovering leaf rust responsive miRNAs in wheat (triticum aestivum l.) using high-throughput sequencing and prediction of their targets through degradome analysis.</a> Planta. 245 (1), 1-22 (2016).</li><li>Kohli, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+wilt+and+salt+stress-responsive+microRNAs+in+chickpea+through+high-throughput+sequencing.">Identification and characterization of wilt and salt stress-responsive microRNAs in chickpea through high-throughput sequencing.</a> PLoS One. 9 (10), e108851 (2014).</li><li>Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+challenges+in+next-generation+genomics.+International+Conference+on+Scientific+and+Statistical+Database+Management.">Computational challenges in next-generation genomics. International Conference on Scientific and Statistical Database Management.</a> ACM. 2, (2013).</li><li>Guo, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+draft+genome+of+watermelon+(Citrullus+lanatus)+and+resequencing+of+20+diverse+accessions.">The draft genome of watermelon (Citrullus lanatus) and resequencing of 20 diverse accessions.</a> Nature Genetics. 45, 51-58 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gourdbase:+a+genome-centered+multi-omics+database+for+the+bottle+gourd+(lagenaria+siceraria),+an+economically+important+cucurbit+crop.">Gourdbase: a genome-centered multi-omics database for the bottle gourd (lagenaria siceraria), an economically important cucurbit crop.</a> Scientific Reports. 8 (1), 306 (2018).</li><li>Wang, X. F., Liu, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Curation+of+miRBase+Annotation+Using+Integrated+Small+RNA+High-Throughput+Sequencing+Data+for+C.+elegans+and+Drosophila.">Systematic Curation of miRBase Annotation Using Integrated Small RNA High-Throughput Sequencing Data for C. elegans and Drosophila.</a> Frontiers in Genetics. 2, 25 (2011).</li><li>Bo, X. C., Wang, S. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TargetFinder:+a+software+for+antisense+oligonucleotide+target+site+selection+based+on+MAST+and+secondary+structures+of+target+mRNA.">TargetFinder: a software for antisense oligonucleotide target site selection based on MAST and secondary structures of target mRNA.</a> Bioinformatics. 21 (8), 1401-1402 (2005).</li><li>. GOATOOLS: Tools for Gene Ontology Available from: <a target="_blank" href="https://doi.org/10.5281/zenodo.31628">https://doi.org/10.5281/zenodo.31628</a> (2015)</li><li>Wang, L. P., Li, G. J., Wu, X. H., Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+proteomic+analyses+provide+novel+insights+into+the+effects+of+grafting+wound+and+hetero-grafting+per+se+on+bottle+gourd.">Comparative proteomic analyses provide novel insights into the effects of grafting wound and hetero-grafting per se on bottle gourd.</a> Scientia Horticulturae. 200 (8), 1-6 (2016).</li></ol>

I denne protokol beskrev vi i detaljer en yderst effektiv og reproducerbar metode til at gøre homo- og heterografts mellem vandmelon og flasken centnergræskar. Denne metode, der kræver ingen særlige udstyr, er meget nem at betjene og typisk har en meget høj overlevelsesraten for podning. Metoden kan også bruges til at gøre grafts for andre Cucurbitæ, såsom mellem vandmelon, agurk og græskar.
Det er værd at bemærke, at den relative størrelse (alder) rodstok og scion er afgørende f...

Podning har længe været ansat som en landbrugs teknik til at forbedre afgrødeproduktionen og tolerance over for biotisk og abiotisk understreger1,2,3. I heterografting systemer, kan elite grundstammer forbedre vand og næringsstoffer optagelsen af planter, styrke modstand mod jord patogener, og begrænse de negative virkninger af metal toksicitet4,5, som kan give podninger en forbedret vækst vigor og øget tolerance over for miljøbelastninger. I mange tilfælde, heterografting kan også have indflydelse på frugt kvaliteter i gartneri planter, fører til forbedret frugtsmag og øget indhold af sundheds-relaterede forbindelser6,7. Det er blevet konstateret, at langdistance overførsel af Phytohormoner, RNA'er, peptider og proteiner mellem Rodstokken og scion er en grundlæggende mekanisme modulerende vækst og udvikling omprogrammering af scion planter8,9 ,10. Podning har været meget anvendt i undersøgelser af langdistance signalering og transport i forbindelse med miljømæssig tilpasning11. Podning eksperimenter er navnlig kraftfulde til entydig påvisning af overførte molekyler i modtagelse af væv eller vaskulær sap, og aktivering eller undertrykkelse af molekylære mål på grund af signal transmission12.
Ikke-kodende RNA'er, en stor klasse af RNA, der udøver vigtige regulerende funktioner i celler, der er rapporteret til at spille en rolle i at lette plante tilpasning til abiotisk stress13. miRNAs er endogene lille ikke-kodende RNA'er på omkring 20-24 nt. undersøgelser har afsløret miRNAs i forskellige aspekter af anlægget aktiviteter regulerende rolle, sådan som skyde vækst, lateral rod dannelsen14,15,16, næringsstof optagelse, sulfat metabolisme og homøostase17og svar til biotiske og abiotiske stress18. For nylig, var udtryk for miRNAs og deres mål gener relateret til salt stresstolerance i heterografted agurk frøplanter19. I de intervariety grafts druemost fandtes svarene fra miRNA udtryk for tørkestress for at være genotype-afhængige20.
Den hurtige udvikling og mindske omkostningerne ved høj overførselshastighed sekventering teknologi har givet en stor mulighed for undersøgelse af miRNA forordninger i agronomiske planter. Vandmelon (Citrullus lanatus [Thunb.] Mansf.), en vigtig cucurbit afgrøde dyrkes på verdensplan, er modtagelige for lave temperaturer. Flasken græskar (Lagenaria siceraria [Molina] Standl.) er en mere klima-robust cucurbit, der almindeligvis anvendes af landmænd til at pode med vandmelon. Det primære mål for den aktuelle undersøgelse er at etablere en standard, effektiv, og bekvem metode til at gøre heterografts mellem vandmelon (Citrullus lanatus [Thunb.] Mansf.) og flasken græskar (Lagenaria siceraria [Molina] Standl). Denne protokol giver også en detaljeret eksperimentelle ordning og analytiske procedurer for undersøgelse af reguleringen af miRNA udtryk efter podning, hvilket er nyttigt for at afsløre de underliggende heterografting fordele mekanismer.
Vegetabilske materialer i denne undersøgelse omfatter vandmelon kultivar og flasken centnergræskar landrace. Vandmelon kultivar er en kommerciel sort med højt udbytte men modtagelige for lave temperaturer. Flaske centnergræskar landrace er en populær grundstammer til podning med vandmelon, agurk og flasken centnergræskar, på grund af sin fremragende tolerance over for lave temperaturer21.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA-free DNase I</td>
			<td>Takara</td>
			<td>D2270A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Truseq Small RNA sample prep Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-200-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Bionalyser</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UEA sRNA workbench 2.4-plant version&#160;(software)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>http://srna-workbench.cmp.uea.ac.uk/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rfam 11.0 database&#160;(website)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>http://rfam.janelia.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRBase 22.0&#160;(website)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>http://www.mirbase.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIREAP(software)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://sourceforge.net/projects/mireap/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TargetFinder&#160;(software)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>http://targetfinder.org/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating homo- and heterografts between watermelon and bottle gourd for the study of cold-responsive micrornas

MicroRNA (miRNAs) er endogene lille ikke-kodende RNA'er på omkring 20-24 nt, kendt for at spille en vigtig rolle i anlægget udvikling og tilpasning. Der er en akkumulerende beviser for, at udtrykkene for visse miRNAs, ændres når podning, en landbrugspraksis, der almindeligvis anvendes af landmænd til at forbedre afgrøde tolerance over for biotisk og abiotisk understreger. Flaske centnergræskar er en iboende klima-modstandsdygtige afgrøde i forhold til mange andre store Cucurbitæ, herunder vandmelon, gør det en af de mest udbredte grundstammer til sidstnævnte. De seneste fremskridt inden for høj overførselshastighed sekventering teknologier har givet store muligheder for at undersøge kolde-responderende miRNAs og deres bidrag til heterograft fordele; passende eksperimentelle procedurer er dog en forudsætning for dette formål. Vi præsenterer her, en detaljeret protokol for effektivt generere homo- og heterografts mellem den kolde-modtagelige vandmelon og kolde-tolerant flasken centnergræskar, ud over metoder til væv prøveudtagning, data generation og dataanalyse. De præsenterede metoder er også nyttige for andre plante-podning systemer, afhøre miRNA forordninger under forskellige miljøbelastninger, såsom varme, tørke og saltholdighed.

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58242/58242fig2.jpg"> Figur 2: fænotyper af forskellige grafts ved stuetemperatur og kolde-understregede betingelser. (en) dette panel viser homo- og heterografted planter ved stuetemperatur som kontrol. (b) dette panel viser homo- og heterografted planter efter 48 h af kuldebehandling. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58242/58242fig2large.jpg" target="_blank">Ve...

Watch this Scientific Journal Video about Generating Homo- and Heterografts Between Watermelon and Bottle Gourd for the Study of Cold-responsive MicroRNAs at JoVE.com

Generating Homo- and Heterografts Between Watermelon and Bottle Gourd for the Study of Cold-responsive MicroRNAs

Generering af Homo- og Heterografts mellem vandmelon og flasken centnergræskar for studiet af kolde-responderende MicroRNA

Her præsenterer vi en detaljeret protokol for effektivt at homo- og heterografts mellem vandmelon og flasken centnergræskar, ud over metoder til væv prøveudtagning, data generation og dataanalyse, for undersøgelse af kolde-responderende MicroRNA.

MicroRNAs (miRNAs) are endogenous small non-coding RNAs of about 20 - 24 nt, known to play important roles in plant development and adaptation. There is ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål i miRNA svar på evnen til at stress i plantetransplantater såsom hvordan miRNA er reguleret under kold stress i vandmelon flaske gourd grafts. Den største fordel ved denne teknik er, at det er meget effektiv og reproducerbar metode til at gøre homo og heterografter. Det kræver ingen specifikt udstyr, det er meget let at udføre, og typisk resulterer i en meget høj overlevelsesrate af podning.Gennem denne metode, kan give indsigt i miRNA reaktion på kold stress i vandmelon flaske gourd graft system. Det kan også anvendes på andre moderne organismer for at afsløre mekanismerne i lokale og lange afstande miRNA transport. Visuel demonstration af denne metode er afgørende, da podningstrinnene er svære at lære.Dette trin krævede avancerede færdigheder og er nøglen til overlevelsen af de podede planter. Til at begynde, sættetid flaske græskar frø i en 500 milliliter bægerglas på 58 grader Celsius vand. Rør frøene lejlighedsvis, indtil vandtemperaturen falder til 40 grader Celsius.Mens vandet køler, sætte tre kilo tørv jord i en nylon taske og autoklave det. Når vandet når stuetemperatur, skyl frøene to til tre gange i destilleret vand og dræne det overskydende vand. Lad frøene spire i en gazepose ved 28 grader Celsius i det mørke vækstkammer.Efter spiring, så frøene i plast potter fyldt med steriliseret tørv jord. Når flasken græskar planter udvikle to fladtrykt cotyledons, gentag denne proces med vandmelon frø. Dyrk flaskenurd og vandmelon planter i et vækstkammer.Tilsæt vand til planter en gang om dagen om eftermiddagen. Dernæst skæres hypokotyler af vandmelon planter to til tre centimeter under cotyledons. Skær toppen af flasken gourd planter på siden, umiddelbart over cotyledons.Brug derefter en tandstikker til at lave et hul i toppen af de trimmede flaskeurdplanter. Sæt de trimmede vandmelonplanter ned i hullet for at lave heterografter. Derefter forberedes homografter ved hjælp af den tidligere beskrevne metode.Først wrap de podede planter i gennemsigtige polyethylen poser for at opretholde en relativt høj luftfugtighed. Derefter opretholde de indpakkede planter i et vækstkammer i syv dage. Efter den syvende dag, fjerne poser og lad planterne til at vokse under de samme betingelser i syv til 10 dage.Opdel planterne i to grupper, en til kolde behandlinger og en til kontrol. Returnering af kontrolplanterne til de samme miljøforhold. Placer de kolde behandlede planter i et vækstkammer sat til seks grader Celsius med de samme lyse mørke forhold som kontrolgruppen.Efter 48 timer, lad prøverne af scion og grundstammer fra grafts. Prøverne fryses straks i flydende nitrogen, og de opbevares ved minus 70 grader Celsius. Den frosne prøve overføres til et mikrocentrifugerør med to milliliter i flydende nitrogen.Tilsæt en perle i rustfrit stål til hvert prøverør og homogenisere væv til et fint pulver. For hver podning kombination, tage lige store mængder af jorden prøve fra 10 planter og bland dem i en 10 milliliter centrifuge rør. Der tilsættes en passende mængde reagens af guanidiumhydrorium.Dernæst tilsættes RNA-fri DNase en til 150 enheder pr. milliliter ved 37 grader Celsius i en time. Derefter bestemmes den samlede RNA-mængde på et mikrokapillært elektroforesesystem. Derefter optøs biblioteksgenopergenterne og adapterne.Derefter ligate små RNase med de fem prime og tre prime adaptere, og elute og rense dem. Omvendt transskribere de fem prime og tre prime ligated lille RNase efter producentens retningslinjer. Udfør derefter PCR-forstærkning efter producentens protokol.Brug derefter mikrokaillær elektroforesesystem til at sikre, at RNA-integritetsnummeret er større end syv. Læg en mikroliter af et RNA-bibliotek på mikrokapillært elektroforesesystem for at sikre, at RNA-integritetsnummeret er større end syv. Endelig sekvens de små RNA biblioteker på en høj overførselshastighed sekventering instrument.Ved hjælp af denne protokol, en 98% overlevelsesrate for podning og fænotyper for stuetemperatur og kold stress betingelser blev opnået. sRNAs af 24 nukleotider udgør den største klasse af sRNAs i alle podning kombination, uanset temperaturbehandling. Efter 48 timers kold behandling var henholdsvis 30 og 268 mikroRNA'er op- og nedregulerede.I bladene af scion i heterografter, omvendt, i bladene af grundstammen, 31 og 12 microRNAs var op og ned-reguleret, henholdsvis. I vandmelon-vandmelon homografts, 64 og 83 microRNAs var op og ned-reguleret, henholdsvis. Dette viste, at heterografting forårsagede gennemgribende omprogrammering af mikroRNA-udtrykkene.Mens du forsøger denne procedure, er det vigtigt at huske den relative størrelse og alder af datter stilken og scion er afgørende for at gøre en vellykket graft. Efter denne procedure kan der udføres andre metoder som lncRNA-sekvensering, proteomisk profilering for at undersøge reguleringen af lncRNA og protein og kodningssystemet i podningssystemet. Efter sin udvikling, denne teknik banede vejen for forskning inden for planteabiotiske tolerance til at udforske mekanismen for plantepodning fordel i Cucurbitaceae og videre.Glem ikke, at arbejde med guanidin hydrochlorid kan være yderst farligt og passende forsigtighed bør altid tages med at udføre denne procedure.

Research

JoVE Journal

Environment

Transcript and Metabolite Profiling for the Evaluation of Tobacco Tree and Poplar as Feedstock for the Bio-based Industry

Transcript og Metabolit Profilering for Vurdering af tobak Tree og Poppel som råvare til Bio-industri

The global demand for food, feed, energy, and water poses extraordinary challenges for future generations. It is evident that robust platforms for the ...

The Use of High-resolution Infrared Thermography (HRIT) for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

The Use of High-resolution Infrared Thermography HRIT for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

Anvendelsen af ​​høj opløsning Infrarød termografi (HRIT) for Studiet af isnukleering og Ice Formering i Plants

Freezing events that occur when plants are actively growing can be a lethal event, particularly if the plant has no freezing tolerance. Such frost events ...

Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health

Empiriske, Metagenomic og beregningsmæssige teknikker belyse mekanismerne af som fungicider kompromis biers sundhed

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered ...

Protocol for Microplastics Sampling on the Sea Surface and Sample Analysis

Protokol for Microplastics Sampling på havoverfladen og Sample Analysis

Microplastic pollution in the marine environment is a scientific topic that has received increasing attention over the last decade. The majority of ...

Extraction of Organochlorine Pesticides from Plastic Pellets and Plastic Type Analysis

Ekstraktion af organiske chlorpesticider fra plastpellets og plasttypeanalyse

Plastic resin pellets, categorized as microplastics (&#8804;5 mm in diameter), are small granules that can be unintentionally released to the environment ...

Experimental Column Setup for Studying Anaerobic Biogeochemical Interactions Between Iron (Oxy)Hydroxides, Trace Elements, and Bacteria

Experimental Column Setup for Studying Anaerobic Biogeochemical Interactions Between Iron OxyHydroxides, Trace Elements, and Bacteria

Eksperimentelle kolonne Setup for at studere anaerob biogeokemiske interaktioner mellem jernhydroxider (Oxy), sporstoffer og bakterier

Fate and speciation of trace elements (TEs), such as arsenic (As) and mercury (Hg), in aquifers are closely related to physio-chemical conditions, such as ...

Ecosystem Fabrication (EcoFAB) Protocols for The Construction of Laboratory Ecosystems Designed to Study Plant-microbe Interactions

Ecosystem Fabrication EcoFAB Protocols for The Construction of Laboratory Ecosystems Designed to Study Plant-microbe Interactions

Økosystem fabrikation (EcoFAB) protokoller for byggeri Laboratory økosystemers designet til at studere plante-mikrobe interaktioner

Beneficial plant-microbe interactions offer a sustainable biological solution with the potential to boost low-input food and bioenergy production. A ...

Experimental Study of the Relationship Between Particle Size and Methane Sorption Capacity in Shale

Eksperimentel undersøgelse af forholdet mellem partikelstørrelse og metan Sorption kapacitet i skifer

The amount of adsorbed shale gas is a key parameter used in shale gas resource evaluation and target area selection, and it is also an important standard ...

Harvesting Venom Toxins from Assassin Bugs and Other Heteropteran Insects

Høst Venom toksiner fra Assassin Bugs og andre Heteropteran insekter

Heteropteran insects such as assassin bugs (Reduviidae) and giant water bugs (Belostomatidae) descended from a common predaceous and venomous ancestor, ...

Choice and No-Choice Bioassays to Study the Pupation Preference and Emergence Success of Ectropis grisescens

Choice and No-Choice Bioassays to Study the Pupation Preference and Emergence Success of Ectropis grisescens

Valg og nej-valg Bioassays at studere Pupation præference og fremkomsten succes af Ectropis grisescens

Many insects live above the ground as larvae and adults and as pupate below the ground. Compared to the above-ground stages of their life cycles, less ...