Name: generating homo- and heterografts between watermelon and bottle gourd for the study of cold-responsive micrornas
Uploaded: 2018-11-20T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generating Homo- and Heterografts Between Watermelon and Bottle Gourd for the Study of Cold-responsive MicroRNAs at JoVE.com

Detta arbete fick stöd av den nationella naturvetenskap Foundation i Kina (31772191), forskningsprojektet för allmänintresset i Zhejiang-provinsen (2017C 32027), det nyckel vetenskap projekt av växtförädling i Zhejiang (2016C 02051) och det nationella programmet för Stöd av Top-notch unga yrkesverksamma (till P.X.).

1. utsäde sterilisering och grobarhet
<ol><li>För surface sterilisering, Blötlägg flaska kalebass frön i en 500 mL-bägare fylld med vatten vid 58 ° C med enstaka omrörning tills vattentemperaturen sjunker till 40 ° C.</li>
	<li>Under tiden, sätta 3 kg av torv jord i en nylonväska och, att sterilisera den, autoklav det vid 120 ° C/0.5 MPa i 20 min.</li>
	<li>Hålla blötläggning flaska kalebass frön för 4-5 h mer med ingen omrörning.<ol>
<li>När vattnet når rumstemperatur, skölj fröna 2 x - 3 x med d...

<ol>
	<li>Schwarz, D., Rouphael, Y., Colla, G., Venema, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grafting+as+a+tool+to+improve+tolerance+of+vegetables+to+abiotic+stresses:+Thermal+stress,+water+stress+and+organic+pollutants.">Grafting as a tool to improve tolerance of vegetables to abiotic stresses: Thermal stress, water stress and organic pollutants.</a> Scientia Horticulturae. 127, 162-171 (2010).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+tolerance+differences+in+cucumber+seedlings+grafted+on+rootstocks+with+different+tolerance+to+low+temperature+and+weak+light+stresses.">Mechanisms of tolerance differences in cucumber seedlings grafted on rootstocks with different tolerance to low temperature and weak light stresses.</a> Turkish Journal of Botany. 39 (4), 606-614 (2015).</li><li>Li, C. H., Li, Y. S., Bai, L. Q., He, C. X., Yu, X. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Expression+of+miRNAs+and+Their+Targets+in+the+Response+to+Drought+Stress+of+Grafted+Cucumber+Seedlings.">Dynamic Expression of miRNAs and Their Targets in the Response to Drought Stress of Grafted Cucumber Seedlings.</a> Horticultural Plant Journal. 2 (1), 41-49 (2016).</li><li>Rouphael, Y., Cardarelli, M., Colla, G., Rea, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yield,+mineral+composition,+water+relations,+and+water+use+efficiency+of+grafted+mini-watermelon+plants+under+deficit+irrigation.">Yield, mineral composition, water relations, and water use efficiency of grafted mini-watermelon plants under deficit irrigation.</a> HortScience. 43 (3), 730-736 (2008).</li><li>Savvas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactive+effects+of+grafting+and+manganese+supply+on+growth,+yield,+and+nutrient+uptake+by+tomato.">Interactive effects of grafting and manganese supply on growth, yield, and nutrient uptake by tomato.</a> HortScience. 44 (7), 1978-1982 (2009).</li><li>Aloni, B., Cohen, R., Karni, L., Aktas, H., Edelstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+signaling+in+rootstock-scion+interactions.">Hormonal signaling in rootstock-scion interactions.</a> Scientia Horticulturae. 127, 119-126 (2010).</li><li>Rouphael, Y., Caradrelli, M., Rea, E., Colla, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+melon+and+cucumber+photosynthetic+activity,+mineral+composition,+and+growth+performance+under+salinity+stress+by+grafting+onto+Cucurbita+hybrid+rootstocks.">Improving melon and cucumber photosynthetic activity, mineral composition, and growth performance under salinity stress by grafting onto Cucurbita hybrid rootstocks.</a> Photosynthetica. 50 (2), 180-188 (2012).</li><li>Louws, F. J., Rivard, C. L., Kubota, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grafting+fruiting+vegetables+to+manage+soilborne+pathogens,+foliar+pathogens,+arthropods+and+weeds.">Grafting fruiting vegetables to manage soilborne pathogens, foliar pathogens, arthropods and weeds.</a> Scientia Horticulturae. 127 (2), 127-146 (2010).</li><li>Asins, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+rootstock-mediated+nitrogen+(N)+uptake+and+root-to-shoot+signalling+at+contrasting+N+availabilities+in+tomato.">Genetic analysis of rootstock-mediated nitrogen (N) uptake and root-to-shoot signalling at contrasting N availabilities in tomato.</a> Plant Science. 263, 94-106 (2017).</li><li>Yin, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+protective+enzymes+in+tomato+rootstocks+to+resist+root+knot+nematodes.">Role of protective enzymes in tomato rootstocks to resist root knot nematodes.</a> Acta Horticulturae. 1086 (1086), 213-218 (2015).</li><li>Gaion, L. A., Carvalho, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Distance+Signaling:+what+grafting+has+revealed?.">Long-Distance Signaling: what grafting has revealed?.</a> Journal of Plant Growth Regulation. 37 (2), 694-704 (2018).</li><li>Turnbull, C. G., Hennig, L., K&#246;hler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grafting+as+a+research+tool.">Grafting as a research tool.</a> Plant Developmental Biology. , 11-26 (2010).</li><li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grafting-responsive+miRNAs+in+cucumber+and+pumpkin+seedlings+identified+by+high-throughput+sequencing+at+whole+genome+level.">Grafting-responsive miRNAs in cucumber and pumpkin seedlings identified by high-throughput sequencing at whole genome level.</a> Physiologia Plantarum. 151 (4), 406-422 (2014).</li><li>Lakhotia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+miRNAome+in+root,+stem,+leaf+and+tuber+developmental+stages+of+potato+(Solanum+tuberosum+L.)+by+high-throughput+sequencing.">Identification and characterization of miRNAome in root, stem, leaf and tuber developmental stages of potato (Solanum tuberosum L.) by high-throughput sequencing.</a> BMC Plant Biology. 14 (1), 6 (2014).</li><li>Jones-Rhoades, M. W., Bartel, D. P., Bartel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+and+their+regulatory+roles+in+plants.">MicroRNAs and their regulatory roles in plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 57, 19-53 (2006).</li><li>Puzey, J. R., Kramer, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+conserved+Aquilegia+coerulea+microRNAs+and+their+targets.">Identification of conserved Aquilegia coerulea microRNAs and their targets.</a> Genetic. 448 (1), 46-56 (2009).</li><li>Matthewman, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR395+is+a+general+component+of+the+sulfate+assimilation+regulatory+network+in+Arabidopsis.">miR395 is a general component of the sulfate assimilation regulatory network in Arabidopsis.</a> FEBS Letters. 586 (19), 3242-3248 (2012).</li><li>Ali, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+of+RNA+silencing+signal+through+grafting+confers+virus+resistance+from+transgenically+silenced+tobacco+rootstocks+to+non-transgenic+tomato+and+tobacco+scions.">Transmission of RNA silencing signal through grafting confers virus resistance from transgenically silenced tobacco rootstocks to non-transgenic tomato and tobacco scions.</a> Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology. 25 (3), 245-252 (2016).</li><li>Li, Y. S., Li, C. H., Bai, L. Q., He, C. X., Yu, X. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+and+target+gene+responses+to+salt+stress+in+grafted+cucumber+seedlings.">MicroRNA and target gene responses to salt stress in grafted cucumber seedlings.</a> Acta Physiologiae Plantarum. 38 (2), 1-12 (2016).</li><li>Pagliarani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+accumulation+of+miRNAs+differentially+modulated+by+drought+stress+is+affected+by+grafting+in+grapevine.">The accumulation of miRNAs differentially modulated by drought stress is affected by grafting in grapevine.</a> Plant Physiology. 173 (4), 2180-2195 (2017).</li><li>Liu, N., Yang, J. H., Guo, S. G., Xu, Y., Zhang, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+and+comparative+analysis+of+conserved+and+novel+microRNAs+in+grafted+watermelon+by+high-throughput+sequencing.">Genome-wide identification and comparative analysis of conserved and novel microRNAs in grafted watermelon by high-throughput sequencing.</a> PLoS One. 8 (2), e57359 (2013).</li><li>Song, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+2JC-350+automatic+grafting+machine+with+cut+grafting+method+for+vegetable+seedling.">Development of 2JC-350 automatic grafting machine with cut grafting method for vegetable seedling.</a> Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering. 22 (12), 103-106 (2006).</li><li>Kumar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+leaf+rust+responsive+miRNAs+in+wheat+(triticum+aestivum+l.)+using+high-throughput+sequencing+and+prediction+of+their+targets+through+degradome+analysis.">Uncovering leaf rust responsive miRNAs in wheat (triticum aestivum l.) using high-throughput sequencing and prediction of their targets through degradome analysis.</a> Planta. 245 (1), 1-22 (2016).</li><li>Kohli, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+wilt+and+salt+stress-responsive+microRNAs+in+chickpea+through+high-throughput+sequencing.">Identification and characterization of wilt and salt stress-responsive microRNAs in chickpea through high-throughput sequencing.</a> PLoS One. 9 (10), e108851 (2014).</li><li>Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+challenges+in+next-generation+genomics.+International+Conference+on+Scientific+and+Statistical+Database+Management.">Computational challenges in next-generation genomics. International Conference on Scientific and Statistical Database Management.</a> ACM. 2, (2013).</li><li>Guo, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+draft+genome+of+watermelon+(Citrullus+lanatus)+and+resequencing+of+20+diverse+accessions.">The draft genome of watermelon (Citrullus lanatus) and resequencing of 20 diverse accessions.</a> Nature Genetics. 45, 51-58 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gourdbase:+a+genome-centered+multi-omics+database+for+the+bottle+gourd+(lagenaria+siceraria),+an+economically+important+cucurbit+crop.">Gourdbase: a genome-centered multi-omics database for the bottle gourd (lagenaria siceraria), an economically important cucurbit crop.</a> Scientific Reports. 8 (1), 306 (2018).</li><li>Wang, X. F., Liu, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Curation+of+miRBase+Annotation+Using+Integrated+Small+RNA+High-Throughput+Sequencing+Data+for+C.+elegans+and+Drosophila.">Systematic Curation of miRBase Annotation Using Integrated Small RNA High-Throughput Sequencing Data for C. elegans and Drosophila.</a> Frontiers in Genetics. 2, 25 (2011).</li><li>Bo, X. C., Wang, S. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TargetFinder:+a+software+for+antisense+oligonucleotide+target+site+selection+based+on+MAST+and+secondary+structures+of+target+mRNA.">TargetFinder: a software for antisense oligonucleotide target site selection based on MAST and secondary structures of target mRNA.</a> Bioinformatics. 21 (8), 1401-1402 (2005).</li><li>. GOATOOLS: Tools for Gene Ontology Available from: <a target="_blank" href="https://doi.org/10.5281/zenodo.31628">https://doi.org/10.5281/zenodo.31628</a> (2015)</li><li>Wang, L. P., Li, G. J., Wu, X. H., Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+proteomic+analyses+provide+novel+insights+into+the+effects+of+grafting+wound+and+hetero-grafting+per+se+on+bottle+gourd.">Comparative proteomic analyses provide novel insights into the effects of grafting wound and hetero-grafting per se on bottle gourd.</a> Scientia Horticulturae. 200 (8), 1-6 (2016).</li></ol>

Detta protokoll beskriver vi i detalj en högeffektiv och reproducerbar metod för att göra homo- och heterografts mellan vattenmelon och flaska kalebass. Denna metod, som kräver ingen särskild utrustning, är mycket lätt att använda och har vanligtvis en mycket hög överlevnad av ympning. Metoden kan också användas för att göra grafts för andra gurkväxter, som mellan vattenmelon, gurka och pumpa.
Det är värt att notera att den relativa storleken (år) av rotstock och scion är a...

Ympning har länge använts som en jordbruks teknik att förbättra vegetabilieproduktion och tolerans mot biotiska och abiotiska betonar1,2,3. I heterografting system, kan elite grundstammar förbättra vatten och näringsämnen upptag av växter, stärka motstånd till jord patogener och begränsa de negativa effekterna av metal toxicitet4,5, som kan ge grafterna en förbättrad tillväxt vigor och ökad tolerans mot miljöpåfrestningar. I många fall kan heterografting också påverka frukt kvaliteter i trädgårds-växter, vilket leder till förbättrad fruktsmak och ökat innehåll av hälsorelaterade föreningar6,7. Det har konstaterats att långväga överföring av fytohormoner, RNAs, peptider och proteiner mellan grundstammen och scion är en grundläggande mekanism modulerande tillväxt och utveckling omprogrammering av scion växter8,9 ,10. Ympning har använts i studier av långdistans signalering och transporter i förhållande till miljöanpassning11. Ympning experiment är särskilt kraftfull för entydig identifiering av överförda molekyler i mottagande vävnad eller vaskulär sap, och aktiveringen eller undertryckande av molekylära mål på grund av signal transmission12.
Icke-kodande RNAs, en stor klass av RNA som utöva viktiga reglerande funktioner i celler, har rapporterats att spela en roll i att underlätta växt anpassning till abiotisk stress13. MicroRNA är endogena liten icke-kodande RNAs av omkring 20-24 nt. studier har visat reglerande roll av MicroRNA i olika aspekter av anläggningen aktiviteter, sådan som skjuter tillväxt, lateral rot bildandet14,15,16, näringsupptag, sulfat metabolism och homeostas17och Svaren till biotiska och abiotiska betona18. Nyligen, uttryck för MicroRNA och deras målgener var relaterade till salt stresstålighet i heterografted gurka plantor19. I intervariety grafterna av druvmust befanns svaren från miRNA uttryck till torkstress vara genotyp beroende20.
Den snabba utvecklingen och minskar kostnaden för hög genomströmning sekvenseringsteknologi har gett en stor möjlighet för studier av miRNA förordningar i agronomiska växter. Vattenmelon (Citrullus lanatus [Thunb.] Mansf.), en viktig cucurbit gröda som odlas över hela världen, är mottagliga för låga temperaturer. Flaska kalebass (Lagenaria siceraria [Molina] Standl.) är ett mer klimattåligt cucurbit som ofta används av jordbrukare för att ympa med vattenmelon. Det primära målet för den aktuella studien är att fastställa en standard, effektiv och bekväm metod för att göra heterografts mellan vattenmelon (Citrullus lanatus [Thunb.] Mansf.) och flaskan kalebass (Lagenaria siceraria [Molina] Standl). Detta protokoll ger också en detaljerad experimentella system och analytiska förfaranden för studiet av regleringen av miRNA uttryck efter ympning, vilket är användbart för att avslöja de mekanismerna bakom heterografting fördelar.
De växtmaterial som används i denna studie inkluderar vattenmelon sorten och flaskan kalebass lantras. Vattenmelon sorten är en kommersiell sort med hög kapacitet men mottagliga för låga temperaturer. Flaska kalebass lantras är en populär grundstamssticklingar för ympning med vattenmelon, gurka och flaska kalebass, på grund av dess utmärkta tolerans av låga temperaturer21.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA-free DNase I</td>
			<td>Takara</td>
			<td>D2270A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Truseq Small RNA sample prep Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-200-0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Bionalyser</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UEA sRNA workbench 2.4-plant version&#160;(software)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>http://srna-workbench.cmp.uea.ac.uk/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rfam 11.0 database&#160;(website)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>http://rfam.janelia.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRBase 22.0&#160;(website)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>http://www.mirbase.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIREAP(software)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>https://sourceforge.net/projects/mireap/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TargetFinder&#160;(software)</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>http://targetfinder.org/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating homo- and heterografts between watermelon and bottle gourd for the study of cold-responsive micrornas

MikroRNA (Mirna) är endogena liten icke-kodande RNAs av omkring 20-24 nt, känd för att spela viktiga roller i växten utveckling och anpassning. Det finns en ackumulerande bevis visar att uttrycken för vissa MicroRNA ändras när ympning, en jordbrukspraxis som vanligen används av jordbrukare för att förbättra gröda tolerans mot biotiska och abiotiska påfrestningar. Flaska kalebass är en inneboende klimattålig gröda jämfört med många andra stora gurkväxter, inklusive vattenmelon, gör den en av de mest använda grundstammar för den senare. Senaste befordran av hög genomströmning sekvensering teknik har gett stora möjligheter att undersöka kallt-lyhörd MicroRNA och deras bidrag till heterograft fördelar; men är tillräckliga experimentella rutiner en förutsättning för detta ändamål. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för att effektivt generera homo- och heterografts mellan kall-mottagliga vattenmelon och kalla-tolerant flaskan kalebass, utöver metoder för vävnad provtagning, data generation och dataanalys. Metoderna som presenteras är också användbara för andra växt-ympning system, att förhöra miRNA föreskrifter enligt olika miljöpåfrestningar, såsom värme, torka och salthalt.

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58242/58242fig2.jpg"> Figur 2: fenotyper av olika ympkvistar i rumstemperatur och kalla-stressade förhållanden. (en) i denna panel visas homo- och heterografted plantor vid rumstemperatur som kontroll. (b) i denna panel visas homo- och heterografted plantor efter 48 h av kylbehandling. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58242/58242fig2large.jpg" target="_blank">Kl...

Watch this Scientific Journal Video about Generating Homo- and Heterografts Between Watermelon and Bottle Gourd for the Study of Cold-responsive MicroRNAs at JoVE.com

Generating Homo- and Heterografts Between Watermelon and Bottle Gourd for the Study of Cold-responsive MicroRNAs

Generera Homo- och Heterografts mellan vattenmelon och flaska kalebass för studien av kalla-lyhörd mikroRNA

Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för att effektivt göra homo- och heterografts mellan vattenmelon och flaska kalebass, utöver metoder för vävnad provtagning, data generation och dataanalys, för utredning av kalla-lyhörd mikroRNA.

MicroRNAs (miRNAs) are endogenous small non-coding RNAs of about 20 - 24 nt, known to play important roles in plant development and adaptation. There is ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor i miRNA svar på förmåga att stress i växttransplantat såsom hur miRNA regleras under kall stress i vattenmelon flaska gourd ympkvistar. Den största fördelen med denna teknik är att det är mycket effektiv och reproducerbar metod för att göra homo och heterografts. Det kräver ingen specifik utrustning, det är mycket lätt att utföra, och vanligtvis resulterar i en mycket hög överlevnad av ympning.Genom denna metod, kan ge insikt i miRNA svar på kall stress i vattenmelon flaskans gourd graft system. Det kan också appliceras till andra moderna organismer för avslöjande mekanismerna av lokal- och långdistans miRNA trans. Visuell demonstration av denna metod är kritisk som ympning steg är svåra att lära.Detta steg krävs avancerade färdigheter och är nyckeln till överlevnaden av de ympade växterna. Till att börja med blöt flaska gourd frön i en 500 milliliter bägare på 58 grader Celsius vatten. Rör om fröna ibland tills vattentemperaturen sjunker till 40 grader Celsius.Medan vattnet svalnar, lägg tre kilo torv jord i en nylonpåse och autoklavera den. När vattnet når rumstemperatur, skölj fröna två till tre gånger i destillerat vatten och dränera överflödigt vatten. Låt fröna att gro i en gasbinda påse vid 28 grader Celsius i den mörka tillväxtkammaren.Efter groning, så fröna i plastkrukor fyllda med den steriliserade torvjorden. När flaskan gourd plantor utveckla två tillplattad cotyledons, upprepa denna process med vattenmelon frön. Odla flaskans gourd och vattenmelon plantor i en tillväxtkammare.Tillsätt vatten till plantorna en gång per dag på eftermiddagen. Därefter skär hypocotyls av vattenmelon plantor två till tre centimeter under cotyledons. Skär toppen av flaskan gourd plantor vid sidan, omedelbart ovanför cotyledons.Använd sedan en tandpetare för att göra ett hål i toppen av den trimmade flaskan gourd plantor. Sätt i de trimmade vattenmelon plantorna i hålet för att göra heterografts. Efter detta, förbereda homografts med den tidigare beskrivna metoden.Först linda de ympade plantorna i genomskinliga polyeten påsar för att upprätthålla en relativt hög luftfuktighet. Bibehåll sedan de inslagna plantorna i en tillväxtkammare i sju dagar. Efter den sjunde dagen, ta bort påsarna och låta växterna att växa under samma förhållanden i sju till 10 dagar.Dela plantorna i två grupper, en för kalla behandlingar och en för kontroll. Återför styrplantorna till samma miljöförhållanden. Placera de kalla behandlade plantorna i en tillväxtkammare inställd på sex grader Celsius med samma ljusa mörka förhållanden som kontrollgruppen.Efter 48 timmar, lämna proverna av ättlingen och grundstammarna från ympkvistarna. Frys proverna omedelbart i flytande kväve och förvara dem på minus 70 grader Celsius. Överför det frysta provet till ett två milliliter mikrocentrifugrör i flytande kväve.Tillsätt en rostfri pärla till varje provrör och homogenisera vävnaderna till ett fint pulver. För varje ympningskombination, ta lika stora mängder markprov från 10 plantor och blanda dem i ett centrifugrör på 10 milliliter. Tillsätt en lämplig mängd guanidiumhydrokloridreagens.Därefter lägger du till RNA-fria DNase en till 150 enheter per milliliter vid 37 grader Celsius i en timme. Sedan bestämma den totala RNA-kvantiteten på ett mikrokapillärelektroforessystem. Efter detta tina biblioteket normalisering reagenser och adaptrar.Sedan ligate små RNase med de fem främsta och tre främsta adaptrar, och elute och rena dem. Omvänd transkribera de fem främsta och tre främsta ligerade små RNase följer tillverkarens riktlinjer. Därefter utför PCR-förstärkning efter tillverkarens protokoll.Använd sedan mikrocaillarytroforessystemet för att säkerställa att RNA-integritetsnumret är större än sju. Ladda en mikroliter av ett RNA-bibliotek på mikrokapillärelektroforessystemet för att säkerställa att RNA-integritetsnumret är större än sju. Slutligen sekvens de små RNA-biblioteken på en hög genomströmning sekvensering instrument.Med hjälp av detta protokoll erhölls en 98%överlevnadsgrad för ympning och fenotyperna för rumstemperatur och kalla stressförhållanden. sRNAs av 24 nucleotides gjorde upp den största klassen av sRNAs i alla ympning kombination, oavsett temperaturbehandling. Efter 48 timmars kall behandling var 30 respektive 268 mikroRNA upp- och nedreglerade.I bladen på ättlingen i heterografts, omvänt, i bladen på grundstammen, 31 och 12 microRNAs var upp och ner-reglerade, respektive. I vattenmelon-vattenmelon homografts, 64 och 83 microRNAs var upp och ned-reglerade, respektive. Detta visade att heterografting orsakade djupgående omprogrammering av mikroRNA uttryck.Medan du försöker detta förfarande, Det är viktigt att komma ihåg den relativa storleken och ålder dotter stjälk och scion är avgörande för att göra en framgångsrik transplantat. Efter denna procedur, andra metoder som lncRNA sekvensering, proteomisk profilering kan utföras i syfte att undersöka regleringen av lncRNA och protein och kodningssystemet i ympningssystemet. Efter dess utveckling, denna teknik banade väg för forskning inom området växt abiotiska tolerans att utforska mekanismen för växt ympning fördel i Cucurbitaceae och därefter.Glöm inte att arbeta med guanidinhydroklorid kan vara extremt farligt och lämpliga försiktighetsåtgärder bör alltid vidtas med att utföra detta förfarande.

Research

JoVE Journal

Environment

Transcript and Metabolite Profiling for the Evaluation of Tobacco Tree and Poplar as Feedstock for the Bio-based Industry

Transcript och metabolit profilering för utvärdering av tobaks Träd och poppel som råvara för biobaserade industri

The global demand for food, feed, energy, and water poses extraordinary challenges for future generations. It is evident that robust platforms for the ...

The Use of High-resolution Infrared Thermography (HRIT) for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

The Use of High-resolution Infrared Thermography HRIT for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

Användning av hög upplösning IR Termografi (HRIT) för studier av iskämbildande och Ice förökning i växter

Freezing events that occur when plants are actively growing can be a lethal event, particularly if the plant has no freezing tolerance. Such frost events ...

Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health

Empirisk, gjorts och beräkningstekniker belysa mekanismerna genom vilka fungicider kompromiss bihälsa

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered ...

Protocol for Microplastics Sampling on the Sea Surface and Sample Analysis

Protokoll för Microplastics Provtagning på havsytan och Provanalys

Microplastic pollution in the marine environment is a scientific topic that has received increasing attention over the last decade. The majority of ...

Extraction of Organochlorine Pesticides from Plastic Pellets and Plastic Type Analysis

Extraktion av organiska klorpesticider från plastpellets och plasttypsanalys

Plastic resin pellets, categorized as microplastics (&#8804;5 mm in diameter), are small granules that can be unintentionally released to the environment ...

Experimental Column Setup for Studying Anaerobic Biogeochemical Interactions Between Iron (Oxy)Hydroxides, Trace Elements, and Bacteria

Experimental Column Setup for Studying Anaerobic Biogeochemical Interactions Between Iron OxyHydroxides, Trace Elements, and Bacteria

Experimentell kolumn Setup för att studera anaerob biogeokemiska interaktioner mellan järnhydroxider (Oxy), spårämnen och bakterier

Fate and speciation of trace elements (TEs), such as arsenic (As) and mercury (Hg), in aquifers are closely related to physio-chemical conditions, such as ...

Ecosystem Fabrication (EcoFAB) Protocols for The Construction of Laboratory Ecosystems Designed to Study Plant-microbe Interactions

Ecosystem Fabrication EcoFAB Protocols for The Construction of Laboratory Ecosystems Designed to Study Plant-microbe Interactions

Ekosystemet Fabrication (EcoFAB) protokoll för byggandet av laboratoriet ekosystem för att studera växt-mikrobinteraktioner

Beneficial plant-microbe interactions offer a sustainable biological solution with the potential to boost low-input food and bioenergy production. A ...

Experimental Study of the Relationship Between Particle Size and Methane Sorption Capacity in Shale

Experimentell studie av förhållandet mellan partikelstorlek och metan Sorption kapacitet i skiffer

The amount of adsorbed shale gas is a key parameter used in shale gas resource evaluation and target area selection, and it is also an important standard ...

Harvesting Venom Toxins from Assassin Bugs and Other Heteropteran Insects

Skörda Venom gifter från Assassin buggar och andra Heteropteran insekter

Heteropteran insects such as assassin bugs (Reduviidae) and giant water bugs (Belostomatidae) descended from a common predaceous and venomous ancestor, ...

Choice and No-Choice Bioassays to Study the Pupation Preference and Emergence Success of Ectropis grisescens

Choice and No-Choice Bioassays to Study the Pupation Preference and Emergence Success of Ectropis grisescens

Val och nr-val Bioassays att studera förpuppningen preferens och uppkomsten framgång av Ectropis grisescens

Many insects live above the ground as larvae and adults and as pupate below the ground. Compared to the above-ground stages of their life cycles, less ...