Name: arbovirus infections as screening tools for the identification of viral immunomodulators and host antiviral factors
Uploaded: 2018-09-13T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors at JoVE.com

D.G.는 텍사스 대학의 남서부 의료 센터의 부여 학자 프로그램에서 자금을 지원 했다. 저자는 마이클 휘 트 (테네시 대학 건강 과학 센터)와 숀 Whelan (하버드의과 대학) VSV DsRed 및 VSV 뤽의 조항에 대 한 감사. 또한 저자 게리 Luker (미시간 대학의과 대학) VACV-플로리다-GFP 긴장의 종류 선물 감사합니다.

1. 일반적인 Lymantria dispar (LD652) 세포와 바이러스 문화
<ol><li>
LD652 셀 배양 및 도금
	<ol>
<li>문화 나 dispar-파생된 LD652 세포는 정상적인 분위기에서 27 ° C에서 incubated 성장 매체 (자료 테이블)에 있는 세포의 단층을 유지. 조직 문화 취급 요리 10 cm 세포를 유지 하 고 80 %confluency 도달 시 세포를 통과.</li>
		<li>하려면 접시, 접시에서 부착 LD652 셀 (이 셀이 꺼...

<ol>
	<li>Nomaguchi, M., Fujita, M., Miyazaki, Y., Adachi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+tropism.">Viral tropism.</a> Frontiers in Microbiology. 3, 281 (2012).</li><li>Werden, S. J., McFadden, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cell+signaling+in+poxvirus+tropism:+the+case+of+the+M-T5+host+range+protein+of+myxoma+virus.">The role of cell signaling in poxvirus tropism: the case of the M-T5 host range protein of myxoma virus.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1784 (1), 228-237 (2008).</li><li>McFadden, G., Mohamed, M. R., Rahman, M. M., Bartee, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+determinants+of+viral+tropism.">Cytokine determinants of viral tropism.</a> Nature Reviews: Immunology. 9 (9), 645-655 (2009).</li><li>Silva, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second-generation+shRNA+libraries+covering+the+mouse+and+human+genomes.">Second-generation shRNA libraries covering the mouse and human genomes.</a> Nature Genetics. 37 (11), 1281-1288 (2005).</li><li>Moffat, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lentiviral+RNAi+library+for+human+and+mouse+genes+applied+to+an+arrayed+viral+high-content+screen.">A lentiviral RNAi library for human and mouse genes applied to an arrayed viral high-content screen.</a> Cell. 124 (6), 1283-1298 (2006).</li><li>Ma, D., Liu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Editing+and+Its+Applications+in+Model+Organisms.">Genome Editing and Its Applications in Model Organisms.</a> Genomics Proteomics Bioinformatics. 13 (6), 336-344 (2015).</li><li>Yin, H., Kauffman, K. J., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+technologies+for+genome+editing.">Delivery technologies for genome editing.</a> Nature Reviews: Drug Discovery. 16 (6), 387-399 (2017).</li><li>Hao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+RNAi+screen+identifies+host+genes+important+for+influenza+virus+replication.">Drosophila RNAi screen identifies host genes important for influenza virus replication.</a> Nature. 454 (7206), 890-893 (2008).</li><li>Houzet, L., Jeang, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+screening+using+RNA+interference+to+study+host+factors+in+viral+replication+and+pathogenesis.">Genome-wide screening using RNA interference to study host factors in viral replication and pathogenesis.</a> Experimental Biology and Medicine. 236 (8), 962-967 (2011).</li><li>Marceau, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+Flaviviridae+host+factors+through+genome-scale+CRISPR+screens.">Genetic dissection of Flaviviridae host factors through genome-scale CRISPR screens.</a> Nature. 535 (7610), 159-163 (2016).</li><li>Savidis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Zika+Virus+and+Dengue+Virus+Dependency+Factors+using+Functional+Genomics.">Identification of Zika Virus and Dengue Virus Dependency Factors using Functional Genomics.</a> Cell Reports. 16 (1), 232-246 (2016).</li><li>Panda, D., Cherry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-based+genomic+screening:+elucidating+virus-host+interactions.">Cell-based genomic screening: elucidating virus-host interactions.</a> Current Opinion in Virology. 2 (6), 784-792 (2012).</li><li>Gammon, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+vertebrate+DNA+virus+protein+disarms+invertebrate+immunity+to+RNA+virus+infection.">A single vertebrate DNA virus protein disarms invertebrate immunity to RNA virus infection.</a> Elife. 3, (2014).</li><li>Letchworth, G. J., Rodriguez, L. L., Del cbarrera, ., J, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+stomatitis.">Vesicular stomatitis.</a> Veterinary Journal. 157 (3), 239-260 (1999).</li><li>Whelan, S. P., Ball, L. A., Barr, J. N., Wertz, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+recovery+of+infectious+vesicular+stomatitis+virus+entirely+from+cDNA+clones.">Efficient recovery of infectious vesicular stomatitis virus entirely from cDNA clones.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (18), 8388-8392 (1995).</li><li>Cureton, D. K., Massol, R. H., Saffarian, S., Kirchhausen, T. L., Whelan, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+stomatitis+virus+enters+cells+through+vesicles+incompletely+coated+with+clathrin+that+depend+upon+actin+for+internalization.">Vesicular stomatitis virus enters cells through vesicles incompletely coated with clathrin that depend upon actin for internalization.</a> PLoS Pathogens. 5 (4), e1000394 (2009).</li><li>Duntsch, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+vesicular+stomatitis+virus+vectors+as+oncolytic+agents+in+the+treatment+of+high-grade+gliomas+in+an+organotypic+brain+tissue+slice-glioma+coculture+model.">Recombinant vesicular stomatitis virus vectors as oncolytic agents in the treatment of high-grade gliomas in an organotypic brain tissue slice-glioma coculture model.</a> Journal of Neurosurgery. 100 (6), 1049-1059 (2004).</li><li>Li, Y., Yuan, S., Moyer, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+non-permissive+infection+of+insect+(gypsy+moth)+LD-652+cells+by+Vaccinia+virus.">The non-permissive infection of insect (gypsy moth) LD-652 cells by Vaccinia virus.</a> Virology. 248 (1), 74-82 (1998).</li><li>Seet, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poxviruses+and+immune+evasion.">Poxviruses and immune evasion.</a> Annual Review of Immunology. 21, 377-423 (2003).</li><li>Cotter, C. A., Earl, P. L., Wyatt, L. S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Cell+Cultures+and+Vaccinia+Virus+Stocks.">Preparation of Cell Cultures and Vaccinia Virus Stocks.</a> Current Protocols in Microbiology. 39, 11-18 (2015).</li><li>Andrei, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cidofovir+resistance+in+vaccinia+virus+is+linked+to+diminished+virulence+in+mice.">Cidofovir resistance in vaccinia virus is linked to diminished virulence in mice.</a> Journal of Virology. 80 (19), 9391-9401 (2006).</li><li>Dascher, C., VanSlyke, J. K., Thomas, L., Balch, W. E., Thomas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+recombinant+vaccinia+virus+for+expression+of+small+GTPases.">Preparation of recombinant vaccinia virus for expression of small GTPases.</a> Methods in Enzymology. , 174-188 (1995).</li><li>Martin, A., Rex, E. A., Ishidate, T., Lin, R., Gammon, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+Caenorhabditis+elegans+with+Vesicular+Stomatitis+Virus+via+Microinjection.">Infection of Caenorhabditis elegans with Vesicular Stomatitis Virus via Microinjection.</a> Bio-Protocol. 7 (22), (2017).</li><li>Luker, K. E., Hutchens, M., Schultz, T., Pekosz, A., Luker, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+of+vaccinia+virus:+effects+of+interferon+on+viral+replication+and+spread.">Bioluminescence imaging of vaccinia virus: effects of interferon on viral replication and spread.</a> Virology. 341 (2), 284-300 (2005).</li><li>Rozelle, D. K., Filone, C. M., Dower, K., Connor, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+reporter+viruses+for+quantifying+viral+function+at+all+stages+of+gene+expression.">Vaccinia reporter viruses for quantifying viral function at all stages of gene expression.</a> Journal of Visualizes Experiments. (87), e51522 (2014).</li><li>Cao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+transcriptome+of+the+Asian+gypsy+moth+Lymantria+dispar+identifies+numerous+transcripts+associated+with+insecticide+resistance.">Characterization of the transcriptome of the Asian gypsy moth Lymantria dispar identifies numerous transcripts associated with insecticide resistance.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 119, 54-61 (2015).</li><li>Sparks, M. E., Blackburn, M. B., Kuhar, D., Gundersen-Rindal, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+of+the+Lymantria+dispar+(gypsy+moth)+larval+midgut+in+response+to+infection+by+Bacillus+thuringiensis.">Transcriptome of the Lymantria dispar (gypsy moth) larval midgut in response to infection by Bacillus thuringiensis.</a> PloS One. 8 (5), e61190 (2013).</li><li>Sparks, M. E., Gundersen-Rindal, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lymantria+dispar+IPLB-Ld652Y+cell+line+transcriptome+comprises+diverse+virus-associated+transcripts.">The Lymantria dispar IPLB-Ld652Y cell line transcriptome comprises diverse virus-associated transcripts.</a> Viruses. 3 (11), 2339-2350 (2011).</li><li>Lin, G., Li, G., Granados, R. R., Blissard, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+cell+lines+expressing+baculovirus+P35:+resistance+to+apoptosis+and+nutrient+stress,+and+increased+glycoprotein+secretion.">Stable cell lines expressing baculovirus P35: resistance to apoptosis and nutrient stress, and increased glycoprotein secretion.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Animal. 37 (5), 293-302 (2001).</li><li>Li, W. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+antagonist+proteins+of+influenza+and+vaccinia+viruses+are+suppressors+of+RNA+silencing.">Interferon antagonist proteins of influenza and vaccinia viruses are suppressors of RNA silencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (5), 1350-1355 (2004).</li><li>Kanost, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+biological+insights+from+a+draft+genome+sequence+of+the+tobacco+hornworm+moth,+Manduca+sexta.">Multifaceted biological insights from a draft genome sequence of the tobacco hornworm moth, Manduca sexta.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 76, 118-147 (2016).</li><li>Paixao, E. S., Teixeira, M. G., Rodrigues, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika,+chikungunya+and+dengue:+the+causes+and+threats+of+new+and+re-emerging+arboviral+diseases.">Zika, chikungunya and dengue: the causes and threats of new and re-emerging arboviral diseases.</a> BMJ Global Health. 3, (2018).</li></ol>

여기 우리는 VSV 복제 제한 lepidopteran 세포 배양에서 구출 하는 조건에 대 한 화면을 간단한 형광 및 발광 기반 분석 실험을 설명 했습니다. Lepidopteran 셀에 VSV의 조산 감염 VSV 유전자 발현에 대 한 시 금 때 우수한 신호 대 잡음 비율을 만듭니다. 예를 들어 단일 VSV 뤽 감염에서 lysates 감지 LU 신호 했다 ~ 1,000-fold 보다 높은 모의 감염 lysates 아직 이러한 신호만 72 h 시간 걸쳐 약 두 가지를 변경. VSV-루크?...

생산적으로 특정 호스트에 복제 하는 바이러스의 기능 바이러스 항목 및 복제1을 지 원하는 호스트 셀 요소의 가용성 부분에 적용 됩니다. 바이러스-호스트 범위 또한 카운터 세포 항 바이러스 방어 바이러스 성 복제2,3방해 그렇지 않으면 것을 바이러스의 용량에 의해 지시 될 수 있습니다. 그것은 궁극적으로 바이러스 특정 호스트에서의 라이프 사이클을 완료할 수 여부를 결정 하는 이러한 복잡 한 바이러스-호스트 상호 작용의 결과. 바이러스 성 복제 발생 하는 경우 호스트에 대 한 잠재적으로 병원 성 결과 감안할 때, 그것은 실패와 생산 사이의 균형 팁 수 있습니다 주요 바이러스-호스트 상호 작용에 대 한 우리의 이해를 심화 하기 위해 실험적인 전략을 개발 하는 중요 한 감염입니다. 바이러스-호스트 상호 작용의 분자 기능 elucidating 신규 및 대체 항 바이러스 치료 전략의 개발에 도움이 될 것입니다.
RNA 간섭 (RNAi)4,의 도래와 함께5 및 게놈 편집 도구 (예., CRISPR-Cas9, 아연 손가락 nucleases TALENs)6,7, 실험적으로 변경 가능한 되고있다는 게놈 넓은에 세포질 요인의 식을 확장 하 고 바이러스 복제에 이러한 변경의 영향. 실제로, 수많은 RNAi 및 편집-게놈 스크린 실시 되었습니다 바이러스-호스트 상호 작용8,,910, 의 새로운 측면을 발표 했다 무척 추 및 척추 호스트 셀 유형 11 , 12. 일반적으로 바이러스 기자, 반딧불 luciferase (루크) 또는 형광 성 단백질 등을 인코딩을 사용 하는이 화면 (예., GFP, DsRed), 양적 평가 판독으로 바이러스 성 유전자 발현의 편리한 수단을 제공 하는 바이러스 성 복제9,12에 대 한. 이 전략 중 홍보 또는 각각 증가 또는 감소에 의해 입증으로 바이러스 성 복제를 반대, 바이러스 성 기자 신호9,12호스트 요소를 식별 하는 연구를 수 있습니다. 그러나, 대부분의 경우에서 이러한 화면 실시 되어 있는 그들은 공부 되 고 있다 호스트 셀 형식에 잘 적응 하는 바이러스를 사용 하 여. 이 전략이 될 수 있지만 바이러스 성 병원 체 및 그들의 자연적인 호스트 간의 coevolutionary 관계를 이해 하기 위한 중요 한, 그것은 잠복 호스트 항 바이러스 요인에 그들의 사용에 관한 근본적인 문제를 제기지 않습니다. 이러한 경우 바이러스 기자에 있는 증진 최저는 되 찾고, RNAi 나 세포 요소는 일반적으로 바이러스 성 복제를 방해의 비활성화 신호. 첫째, 이면 바이러스가 이미 엄격 하 게 제어 조건 하에서 시험 되 고 호스트 셀에 복제할 수 화면 (즉, 배경 및 향상 된 바이러스 성 기자 신호 사이 구별 하는 기능)의 동적 범위 제한 될 수 있습니다. 둘째,이 문제는 바이러스는 주인 세포에 잘 적응 하 고 화면에 타겟이 되고있다 호스트 방어 통로 대항에서 효과적인 상황에 의해 더 합성 된다.
전통적인 바이러스-호스트 상호 작용 방법 심사에 관한 위의 우려로 인해 우리는 lepidopteran 곤충 세포에서 자연적으로 유산 arbovirus 감염을 악용 하는 바이러스-호스트 상호 작용을 공부에 대 한 새로운 패러다임을 개발 했다. 이 전략은 잘 공부 인간의 arbovirus, VSV, 집시 나 방 (L. dispar)13에서 파생 된 셀에 조산 감염을 겪 습 관측에서 파생 한다. VSV는 자연스럽 게 포유류 호스트, dipteran 곤충 (즉, 모래 파리)에 의해 전송 무척추동물의 넓은 범위를 감염 하기 위하여 실험적으로 표시 되었습니다 및 척추 호스트 모두에 셀 문화 그리고 vivo에서14. VSV의 11 kb 부정 감지 단일 가닥 RNA 게놈 각각 엔벌로프된 virion 구성 하는 단백질으로 번역 하는 5 개의 subgenomic mRNAs를 인코딩합니다. 그러나, VSV 역 유전자 시스템 인코딩 루크 또는 5 자연 VSV 유전자 제품15,,1617이외에 형광 단백질, 복제 유능한 긴장의 창조에 대 한 수 있다. 이 기자 단백질은 VSV virion에 통합 되지, 때문에 그들은 후 항목을 발생 하는 VSV 유전자 발현에 대 한 편리한 판독을 제공 합니다. VSV 긴장 GFP 또는 루크 인코딩을 사용 하 여, 우리는 이전 표시 VSV 유전자 발현은 LD652 셀의 항목에 따라 엄격 하 게 제한 VSV titers 72 시간 후 감염 (hpi)에 의해 증가 하지 않습니다. 반면, VSV와 포유류 poxvirus, vaccinia 바이러스 (VACV), LD652 세포의 coinfection VSV 유전자 발현에 titers 로그 증가이 시간 포인트 리드. VACV는 이른 유전자 발현, DNA 복제, 및 LD652 세포 감염에서 늦은 유전자 발현을 겪 습 하지만 VACV 복제 주기 때문에 불완전 한 virion morphogenesis18궁극적으로 실패. VACV의 큰 ~ 192 kb DNA 게놈 많은 호스트 면역 응답19의 억제를 통해 바이러스 성 복제를 촉진 immunomodulatory 속성을 표시 하는 > 200 단백질을 인코딩합니다. 따라서, 우리는 VSV 복제 VACV coinfection LD652 셀에서의 "구조"는 가능성이 VACV immunomodulators L. dispar 응답 VSV 복제를 제한 하는 일반적으로 저해 하 여 중재 하는 가설. 이 지원 호스트 RNA 중 합 효소 II 억제제 악티노마이신 D와 LD652 세포의 치료 또한 VSV 복제 LD652 세포에서 전사 종속 호스트 응답 VSV 복제 후 항목13블록 나타내는 구출.
위의 관찰 VSV 인코딩 기자 신호 (즉, 호스트를 억제 하는 그를 강화 하는 조건에 대 한 심사 때 자연스럽 게 제한적인 성격의 VSV 감염 LD652 셀 상대적으로 낮은 배경을 제공할 수 있습니다 제안 항 바이러스 방어)입니다. 여기, 우리는 조건 완화 VSV 제한 lepidopteran 세포에서 형광 또는 루크 기반 분석 화면을 사용 하기 위한 방법을 제공 합니다. 첫째, 우리는 VSV 제한 중 coinfection 실험 중 또는 후보 바이러스 성 요인의 소성 표현을 통해 휴식 virally 인코딩된 immunomodulatory 요소를 식별 하기 위해 이러한 분석 실험을 사용 하는 방법을 보여줍니다. 예를 들어, 우리는 어떻게 우리가 다른 poxvirus 요인13의 부재에 VSV 복제 구조 immunomodulatory 요인의 새로운 가족으로 poxvirus 인코딩된 A51R 단백질을 식별 하기 위해 이러한 심사 기법을 사용을 보여 줍니다. 둘째, 우리는 RNAi 제한적인 VSV LD652 세포 감염에서 심사를 사용 하 여 직접 arbovirus 제한13에 관련 된 진 핵 호스트 요소를 식별 하는 방법을 보여 줍니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plates</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well tissue culture plates</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm tissue culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>C430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grace&#8217;s Insect Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EX-CELL 420</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14420C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum - Optima</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S12450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1:1 mixture of Grace&#39;s Insect Medium and EX-Cell 420 Serum-Free Medium also containing 1 % antibiotic-antimycotic solution and 10 % Fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic Solution (100&#215;)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum Free Media (SFM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10902096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine arabinoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10362100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning cellgro DMSO (Dimethyl Sulfoxide)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25950CQC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reporter lysis buffer 5X</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E3971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase Assay Reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Microplates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-FLAG antibody</td>
			<td>Wako</td>
			<td>014-22383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-firefly luciferase antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab21176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-actin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-VSV M</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Dr. John Connor (Boston University)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-VACV I3L</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Dr. David Evans (University of Alberta)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well Chambered dish</td>
			<td>Lab-Tek II</td>
			<td>155409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell viability dye</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C12881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUOstar microplate reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td>FLUOstar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV10i-LIV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>v1.18</td>
			<td>cellSens software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5702 ventilated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22628102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Fc Infrared Imaging System</td>
			<td>Li-COR Biosciences</td>
			<td>Odyssey Fc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LD652 cells</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Dr. Basil Arif (Natural Resources Canada)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSC-40 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHK cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSC-1 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>in vitro transcription and purification kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM1626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

arbovirus infections as screening tools for the identification of viral immunomodulators and host antiviral factors

RNA 간섭-및 편집-기반 플랫폼을 심사 하는 게놈 바이러스 복제를 제한 하는 호스트 셀 요소를 식별 하기 위해 널리 사용 되어 왔습니다. 그러나, 이러한 스크린 자연스럽 게 연구 바이러스 성 병원 체를 허용 하는 셀에 일반적으로 지휘 된다. 따라서, 제어 조건에 있는 바이러스의 강력한 복제 이러한 스크린의 동적 범위를 제한할 수 있습니다. 또한,이 화면 수 있습니다 수 없습니다 쉽게 식별할 세포 방어 경로 바이러스가 호스트에 잘 적응 하 고 대항 항 바이러스 방어의 경우 바이러스 복제를 제한 하는. 이 문서에서는, 우리는 vesicular 구내 염 바이러스 (VSV) arboviruses에 의해 자연스럽 게 조산 감염에 바이러스-호스트 상호 작용 센터 화면 사용을 탐험에 대 한 새로운 패러다임을 설명 합니다. Dipteran 곤충과 포유류 호스트의 넓은 범위에서 복제 VSV의 능력에도 불구 하 고 VSV는 집시 나 방 (Lymantria dispar)와 같은 lepidopteran 곤충에서 파생 된 세포 라인의 다양 한 후 항목, 조산 감염을 겪 습. 그러나, 이러한 조산 VSV 감염 수 수 "구출" 호스트 세포 항 바이러스 방어 손상 된 경우. 우리가 어떻게 VSV 긴장 인코딩 편리한 리포터 유전자와 제한적인 L. dispar 설명 셀 라인 호스트 요소 arbovirus 제한에 관련 된 식별을 설정 화면에 쌍이 될 수 있습니다. 또한, 우리는 또한 coinfection 또는 포유류 바이러스에 의해 비롯 소성 표현을 통해 VSV 복제 구조 virally 인코딩된 요소의 식별 이러한 검사 도구 유틸리티를 보여줍니다. VSV 구조, 모니터를 단순한 발광 및 형광 기반 분석의 사용 활성화를 촉진 하는 조건에 대 한 심사 때 L. dispar 셀에 VSV 복제의 자연 제한 높은 신호 대 잡음 비율을 제공 VSV 복제의 변화입니다. 이러한 방법론은 호스트 항 바이러스 응답 바이러스 면역 회피 요인 사이 상호 작용을 이해 하는 데 중요 합니다.

라이브 셀 이미징 응용 프로그램을 모니터링 VSV 구조 VACV coinfection 시의 예를 들어, LD652 세포 했다 8 잘 연 발된 접시에 도금 고 다음 모의 감염 또는 VSV DsRed 감염 (나 = 1) VACV-플로리다-GFP의 유무에서 (나 = 25). VSV DsRed DsRed 무료 단백질으로 표현 하 고 구조 VSV 단백질 (그림 1A)에 융합 하지, 때문에 그것만 VSV 항목 및 유전자 식 시작 후 감지 됩니다. 모든 ...

Watch this Scientific Journal Video about Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors at JoVE.com

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

여기, 선물이 arbovirus 복제 및 arbovirus 복제를 제한 하는 2) 진 핵 호스트 요인 1) 바이러스 인코딩된 immunomodulators 식별 프로토콜. 이러한 형광 및 발광 기반 방법을 빠르게 낮은 신호 대 잡음 비율 단순한 분석에 arbovirus 복제의 양적 정보를 연구 수 있습니다.

Arbovirus 감염 바이러스 Immunomodulators 및 호스트 항 바이러스 요인의 식별을 위한 도구를 심사로

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

에 관련된 호스트 요인에 대한 RNAi 심사 우두</em사용하기> 바이러스 감염 Drosophila 전지

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

연구

면역학 및 감염병학

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

세균성 접착 연구에 전단 응력을 소개합니다

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

양극화 인간기도 액체 덮인 문화를 구축 호흡기 병원균에 대한 숙주 세포 응답을 공부하는 상피 Calu-3 전지<em&gt; 체외에서</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

호스트 세포 RN​​A의 합성에 바이러스 감염의 효과를 측정하는 클릭 화학을 사용하여

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening for Identification of Genes Involved in Nonhost Resistance

유전자의 식별을위한 VIGS - 중재 앞으로 유전학 검사는 Nonhost 저항에 참여


	Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

세대와의 멀티 표현형 높은 콘텐츠 상영<em&gt; Coxiella burnetii의</em&gt; 트랜스포존 돌연변이

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

초기 바이러스 성 항목 식별을위한 분석 실험 및 항 바이러스 화합물의 평가

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

의 탐지를위한 동결 건조 루프 - 매개 등온 증폭 시약의 개발<em&gt; Coxiella burnetii의</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

인간의 태반과 탈락 오르간 문화는 산모 - 태아 인터페이스에서 감염을 연구하는

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

에 참여 호스트 요인의 높은 처리량 검사에 대한 현미경 기반 분석 실험<em&gt; 브루셀라</em&gt; HeLa 세포의 감염

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...