Name: generating homo- and heterografts between watermelon and bottle gourd for the study of cold-responsive micrornas
Uploaded: 2018-11-20T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generating Homo- and Heterografts Between Watermelon and Bottle Gourd for the Study of Cold-responsive MicroRNAs at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door de nationale Natural Science Foundation van China (31772191), het onderzoeksproject voor algemeen belang in de provincie Zhejiang (2017C 32027), de sleutel Science Project van de plantenveredeling in Zhejiang (2016C 02051) en het nationale programma voor de steun van Top-notch jonge Professionals (P.X.).

1. Zaaimaterialen sterilisatie en de kiemkracht
<ol><li>Voor de sterilisatie van het oppervlak, geniet de fles pompoen zaden in een 500 mL-bekerglas gevuld met water op 58 ° C met af en toe roeren, totdat de temperatuur van het water tot 40 ° C. daalt</li>
	<li>Ondertussen, plaatsen van 3 kg van veengrond in een nylon zak en steriliseren, autoclaaf op 120 ° C/0.5 MPa gedurende 20 minuten.</li>
	<li>Houd de fles pompoen zaden voor 4-5 h meer met geen roeren inweken.<ol>
<li>Zodra het water kamertemperatuur bereikt, s...

<ol>
	<li>Schwarz, D., Rouphael, Y., Colla, G., Venema, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grafting+as+a+tool+to+improve+tolerance+of+vegetables+to+abiotic+stresses:+Thermal+stress,+water+stress+and+organic+pollutants.">Grafting as a tool to improve tolerance of vegetables to abiotic stresses: Thermal stress, water stress and organic pollutants.</a> Scientia Horticulturae. 127, 162-171 (2010).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+tolerance+differences+in+cucumber+seedlings+grafted+on+rootstocks+with+different+tolerance+to+low+temperature+and+weak+light+stresses.">Mechanisms of tolerance differences in cucumber seedlings grafted on rootstocks with different tolerance to low temperature and weak light stresses.</a> Turkish Journal of Botany. 39 (4), 606-614 (2015).</li><li>Li, C. H., Li, Y. S., Bai, L. Q., He, C. X., Yu, X. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Expression+of+miRNAs+and+Their+Targets+in+the+Response+to+Drought+Stress+of+Grafted+Cucumber+Seedlings.">Dynamic Expression of miRNAs and Their Targets in the Response to Drought Stress of Grafted Cucumber Seedlings.</a> Horticultural Plant Journal. 2 (1), 41-49 (2016).</li><li>Rouphael, Y., Cardarelli, M., Colla, G., Rea, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yield,+mineral+composition,+water+relations,+and+water+use+efficiency+of+grafted+mini-watermelon+plants+under+deficit+irrigation.">Yield, mineral composition, water relations, and water use efficiency of grafted mini-watermelon plants under deficit irrigation.</a> HortScience. 43 (3), 730-736 (2008).</li><li>Savvas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactive+effects+of+grafting+and+manganese+supply+on+growth,+yield,+and+nutrient+uptake+by+tomato.">Interactive effects of grafting and manganese supply on growth, yield, and nutrient uptake by tomato.</a> HortScience. 44 (7), 1978-1982 (2009).</li><li>Aloni, B., Cohen, R., Karni, L., Aktas, H., Edelstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+signaling+in+rootstock-scion+interactions.">Hormonal signaling in rootstock-scion interactions.</a> Scientia Horticulturae. 127, 119-126 (2010).</li><li>Rouphael, Y., Caradrelli, M., Rea, E., Colla, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+melon+and+cucumber+photosynthetic+activity,+mineral+composition,+and+growth+performance+under+salinity+stress+by+grafting+onto+Cucurbita+hybrid+rootstocks.">Improving melon and cucumber photosynthetic activity, mineral composition, and growth performance under salinity stress by grafting onto Cucurbita hybrid rootstocks.</a> Photosynthetica. 50 (2), 180-188 (2012).</li><li>Louws, F. J., Rivard, C. L., Kubota, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grafting+fruiting+vegetables+to+manage+soilborne+pathogens,+foliar+pathogens,+arthropods+and+weeds.">Grafting fruiting vegetables to manage soilborne pathogens, foliar pathogens, arthropods and weeds.</a> Scientia Horticulturae. 127 (2), 127-146 (2010).</li><li>Asins, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+rootstock-mediated+nitrogen+(N)+uptake+and+root-to-shoot+signalling+at+contrasting+N+availabilities+in+tomato.">Genetic analysis of rootstock-mediated nitrogen (N) uptake and root-to-shoot signalling at contrasting N availabilities in tomato.</a> Plant Science. 263, 94-106 (2017).</li><li>Yin, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+protective+enzymes+in+tomato+rootstocks+to+resist+root+knot+nematodes.">Role of protective enzymes in tomato rootstocks to resist root knot nematodes.</a> Acta Horticulturae. 1086 (1086), 213-218 (2015).</li><li>Gaion, L. A., Carvalho, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Distance+Signaling:+what+grafting+has+revealed?.">Long-Distance Signaling: what grafting has revealed?.</a> Journal of Plant Growth Regulation. 37 (2), 694-704 (2018).</li><li>Turnbull, C. G., Hennig, L., K&#246;hler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grafting+as+a+research+tool.">Grafting as a research tool.</a> Plant Developmental Biology. , 11-26 (2010).</li><li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grafting-responsive+miRNAs+in+cucumber+and+pumpkin+seedlings+identified+by+high-throughput+sequencing+at+whole+genome+level.">Grafting-responsive miRNAs in cucumber and pumpkin seedlings identified by high-throughput sequencing at whole genome level.</a> Physiologia Plantarum. 151 (4), 406-422 (2014).</li><li>Lakhotia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+miRNAome+in+root,+stem,+leaf+and+tuber+developmental+stages+of+potato+(Solanum+tuberosum+L.)+by+high-throughput+sequencing.">Identification and characterization of miRNAome in root, stem, leaf and tuber developmental stages of potato (Solanum tuberosum L.) by high-throughput sequencing.</a> BMC Plant Biology. 14 (1), 6 (2014).</li><li>Jones-Rhoades, M. W., Bartel, D. P., Bartel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+and+their+regulatory+roles+in+plants.">MicroRNAs and their regulatory roles in plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 57, 19-53 (2006).</li><li>Puzey, J. R., Kramer, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+conserved+Aquilegia+coerulea+microRNAs+and+their+targets.">Identification of conserved Aquilegia coerulea microRNAs and their targets.</a> Genetic. 448 (1), 46-56 (2009).</li><li>Matthewman, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR395+is+a+general+component+of+the+sulfate+assimilation+regulatory+network+in+Arabidopsis.">miR395 is a general component of the sulfate assimilation regulatory network in Arabidopsis.</a> FEBS Letters. 586 (19), 3242-3248 (2012).</li><li>Ali, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+of+RNA+silencing+signal+through+grafting+confers+virus+resistance+from+transgenically+silenced+tobacco+rootstocks+to+non-transgenic+tomato+and+tobacco+scions.">Transmission of RNA silencing signal through grafting confers virus resistance from transgenically silenced tobacco rootstocks to non-transgenic tomato and tobacco scions.</a> Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology. 25 (3), 245-252 (2016).</li><li>Li, Y. S., Li, C. H., Bai, L. Q., He, C. X., Yu, X. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+and+target+gene+responses+to+salt+stress+in+grafted+cucumber+seedlings.">MicroRNA and target gene responses to salt stress in grafted cucumber seedlings.</a> Acta Physiologiae Plantarum. 38 (2), 1-12 (2016).</li><li>Pagliarani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+accumulation+of+miRNAs+differentially+modulated+by+drought+stress+is+affected+by+grafting+in+grapevine.">The accumulation of miRNAs differentially modulated by drought stress is affected by grafting in grapevine.</a> Plant Physiology. 173 (4), 2180-2195 (2017).</li><li>Liu, N., Yang, J. H., Guo, S. G., Xu, Y., Zhang, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+and+comparative+analysis+of+conserved+and+novel+microRNAs+in+grafted+watermelon+by+high-throughput+sequencing.">Genome-wide identification and comparative analysis of conserved and novel microRNAs in grafted watermelon by high-throughput sequencing.</a> PLoS One. 8 (2), e57359 (2013).</li><li>Song, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+2JC-350+automatic+grafting+machine+with+cut+grafting+method+for+vegetable+seedling.">Development of 2JC-350 automatic grafting machine with cut grafting method for vegetable seedling.</a> Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering. 22 (12), 103-106 (2006).</li><li>Kumar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+leaf+rust+responsive+miRNAs+in+wheat+(triticum+aestivum+l.)+using+high-throughput+sequencing+and+prediction+of+their+targets+through+degradome+analysis.">Uncovering leaf rust responsive miRNAs in wheat (triticum aestivum l.) using high-throughput sequencing and prediction of their targets through degradome analysis.</a> Planta. 245 (1), 1-22 (2016).</li><li>Kohli, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+wilt+and+salt+stress-responsive+microRNAs+in+chickpea+through+high-throughput+sequencing.">Identification and characterization of wilt and salt stress-responsive microRNAs in chickpea through high-throughput sequencing.</a> PLoS One. 9 (10), e108851 (2014).</li><li>Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+challenges+in+next-generation+genomics.+International+Conference+on+Scientific+and+Statistical+Database+Management.">Computational challenges in next-generation genomics. International Conference on Scientific and Statistical Database Management.</a> ACM. 2, (2013).</li><li>Guo, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+draft+genome+of+watermelon+(Citrullus+lanatus)+and+resequencing+of+20+diverse+accessions.">The draft genome of watermelon (Citrullus lanatus) and resequencing of 20 diverse accessions.</a> Nature Genetics. 45, 51-58 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gourdbase:+a+genome-centered+multi-omics+database+for+the+bottle+gourd+(lagenaria+siceraria),+an+economically+important+cucurbit+crop.">Gourdbase: a genome-centered multi-omics database for the bottle gourd (lagenaria siceraria), an economically important cucurbit crop.</a> Scientific Reports. 8 (1), 306 (2018).</li><li>Wang, X. F., Liu, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Curation+of+miRBase+Annotation+Using+Integrated+Small+RNA+High-Throughput+Sequencing+Data+for+C.+elegans+and+Drosophila.">Systematic Curation of miRBase Annotation Using Integrated Small RNA High-Throughput Sequencing Data for C. elegans and Drosophila.</a> Frontiers in Genetics. 2, 25 (2011).</li><li>Bo, X. C., Wang, S. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TargetFinder:+a+software+for+antisense+oligonucleotide+target+site+selection+based+on+MAST+and+secondary+structures+of+target+mRNA.">TargetFinder: a software for antisense oligonucleotide target site selection based on MAST and secondary structures of target mRNA.</a> Bioinformatics. 21 (8), 1401-1402 (2005).</li><li>. GOATOOLS: Tools for Gene Ontology Available from: <a target="_blank" href="https://doi.org/10.5281/zenodo.31628">https://doi.org/10.5281/zenodo.31628</a> (2015)</li><li>Wang, L. P., Li, G. J., Wu, X. H., Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+proteomic+analyses+provide+novel+insights+into+the+effects+of+grafting+wound+and+hetero-grafting+per+se+on+bottle+gourd.">Comparative proteomic analyses provide novel insights into the effects of grafting wound and hetero-grafting per se on bottle gourd.</a> Scientia Horticulturae. 200 (8), 1-6 (2016).</li></ol>

In dit protocol beschreven we in detail een zeer efficiënte en reproduceerbare methode om homo- en heterografts tussen watermeloen en fles kalebas te maken. Deze methode, waarvoor geen specifieke apparatuur, is zeer eenvoudig te bedienen en heeft doorgaans een zeer hoge overlevingskansen enten. De methode kan ook worden gebruikt om de protheses voor andere Cucurbitaceae met niet, zoals tussen watermeloen, komkommer en pompoen.
Het is vermeldenswaard dat de relatieve grootte (leeftijd) van de ...

Enten is lang werkzaam als een agrarische techniek om plantaardige productie en tolerantie aan biotische en abiotische stress1,2,3te verbeteren. In heterografting systemen, kunnen elite wijnstokdelen onder de grond betere opname van water en voedingsstoffen voor planten, versterken van weerstand tegen ziekteverwekkers van de bodem en beperken van de negatieve effecten van metalen toxiciteit4,5, waarin de protheses een verbeterde kan verlenen kracht van de groei en verhoogde tolerantie voor het milieu benadrukt. In veel gevallen, heterografting kan ook gevolgen hebben vrucht kwaliteiten in tuinbouw planten, wat leidt tot verbeterde fruit smaak en meer inhoud van gezondheidsgerelateerde verbindingen6,7. Het is gebleken dat de interlokale overdracht van fytohormonen, RNAs peptides en proteïnen tussen de onderstam en de scion is een fundamenteel mechanisme moduleren van de groei en ontwikkeling herprogrammering van scion planten8,9 ,10. Enten wijd gebruikt in studies van interlokale signalering en vervoer in verband met milieu aanpassing11. Praktijk experimenten zijn vooral krachtig voor ondubbelzinnige detectie van overdraagbare moleculen in het ontvangen van weefsel of vasculaire sap, en activering of onderdrukking van moleculaire targets te wijten aan de signaal overdracht12.
Non-codering RNAs, een grote klasse van RNA die uitoefenen van belangrijke regelgevende functies in cellen, zijn bij het spelen een rol bij het vergemakkelijken van de aanpassing van de plant aan de abiotische stress13gemeld. miRNAs zijn endogene klein niet-coderende RNAs van ongeveer 20-24 nt. Studies is gebleken dat de regelgevende rol van miRNAs in verschillende aspecten van de activiteiten van de plant, zulke zoals groei, schieten lateraal wortel vorming14,15,16, opname van voedingsstoffen, sulfaat metabolisme en homeostase17en reacties op biotische en abiotische stress18. Onlangs, is de uitdrukking van miRNAs en hun doelgenen hielden verband met zout stress tolerantie in heterografted komkommer zaailingen19. In de intervariety transplantaties van druivenmost, de reacties van miRNA expressie aan droogte stress bleken genotype-afhankelijke20.
De snelle ontwikkeling en het verminderen van de kosten van high-throughput sequencing technologie hebben een grote kans voor de studie van miRNA verordeningen in landbouwkundige planten verstrekt. Watermeloen (Citrullus lanatus [Thunb.] Mansf.), een belangrijk cucurbit gewas geteeld over de hele wereld, is gevoelig voor lage temperaturen. Fles kalebas (Lagenaria siceraria [Molina] Standl.) is een klimaat-veerkrachtiger cucurbit vaak door boeren gebruikt om te enten met watermeloen. Het primaire doel van de huidige studie is om een standaard, efficiënt, en handige methode voor het maken van heterografts tussen watermeloen (Citrullus lanatus [Thunb.] Mansf.) en fles kalebas (Lagenaria siceraria [Molina] Standl). Dit protocol biedt ook een gedetailleerde regeling van experimentele en analytische procedures voor de studie van het Reglement van miRNA expressies na enten, die is handig voor het openbaren van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de voordelen van de heterografting.
De materialen van de plant gebruikt in deze studie omvatten de cultivar watermeloen en de fles kalebas landras. Watermeloen cultivar is een commerciële cultivar met hoge opbrengst maar gevoelig voor lage temperaturen. Fles kalebas landras is een populaire onderstam voor enten met watermeloen, komkommer en fles kalebas, vanwege zijn uitstekende tolerantie van lage temperaturen21.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA-free DNase I</td>
			<td>Takara</td>
			<td>D2270A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Truseq Small RNA sample prep Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-200-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Bionalyser</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UEA sRNA workbench 2.4-plant version&#160;(software)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>http://srna-workbench.cmp.uea.ac.uk/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rfam 11.0 database&#160;(website)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>http://rfam.janelia.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRBase 22.0&#160;(website)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>http://www.mirbase.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIREAP(software)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://sourceforge.net/projects/mireap/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TargetFinder&#160;(software)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>http://targetfinder.org/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating homo- and heterografts between watermelon and bottle gourd for the study of cold-responsive micrornas

MicroRNAs (miRNAs) zijn endogene klein niet-coderende RNAs van ongeveer 20-24 nt, bekend om te spelen een belangrijke rol in de ontwikkeling van planten en aanpassing. Er is een accumulatie bewijsmateriaal waaruit blijkt dat de uitingen van bepaalde miRNAs worden gewijzigd wanneer enten, een vaak gebruikt door landbouwers voor het verbeteren van gewas tolerantie voor biotische en abiotische stress landbouwpraktijken. Fles kalebas is een inherent klimaat-veerkrachtig gewas in vergelijking met vele andere belangrijke Cucurbitaceae met niet, met inbegrip van watermeloen, waardoor het een van de meest gebruikte onderstammen voor het laatste. De recente vooruitgang van high-throughput sequencing technologieën heeft grote kansen te onderzoeken van koude-responsieve miRNAs en hun bijdragen aan heterograft voordelen; Toch zijn voldoende experimentele procedures een voorwaarde voor dit doel. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor het efficiënt genereren van homo- en heterografts tussen de koud-gevoelige watermeloen en de koude-tolerante fles kalebas, naast weefsel bemonsteringswijzen, gegevens generatie, en data-analyse. De gepresenteerde methoden zijn ook handig voor andere systemen met plant-enten, te ondervragen miRNA verordeningen onder verschillende milieu benadrukt, zoals warmte, droogte en zoutgehalte.

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58242/58242fig2.jpg"> Figuur 2: fenotypes van verschillende enten bij kamertemperatuur en koude-benadrukte voorwaarden. (een) dit paneel toont homo- en heterografted zaailingen op kamertemperatuur als het besturingselement. (b) dit paneel toont homo- en heterografted zaailingen na 48u van koude behandeling. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58242/58242fig2large.jpg...

Watch this Scientific Journal Video about Generating Homo- and Heterografts Between Watermelon and Bottle Gourd for the Study of Cold-responsive MicroRNAs at JoVE.com

Generating Homo- and Heterografts Between Watermelon and Bottle Gourd for the Study of Cold-responsive MicroRNAs

Genereren van Homo- en Heterografts tussen watermeloen en fles pompoen voor de studie van koude-responsieve MicroRNAs

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor het efficiënt maken van homo- en heterografts tussen watermeloen en fles kalebas, naast de methoden van bemonstering van weefsel, generatie van de gegevens en data-analyse, voor het onderzoek van koude-responsieve microRNAs.

MicroRNAs (miRNAs) are endogenous small non-coding RNAs of about 20 - 24 nt, known to play important roles in plant development and adaptation. There is ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in miRNA reactie op het vermogen om te stressen in plantentransplantaten, zoals hoe miRNA worden gereguleerd onder koude stress in watermeloen fles kalebasts. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het zeer efficiënte en reproduceerbare methode is om homo en heterografts te maken. Het vereist geen specifieke apparatuur, het is zeer eenvoudig uit te voeren, en meestal resulteert in een zeer hoge overlevingskans van enten.Via deze methode, kan inzicht geven in miRNA reactie op koude stress in de watermeloen fles kalebas graft systeem. Het kan ook worden toegepast op andere moderne organismen voor het onthullen van de mechanismen van lokale en lange afstand miRNA transport. Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang als de enting stappen zijn moeilijk te leren.Deze stap vereist geavanceerde vaardigheden en zijn de sleutel tot het voortbestaan van de geënte planten. Om te beginnen, weken fles kalebas zaden in een 500 milliliter bekerglas van 58 graden Celsius water. Roer de zaden af en toe tot de temperatuur van het water daalt tot 40 graden Celsius.Terwijl het water afkoelt, doe drie kilo veengrond in een nylon zak en autoclave het. Zodra het water op kamertemperatuur is, spoel de zaden twee tot drie keer in gedestilleerd water en giet het overtollige water af. Laat de zaden ontkiemen in een gaaszak bij 28 graden Celsius in de donkere groeikamer.Na ontkieming, zaai de zaden in plastic potten gevuld met de gesteriliseerde veengrond. Wanneer de fles kalebas zaailingen ontwikkelen twee afgeplatte cotyledons, herhaal dit proces met watermeloen zaden. Kweek de fles kalebas en watermeloen zaailingen in een groeikamer.Voeg 's middags één keer per dag water toe aan de zaailingen. Snijd vervolgens de hypocotyls van de watermeloenzaailingen twee tot drie centimeter onder de cotyledons. Snijd de bovenkant van de fles kalebas zaailingen aan de zijkant, direct boven de cotyledons.Gebruik dan een tandenstoker om een gat te maken in de bovenkant van de bijgesneden fles kalebas zaailingen. Steek de bijgesneden watermeloen zaailingen in het gat om heterografts te maken. Bereid hierna homografts voor met de eerder beschreven methode.Wikkel eerst de geënte zaailingen in transparante polyethyleenzakken om een relatief hoge luchtvochtigheid te behouden. Houd vervolgens de verpakte zaailingen zeven dagen in een groeikamer. Na de zevende dag, verwijder de zakken en laat de planten om te groeien onder dezelfde omstandigheden voor zeven tot 10 dagen.Verdeel de zaailingen in twee groepen, een voor koude behandelingen en een voor controle. Breng de controlezaaiers terug naar dezelfde omgevingsomstandigheden. Plaats de koud behandelde zaailingen in een groeikamer ingesteld op zes graden Celsius met dezelfde lichte donkere omstandigheden als de controlegroep.Laat na 48 uur de monsters van de telg en onderstammen van de grafts. Vries de monsters onmiddellijk in vloeibare stikstof en bewaar ze op min 70 graden Celsius. Breng het bevroren monster over op een twee milliliter microcentrifugebuis in vloeibare stikstof.Voeg een roestvrijstalen kraal toe aan elke monsterbuis en homogeniseer de weefsels tot een fijn poeder. Voor elke enting combinatie, neem gelijke hoeveelheden grondmonster van 10 zaailingen en meng ze in een 10 milliliter centrifuge buis. Voeg een passende hoeveelheid guanidiumhydrochloride reagens toe.Voeg vervolgens RNA-vrije DNase een tot 150 eenheden per milliliter bij 37 graden Celsius voor een uur. Bepaal vervolgens de totale RNA-hoeveelheid op een microcapillaire elektroforesesysteem. Ontdooi hierna de normalisatiereagentia en adapters van de bibliotheek.Dan ligate kleine RNase met de vijf prime en drie prime adapters, en elute en zuiveren. Reverse transcriberen de vijf prime en drie prime ligated kleine RNase volgens de richtlijnen van de fabrikant. Voer vervolgens PCR-versterking uit volgens het protocol van de fabrikant.Gebruik vervolgens het microcaillaire elektroforesesysteem om ervoor te zorgen dat het RNA-integriteitsnummer groter is dan zeven. Laad een microliter van een RNA-bibliotheek op het microcapillaire elektroforesesysteem om ervoor te zorgen dat het RNA-integriteitsnummer groter is dan zeven. Tot slot, sequentie de kleine RNA bibliotheken op een hoge doorvoer sequencing instrument.Met behulp van dit protocol werd een overlevingskans van 98% voor enten en de fenotypes voor kamertemperatuur en koude stress voorwaarden verkregen. sRNAs van 24 nucleotiden vormen de grootste klasse van sRNAs in alle entencombinatie, ongeacht de temperatuurbehandeling. Na 48 uur koude behandeling werden respectievelijk 30 en 268 microRNAs op en neer gereglementeerd.In de bladeren van de telg in heterografts, omgekeerd, in de bladeren van de onderstam, waren respectievelijk 31 en 12 microRNAs op en neer gereglementeerd. In de watermeloen-watermeloen homografts, 64 en 83 microRNAs werden op en neer geregeld, respectievelijk. Dit toonde aan dat heterografting diepgaande herprogrammering van de microRNA uitdrukkingen veroorzaakte.Tijdens een poging tot deze procedure, is het belangrijk om de relatieve grootte en leeftijd van de dochter stengel herinneren en de telg is van cruciaal belang voor het maken van een succesvolle graft. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals lncRNA-sequencing, proteomische profilering worden uitgevoerd om de regulatie van lncRNA en eiwit en het coderingssysteem in het entingssysteem te onderzoeken. Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoek op het gebied van plantaardige abiotische tolerantie om het mechanisme van het voordeel van plantent enten in Cucurbitaceae en daarbuiten te onderzoeken.Vergeet niet dat het werken met guanidinehydrochloride zeer gevaarlijk kan zijn en dat er altijd passende voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen bij het uitvoeren van deze procedure.

Research

JoVE Journal

Environment

Transcript and Metabolite Profiling for the Evaluation of Tobacco Tree and Poplar as Feedstock for the Bio-based Industry

Transcript en Metabolite Profiling voor de Evaluatie van de Boom en Poplar Tabak als grondstof voor de bio-gebaseerde industrie

The global demand for food, feed, energy, and water poses extraordinary challenges for future generations. It is evident that robust platforms for the ...

The Use of High-resolution Infrared Thermography (HRIT) for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

The Use of High-resolution Infrared Thermography HRIT for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

Het gebruik van een hoge resolutie infrarood thermografie (HRIT) voor de studie van Ice Nucleatie en Ice Voortplanting in Planten

Freezing events that occur when plants are actively growing can be a lethal event, particularly if the plant has no freezing tolerance. Such frost events ...

Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health

Empirische, Metagenomic en computationele technieken verlichten de mechanismen door welke fungiciden compromis Bee gezondheid

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered ...

Protocol for Microplastics Sampling on the Sea Surface and Sample Analysis

Protocol voor microplastics bemonstering op het zeeoppervlak en Sample Analysis

Microplastic pollution in the marine environment is a scientific topic that has received increasing attention over the last decade. The majority of ...

Extraction of Organochlorine Pesticides from Plastic Pellets and Plastic Type Analysis

Extractie van organische chloride pesticiden uit plastic pellets en plastic type analyse

Plastic resin pellets, categorized as microplastics (&#8804;5 mm in diameter), are small granules that can be unintentionally released to the environment ...

Experimental Column Setup for Studying Anaerobic Biogeochemical Interactions Between Iron (Oxy)Hydroxides, Trace Elements, and Bacteria

Experimental Column Setup for Studying Anaerobic Biogeochemical Interactions Between Iron OxyHydroxides, Trace Elements, and Bacteria

Experimentele kolominstelling voor het bestuderen van anaërobe biogeochemische interacties tussen ijzer (Oxy) hydroxiden, sporenelementen en bacteriën

Fate and speciation of trace elements (TEs), such as arsenic (As) and mercury (Hg), in aquifers are closely related to physio-chemical conditions, such as ...

Ecosystem Fabrication (EcoFAB) Protocols for The Construction of Laboratory Ecosystems Designed to Study Plant-microbe Interactions

Ecosystem Fabrication EcoFAB Protocols for The Construction of Laboratory Ecosystems Designed to Study Plant-microbe Interactions

Ecosysteem fabricage (EcoFAB) protocollen voor de bouw van laboratorium ecosystemen ontworpen om te bestuderen van de Plant-microbe interacties

Beneficial plant-microbe interactions offer a sustainable biological solution with the potential to boost low-input food and bioenergy production. A ...

Experimental Study of the Relationship Between Particle Size and Methane Sorption Capacity in Shale

Experimentele studie van de relatie tussen deeltjesgrootte en methaan Sorption capaciteit in leisteen

The amount of adsorbed shale gas is a key parameter used in shale gas resource evaluation and target area selection, and it is also an important standard ...

Harvesting Venom Toxins from Assassin Bugs and Other Heteropteran Insects

Oogsten van Venom toxines uit Assassin insecten en andere Heteropteran insecten

Heteropteran insects such as assassin bugs (Reduviidae) and giant water bugs (Belostomatidae) descended from a common predaceous and venomous ancestor, ...

Choice and No-Choice Bioassays to Study the Pupation Preference and Emergence Success of Ectropis grisescens

Choice and No-Choice Bioassays to Study the Pupation Preference and Emergence Success of Ectropis grisescens

Keuze en nee-keuze Bioassays te bestuderen de verpopt voorkeur en het succes van de opkomst van Ectropis grisescens

Many insects live above the ground as larvae and adults and as pupate below the ground. Compared to the above-ground stages of their life cycles, less ...