Name: generating homo- and heterografts between watermelon and bottle gourd for the study of cold-responsive micrornas
Uploaded: 2018-11-20T12:30:00
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Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (31772191), el proyecto de investigación de interés público en la provincia de Zhejiang (2017C 32027), la llave de la ciencia proyecto de fitomejoramiento en Zhejiang (2016C 02051) y el programa nacional de el apoyo de primera categoría jóvenes profesionales (PX).

1. esterilización y germinación de la semilla
<ol><li>Para la esterilización superficial, remojar las semillas de la calabaza de botella en un vaso de precipitados de 500 mL llenado de agua a 58 ° C con agitación ocasional, hasta que la temperatura del agua a 40 ° C.</li>
	<li>Mientras tanto, poner 3 kg de suelo de turba en una bolsa de nylon y, al esterilizar, autoclave a 120 ° C/0.5 MPa durante 20 minutos.</li>
	<li>Mantener a remojo las semillas de la calabaza de botella para 4-5 h más de no agitar.<ol>
<li>...

<ol>
	<li>Schwarz, D., Rouphael, Y., Colla, G., Venema, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grafting+as+a+tool+to+improve+tolerance+of+vegetables+to+abiotic+stresses:+Thermal+stress,+water+stress+and+organic+pollutants.">Grafting as a tool to improve tolerance of vegetables to abiotic stresses: Thermal stress, water stress and organic pollutants.</a> Scientia Horticulturae. 127, 162-171 (2010).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+tolerance+differences+in+cucumber+seedlings+grafted+on+rootstocks+with+different+tolerance+to+low+temperature+and+weak+light+stresses.">Mechanisms of tolerance differences in cucumber seedlings grafted on rootstocks with different tolerance to low temperature and weak light stresses.</a> Turkish Journal of Botany. 39 (4), 606-614 (2015).</li><li>Li, C. H., Li, Y. S., Bai, L. Q., He, C. X., Yu, X. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Expression+of+miRNAs+and+Their+Targets+in+the+Response+to+Drought+Stress+of+Grafted+Cucumber+Seedlings.">Dynamic Expression of miRNAs and Their Targets in the Response to Drought Stress of Grafted Cucumber Seedlings.</a> Horticultural Plant Journal. 2 (1), 41-49 (2016).</li><li>Rouphael, Y., Cardarelli, M., Colla, G., Rea, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yield,+mineral+composition,+water+relations,+and+water+use+efficiency+of+grafted+mini-watermelon+plants+under+deficit+irrigation.">Yield, mineral composition, water relations, and water use efficiency of grafted mini-watermelon plants under deficit irrigation.</a> HortScience. 43 (3), 730-736 (2008).</li><li>Savvas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactive+effects+of+grafting+and+manganese+supply+on+growth,+yield,+and+nutrient+uptake+by+tomato.">Interactive effects of grafting and manganese supply on growth, yield, and nutrient uptake by tomato.</a> HortScience. 44 (7), 1978-1982 (2009).</li><li>Aloni, B., Cohen, R., Karni, L., Aktas, H., Edelstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+signaling+in+rootstock-scion+interactions.">Hormonal signaling in rootstock-scion interactions.</a> Scientia Horticulturae. 127, 119-126 (2010).</li><li>Rouphael, Y., Caradrelli, M., Rea, E., Colla, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+melon+and+cucumber+photosynthetic+activity,+mineral+composition,+and+growth+performance+under+salinity+stress+by+grafting+onto+Cucurbita+hybrid+rootstocks.">Improving melon and cucumber photosynthetic activity, mineral composition, and growth performance under salinity stress by grafting onto Cucurbita hybrid rootstocks.</a> Photosynthetica. 50 (2), 180-188 (2012).</li><li>Louws, F. J., Rivard, C. L., Kubota, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grafting+fruiting+vegetables+to+manage+soilborne+pathogens,+foliar+pathogens,+arthropods+and+weeds.">Grafting fruiting vegetables to manage soilborne pathogens, foliar pathogens, arthropods and weeds.</a> Scientia Horticulturae. 127 (2), 127-146 (2010).</li><li>Asins, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+rootstock-mediated+nitrogen+(N)+uptake+and+root-to-shoot+signalling+at+contrasting+N+availabilities+in+tomato.">Genetic analysis of rootstock-mediated nitrogen (N) uptake and root-to-shoot signalling at contrasting N availabilities in tomato.</a> Plant Science. 263, 94-106 (2017).</li><li>Yin, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+protective+enzymes+in+tomato+rootstocks+to+resist+root+knot+nematodes.">Role of protective enzymes in tomato rootstocks to resist root knot nematodes.</a> Acta Horticulturae. 1086 (1086), 213-218 (2015).</li><li>Gaion, L. A., Carvalho, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Distance+Signaling:+what+grafting+has+revealed?.">Long-Distance Signaling: what grafting has revealed?.</a> Journal of Plant Growth Regulation. 37 (2), 694-704 (2018).</li><li>Turnbull, C. G., Hennig, L., K&#246;hler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grafting+as+a+research+tool.">Grafting as a research tool.</a> Plant Developmental Biology. , 11-26 (2010).</li><li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grafting-responsive+miRNAs+in+cucumber+and+pumpkin+seedlings+identified+by+high-throughput+sequencing+at+whole+genome+level.">Grafting-responsive miRNAs in cucumber and pumpkin seedlings identified by high-throughput sequencing at whole genome level.</a> Physiologia Plantarum. 151 (4), 406-422 (2014).</li><li>Lakhotia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+miRNAome+in+root,+stem,+leaf+and+tuber+developmental+stages+of+potato+(Solanum+tuberosum+L.)+by+high-throughput+sequencing.">Identification and characterization of miRNAome in root, stem, leaf and tuber developmental stages of potato (Solanum tuberosum L.) by high-throughput sequencing.</a> BMC Plant Biology. 14 (1), 6 (2014).</li><li>Jones-Rhoades, M. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR395+is+a+general+component+of+the+sulfate+assimilation+regulatory+network+in+Arabidopsis.">miR395 is a general component of the sulfate assimilation regulatory network in Arabidopsis.</a> FEBS Letters. 586 (19), 3242-3248 (2012).</li><li>Ali, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+of+RNA+silencing+signal+through+grafting+confers+virus+resistance+from+transgenically+silenced+tobacco+rootstocks+to+non-transgenic+tomato+and+tobacco+scions.">Transmission of RNA silencing signal through grafting confers virus resistance from transgenically silenced tobacco rootstocks to non-transgenic tomato and tobacco scions.</a> Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology. 25 (3), 245-252 (2016).</li><li>Li, Y. S., Li, C. H., Bai, L. Q., He, C. X., Yu, X. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+and+target+gene+responses+to+salt+stress+in+grafted+cucumber+seedlings.">MicroRNA and target gene responses to salt stress in grafted cucumber seedlings.</a> Acta Physiologiae Plantarum. 38 (2), 1-12 (2016).</li><li>Pagliarani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+accumulation+of+miRNAs+differentially+modulated+by+drought+stress+is+affected+by+grafting+in+grapevine.">The accumulation of miRNAs differentially modulated by drought stress is affected by grafting in grapevine.</a> Plant Physiology. 173 (4), 2180-2195 (2017).</li><li>Liu, N., Yang, J. H., Guo, S. G., Xu, Y., Zhang, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+and+comparative+analysis+of+conserved+and+novel+microRNAs+in+grafted+watermelon+by+high-throughput+sequencing.">Genome-wide identification and comparative analysis of conserved and novel microRNAs in grafted watermelon by high-throughput sequencing.</a> PLoS One. 8 (2), e57359 (2013).</li><li>Song, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+2JC-350+automatic+grafting+machine+with+cut+grafting+method+for+vegetable+seedling.">Development of 2JC-350 automatic grafting machine with cut grafting method for vegetable seedling.</a> Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering. 22 (12), 103-106 (2006).</li><li>Kumar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+leaf+rust+responsive+miRNAs+in+wheat+(triticum+aestivum+l.)+using+high-throughput+sequencing+and+prediction+of+their+targets+through+degradome+analysis.">Uncovering leaf rust responsive miRNAs in wheat (triticum aestivum l.) using high-throughput sequencing and prediction of their targets through degradome analysis.</a> Planta. 245 (1), 1-22 (2016).</li><li>Kohli, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+wilt+and+salt+stress-responsive+microRNAs+in+chickpea+through+high-throughput+sequencing.">Identification and characterization of wilt and salt stress-responsive microRNAs in chickpea through high-throughput sequencing.</a> PLoS One. 9 (10), e108851 (2014).</li><li>Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+challenges+in+next-generation+genomics.+International+Conference+on+Scientific+and+Statistical+Database+Management.">Computational challenges in next-generation genomics. International Conference on Scientific and Statistical Database Management.</a> ACM. 2, (2013).</li><li>Guo, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+draft+genome+of+watermelon+(Citrullus+lanatus)+and+resequencing+of+20+diverse+accessions.">The draft genome of watermelon (Citrullus lanatus) and resequencing of 20 diverse accessions.</a> Nature Genetics. 45, 51-58 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gourdbase:+a+genome-centered+multi-omics+database+for+the+bottle+gourd+(lagenaria+siceraria),+an+economically+important+cucurbit+crop.">Gourdbase: a genome-centered multi-omics database for the bottle gourd (lagenaria siceraria), an economically important cucurbit crop.</a> Scientific Reports. 8 (1), 306 (2018).</li><li>Wang, X. F., Liu, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Curation+of+miRBase+Annotation+Using+Integrated+Small+RNA+High-Throughput+Sequencing+Data+for+C.+elegans+and+Drosophila.">Systematic Curation of miRBase Annotation Using Integrated Small RNA High-Throughput Sequencing Data for C. elegans and Drosophila.</a> Frontiers in Genetics. 2, 25 (2011).</li><li>Bo, X. C., Wang, S. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TargetFinder:+a+software+for+antisense+oligonucleotide+target+site+selection+based+on+MAST+and+secondary+structures+of+target+mRNA.">TargetFinder: a software for antisense oligonucleotide target site selection based on MAST and secondary structures of target mRNA.</a> Bioinformatics. 21 (8), 1401-1402 (2005).</li><li>. GOATOOLS: Tools for Gene Ontology Available from: <a target="_blank" href="https://doi.org/10.5281/zenodo.31628">https://doi.org/10.5281/zenodo.31628</a> (2015)</li><li>Wang, L. P., Li, G. J., Wu, X. H., Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+proteomic+analyses+provide+novel+insights+into+the+effects+of+grafting+wound+and+hetero-grafting+per+se+on+bottle+gourd.">Comparative proteomic analyses provide novel insights into the effects of grafting wound and hetero-grafting per se on bottle gourd.</a> Scientia Horticulturae. 200 (8), 1-6 (2016).</li></ol>

En este protocolo describe en detalle un método altamente eficaz y reproducible para homo - y heterografts entre sandía y calabaza de botella. Este método, que requiere ningún equipamiento específico, es muy fácil de operar y por lo general tiene una tasa muy alta de supervivencia del injerto. El método también puede ser utilizado para hacer injertos de otras cucurbitáceas, como entre sandía, pepino y calabaza.
Cabe señalar que el tamaño relativo (edad) del portainjerto y el injert...

Injerto durante mucho tiempo se ha empleado como una técnica agrícola para mejorar la producción de cultivos y la tolerancia a estreses bióticos y abióticos1,2,3. En los sistemas de heterografting, portainjertos elite pueden mejorar la absorción de agua y nutrientes de las plantas, fortalecer la resistencia a patógenos del suelo y limitar los efectos negativos del metal toxicidad4,5, que puede conferir un mayor los injertos el vigor de crecimiento y mayor tolerancia a estrés ambiental. En muchos casos, heterografting también puede afectar calidad de fruta en plantas hortícolas, hacia la fruta mejor sabor y mayor contenido de compuestos relacionados con la salud6,7. Se ha encontrado que la transferencia interurbana de fitohormonas, RNAs, péptidos y proteínas entre el portainjerto y el injerto es un mecanismo fundamental modulando el crecimiento y desarrollo reprogramación de scion plantas8,9 ,10. El injerto se ha utilizado ampliamente en estudios de señalización de larga distancia y transporte en relación con la adaptación al medio11. Experimentos de injertos son especialmente potentes para la detección inequívoca de moléculas de transmisión en la recepción de tejidos o sap vascular y activación o supresión de dianas moleculares debido a la señal de transmisión12.
Non-coding RNAs, una gran clase de ARN que ejercen importantes funciones reguladoras en células, se han divulgado para desempeñar un papel en facilitar la adaptación de plantas a estrés abiótico13. miRNAs son endógenas pequeño no-codificación RNAs de unos 20-24 nt. estudios han puesto de manifiesto el papel regulador de miRNAs en diversos aspectos de las actividades de la planta, tales como disparar el crecimiento lateral raíz formación14,15,16, absorción de los nutrientes, metabolismo del sulfato y homeostasis17y respuestas a biótico y abiótico estrés18. Recientemente, fueron relacionados con la expresión de miRNAs y sus genes diana sal tolerancia al estrés en las plantas de semillero de pepino heterografted19. En los injertos intervariety de uva, las respuestas de expresión de miRNA a estrés de sequía fueron encontradas para ser dependiente del genotipo20.
El rápido desarrollo y disminuir el costo de la tecnología de secuenciación de alto rendimiento han proporcionado una gran oportunidad para el estudio de normas miRNA de plantas agronómicas. Sandía (Citrullus lanatus [Thunb.] Mansf.), un cultivo de cucurbitáceas importantes en todo el mundo, es susceptible a las bajas temperaturas. Botella de calabaza (Lagenaria siceraria [Molina] (Standl.) es una cucurbitáceas más resistente al clima utilizados por los agricultores al injerto con sandía. El objetivo principal del presente estudio es establecer un estándar, eficiente y un método conveniente para hacer heterografts entre sandía (Citrullus lanatus [Thunb.] Mansf.) y botella de calabaza (Lagenaria siceraria [Molina] Standl). Este protocolo también ofrece un plan experimental detallado y procedimientos analíticos para el estudio de la regulación de miRNA expresiones tras el injerto, que es útil para revelar los mecanismos que subyacen ventajas heterografting.
Los materiales de planta usados en este estudio incluyen el cultivar de sandía y el calabaza de botella landrace. Cultivo de sandía es un cultivo comercial con alto rendimiento pero susceptibles a las bajas temperaturas. Calabaza de botella landrace es una popular portainjertos para injertar con sandía, pepino y calabaza de botella, debido a su excelente tolerancia de bajas temperaturas21.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA-free DNase I</td>
			<td>Takara</td>
			<td>D2270A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Truseq Small RNA sample prep Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-200-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Bionalyser</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UEA sRNA workbench 2.4-plant version&#160;(software)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>http://srna-workbench.cmp.uea.ac.uk/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rfam 11.0 database&#160;(website)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>http://rfam.janelia.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRBase 22.0&#160;(website)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>http://www.mirbase.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIREAP(software)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://sourceforge.net/projects/mireap/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TargetFinder&#160;(software)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>http://targetfinder.org/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating homo- and heterografts between watermelon and bottle gourd for the study of cold-responsive micrornas

MicroRNAs (miRNAs) son endógenas pequeño no-codificación RNAs de unos 20-24 nt, conocido por desempeñar un papel importante en el desarrollo de las plantas y la adaptación. Hay una acumula evidencia que demuestra que las expresiones de ciertos miRNAs se alteran al injertar, una práctica agrícola utilizada por los agricultores para mejorar cultivos tolerancia a estreses bióticos y abióticos. Calabaza de botella es un cultivo inherentemente resistente al clima en comparación con muchas otras cucurbitáceas importantes, incluyendo sandía, haciéndola uno de los portainjertos más utilizados para este último. El reciente avance de las tecnologías de secuenciación de alto rendimiento ha proporcionado grandes oportunidades para investigar miRNAs sensible al frío y sus contribuciones a la ventajas de heteroinjertos; sin embargo, los procedimientos experimentales adecuados son un requisito previo para ello. Aquí, presentamos un protocolo detallado para la eficiente generación de homo - y heterografts entre la sandía fría-susceptibles y la calabaza de botella tolerantes al frío, además de métodos de muestreo de tejido, generación de datos y análisis de datos. Los métodos presentados son también útiles para otros sistemas de injerto de planta, para interrogar a miRNA regulaciones bajo diversas presiones ambientales, tales como calor, sequía y salinidad.

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58242/58242fig2.jpg"> Figura 2: fenotipos de varios injertos a temperatura ambiente y condiciones de frío-tensionado. (a) este panel muestra homo - y heterografted plantas a temperatura ambiente como el control. (b) este panel muestra homo - y heterografted plántulas después de 48 h de tratamiento en frío. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58242/58242fig2large....

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Generating Homo- and Heterografts Between Watermelon and Bottle Gourd for the Study of Cold-responsive MicroRNAs

Generación de Homo - y Heterografts entre sandía y calabaza de botella para el estudio de MicroRNAs sensible al frío

Aquí presentamos un protocolo detallado para hacer eficiente el homo - y heterografts entre sandía y calabaza de botella, además de métodos de muestreo de tejido, generación de datos y análisis de datos para la investigación de microRNAs sensible al frío.

MicroRNAs (miRNAs) are endogenous small non-coding RNAs of about 20 - 24 nt, known to play important roles in plant development and adaptation. There is ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la respuesta de miRNA a la capacidad de estrés en injertos de plantas, como cómo se regulan los miRNA bajo estrés frío en injertos de calabaza de botella de sandía. La principal ventaja de esta técnica es que es un método altamente eficiente y reproducible para hacer homo y heteroinjertos. No requiere ningún equipo específico, es muy fácil de realizar, y por lo general resulta en una tasa de supervivencia muy alta de injerto.A través de este método, puede proporcionar información sobre la respuesta de miRNA al estrés frío en el sistema de injerto de calabaza de botella de sandía. También se puede aplicar a otros organismos modernos para revelar los mecanismos del transporte miRNA local y de larga distancia. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de injerto son difíciles de aprender.Este paso requería habilidades avanzadas y son clave para la supervivencia de las plantas injertadas. Para empezar, remoja las semillas de calabaza de la botella en un vaso de precipitados de 500 mililitros de 58 grados centígrados de agua. Revuelva las semillas ocasionalmente hasta que la temperatura del agua baje a 40 grados centígrados.Mientras el agua se enfría, coloca tres kilogramos de tierra de turba en una bolsa de nylon y autoclave. Una vez que el agua alcance la temperatura ambiente, enjuague las semillas de dos a tres veces en agua destilada y drene el exceso de agua. Deje que las semillas broten en una bolsa de gasa a 28 grados centígrados en la cámara de crecimiento oscuro.Después de la germinación, sembrar las semillas en macetas de plástico llenas con el suelo de turba esterilizada. Cuando las plántulas de calabaza de la botella desarrollen dos cotiledones aplanados, repita este proceso con semillas de sandía. Cultivar la calabaza de la botella y las plántulas de sandía en una cámara de crecimiento.Agregue agua a las plántulas una vez al día por la tarde. A continuación, cortar los hipocotilos de las plántulas de sandía de dos a tres centímetros por debajo de los cotiledones. Cortar la parte superior de la botella de plántulas de calabaza en el lado, inmediatamente por encima de los cotiledones.A continuación, utilice un palillo de dientes para hacer un agujero en la parte superior de la botella recortada plántulas de calabaza. Inserte las plántulas de sandía recortadas en el orificio para hacer heteroinjertos. Después de esto, preparar homoinjertos utilizando el método descrito anteriormente.En primer lugar, envuelva las plántulas injertadas en bolsas de polietileno transparente para mantener una humedad relativamente alta. A continuación, mantenga las plántulas envueltas en una cámara de crecimiento durante siete días. Después del séptimo día, retire las bolsas y deje que las plantas crezcan en las mismas condiciones durante siete a 10 días.Divida las plántulas en dos grupos, uno para tratamientos fríos y otro para el control. Devuelva las plántulas de control a las mismas condiciones ambientales. Coloque las plántulas tratadas en frío en una cámara de crecimiento establecida en seis grados celsius con las mismas condiciones oscuras claras que el grupo de control.Después de 48 horas, deje las muestras de los scion y portainjertos de los injertos. Congele las muestras inmediatamente en nitrógeno líquido y guárdelas a menos 70 grados centígrados. Transfiera la muestra congelada a un tubo de microcentrífuga de dos mililitros en nitrógeno líquido.Agregue un cordón de acero inoxidable a cada tubo de muestra y homogeneice los tejidos a un polvo fino. Para cada combinación de injerto, tome cantidades iguales de muestra molida de 10 plántulas y mezcle en un tubo centrífugo de 10 mililitros. Añadir una cantidad adecuada de reactivo de clorhidrato de guanidio.A continuación, agregue DNase sin ARN de una a 150 unidades por mililitro a 37 grados Centígrados durante una hora. A continuación, determine la cantidad total de ARN en un sistema de electroforesis microcapilar. Después de esto, descongele los reactivos y adaptadores de normalización de la biblioteca.A continuación, ligar pequeño RNase con los cinco adaptadores primo y tres primos, y eluir y purificarlos. Transcribir de forma inversa los cinco primos y tres RNase pequeños ligados de primera calidad siguiendo las directrices del fabricante. A continuación, realice la amplificación de PCR siguiendo el protocolo del fabricante.A continuación, utilice el sistema de electroforesis microcailar para asegurarse de que el número de integridad del ARN es mayor que siete. Cargue un microlitro de una biblioteca de ARN en el sistema de electroforesis microcapilar para asegurarse de que el número de integridad del ARN sea mayor que siete. Por último, secuencia las pequeñas bibliotecas de ARN en un instrumento de secuenciación de alto rendimiento.Usando este protocolo, se obtuvo una tasa de supervivencia del 98% para el injerto y los fenotipos para condiciones de temperatura ambiente y estrés frío. sRNAs de 24 nucleótidos conformó la mayor clase de sRNAs en todas las combinaciones de injerto, independientemente del tratamiento de temperatura. Después de 48 horas de tratamiento en frío, 30 y 268 microARN fueron regulados hacia arriba y hacia abajo, respectivamente.En las hojas del scion en heteroinjertos, por el contrario, en las hojas del portainjerto, 31 y 12 microRNas fueron reguladas hacia arriba y hacia abajo, respectivamente. En los homoinjertos de sandía-sandía, 64 y 83 microARN fueron regulados hacia arriba y hacia abajo, respectivamente. Esto demostró que el heterografo causó una profunda reprogramación de las expresiones de microARN.Al intentar este procedimiento, es importante recordar el tamaño relativo y la edad del tallo de la hija y el scion es fundamental para hacer un injerto exitoso. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la secuenciación de lncRNA, el perfilado proteómico para investigar la regulación del lncRNA y la proteína y el sistema de codificación en el sistema de injerto. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para la investigación en el campo de la tolerancia abiótica de la planta para explorar el mecanismo de ventaja de injerto de plantas en Cucurbitaceae y más allá.No olvide que trabajar con clorhidrato de guanidina puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar las precauciones adecuadas con la realización de este procedimiento.

Research

JoVE Journal

Environment

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Investigación

Medio ambiente

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