Name: high resolution physical characterization of single metallic nanoparticles
Uploaded: 2019-06-28T11:00:00
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Wir sind dankbar für die finanzielle Unterstützung durch die European Molecular Biology Organization für ein Postdoktorandenstipendium (an J.E.) und ein Stipendium des NIH NHGRI (an J.J.K.). Wir schätzen die Hilfe der Professoren Jingyue Ju und Sergey Kalachikov (Columbia University) für die Bereitstellung heptamerischer HL und für inspirierende Diskussionen mit Professor Joseph Reiner (Virginia Commonwealth University).

Hinweis: Das folgende Protokoll ist spezifisch für das Electronic BioSciences (EBS) Nanopatch DC System. Es kann jedoch leicht an andere elektrophysiologische Apparate angepasst werden, die verwendet werden, um den Strom durch planare Lipid-Doppelschichtmembranen (Standard-Lipid-Doppelschichtmembrankammer, U-Rohr-Geometrie, gezogene Mikrokapillaren usw.)zu messen. Die Identifizierung kommerzieller Materialien und ihrer Quellen dient der Beschreibung der experimentellen Ergebnisse. In keinem Fal...

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	<li>Ettedgui, J., Kasianowicz, J. J., Balijepalli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+discrimination+of+heteropolytungstates+and+their+Isomers+in+solution+with+a+nanometer-scale+pore.">Single molecule discrimination of heteropolytungstates and their Isomers in solution with a nanometer-scale pore.</a> Journal of the American Chemical Society. 138 (23), 7228-7231 (2016).</li><li>Bezrukov, S., Kasianowicz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+noise+reveals+protonation+kinetics+and+number+of+ionizable+sites+in+an+open+protein+ion+channel.">Current noise reveals protonation kinetics and number of ionizable sites in an open protein ion channel.</a> Physical Review Letters. 70 (15), 2352-2355 (1993).</li><li>Kasianowicz, J. J., Bezrukov, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protonation+dynamics+of+the+alpha-toxin+ion+channel+from+spectral+analysis+of+pH-dependent+current+fluctuations.">Protonation dynamics of the alpha-toxin ion channel from spectral analysis of pH-dependent current fluctuations.</a> Biophysj. 69 (1), 94-105 (1995).</li><li>Please, T. R., Ayub, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-State+Nanopore.">Solid-State Nanopore.</a> Engineered Nanopores for Bioanalytical Applications. , 121-140 (2013).</li><li>Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-state+nanopores.">Solid-state nanopores.</a> Nature Nanotechnology. 2 (4), 209-215 (2007).</li><li>Kasianowicz, J. J., Brandin, E., Branton, D., Deamer, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+individual+polynucleotide+molecules+using+a+membrane+channel.">Characterization of individual polynucleotide molecules using a membrane channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (24), 13770-13773 (1996).</li><li>Akeson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsecond+time-scale+discrimination+among+polycytidylic+acid,+polyadenylic+acid,+and+polyuridylic+acid+as+homopolymers+or+as+segments+within+single+RNA+molecules.">Microsecond time-scale discrimination among polycytidylic acid, polyadenylic acid, and polyuridylic acid as homopolymers or as segments within single RNA molecules.</a> Biophysical Journal. 77 (6), 3227-3233 (1999).</li><li>Singer, A., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopore-based+Sensing+of+Individual+Nucleic+Acid+Complexes.">Nanopore-based Sensing of Individual Nucleic Acid Complexes.</a> Israel Journal of Chemistry. 49 (3-4), 323-331 (2010).</li><li>Jin, Q., Fleming, A. M., Burrows, C. J., White, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unzipping+kinetics+of+duplex+DNA+containing+oxidized+lesions+in+an+&#945;-hemolysin+nanopore.">Unzipping kinetics of duplex DNA containing oxidized lesions in an &#945;-hemolysin nanopore.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (26), 11006-11011 (2012).</li><li>Halverson, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anthrax+biosensor,+protective+antigen+ion+channel+asymmetric+blockade.">Anthrax biosensor, protective antigen ion channel asymmetric blockade.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (40), 34056-34062 (2005).</li><li>Oukhaled, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unfolding+of+proteins+and+long+transient+conformations+detected+by+single+nanopore+recording.">Unfolding of proteins and long transient conformations detected by single nanopore recording.</a> Physical Review Letters. 98 (15), 158101 (2007).</li><li>Reiner, J. E., Kasianowicz, J. J., Nablo, B. J., Robertson, J. W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory+for+polymer+analysis+using+nanopore-based+single-molecule+mass+spectrometry.">Theory for polymer analysis using nanopore-based single-molecule mass spectrometry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12080-12085 (2010).</li><li>Robertson, J. W. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+mass+spectrometry+in+solution+using+a+solitary+nanopore.">Single-molecule mass spectrometry in solution using a solitary nanopore.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (20), 8207-8211 (2007).</li><li>Baaken, G., Ankri, N., Schuler, A. -. K., R&#252;he, J., Behrends, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopore-based+single-molecule+mass+spectrometry+on+a+lipid+membrane+microarray.">Nanopore-based single-molecule mass spectrometry on a lipid membrane microarray.</a> ACS Nano. 5 (10), 8080-8088 (2011).</li><li>Angevine, C. E., Chavis, A. E., Kothalawala, N., Dass, A., Reiner, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+single+molecule+mass+spectrometry+via+charged+metallic+clusters.">Enhanced single molecule mass spectrometry via charged metallic clusters.</a> Analytical Chemistry. 86 (22), 11077-11085 (2014).</li><li>Astier, Y., Uzun, O., Stellacci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+study+of+single+gold+nanoparticle/alpha-Hemolysin+complex+formation:+a+nanotool+to+slow+down+ssDNA+through+the+alpha-Hemolysin+nanopore.">Electrophysiological study of single gold nanoparticle/alpha-Hemolysin complex formation: a nanotool to slow down ssDNA through the alpha-Hemolysin nanopore.</a> Small. 5 (11), 1273-1278 (2009).</li><li>Chavis, A. E., Brady, K. T., Kothalawala, N., Reiner, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage+and+blockade+state+optimization+of+cluster-enhanced+nanopore+spectrometry.">Voltage and blockade state optimization of cluster-enhanced nanopore spectrometry.</a> Analyst. 140 (22), 7718-7725 (2015).</li><li>Campos, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensing+single+mixed-monolayer+protected+gold+nanoparticles+by+the+&#945;-hemolysin+nanopore.">Sensing single mixed-monolayer protected gold nanoparticles by the &#945;-hemolysin nanopore.</a> Analytical Chemistry. 85 (21), 10149-10158 (2013).</li><li>Campos, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Lys147+in+the+interaction+between+MPSA-gold+nanoparticles+and+the+&#945;-hemolysin+nanopore.">The role of Lys147 in the interaction between MPSA-gold nanoparticles and the &#945;-hemolysin nanopore.</a> Langmuir. 28 (44), 15643-15650 (2012).</li><li>Baaken, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Resolution+Size-Discrimination+of+Single+Nonionic+Synthetic+Polymers+with+a+Highly+Charged+Biological+Nanopore.">High-Resolution Size-Discrimination of Single Nonionic Synthetic Polymers with a Highly Charged Biological Nanopore.</a> ACS Nano. 9 (6), 6443-6449 (2015).</li><li>Berzelius, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beitrag+zur+n&#228;heren+Kenntniss+des+Molybd&#228;ns.">Beitrag zur n&#228;heren Kenntniss des Molybd&#228;ns.</a> Annalen Der Physik. 82 (1), 369-392 (1826).</li><li>Long, D. -. L., Burkholder, E., Cronin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyoxometalate+clusters,+nanostructures+and+materials:+from+self+assembly+to+designer+materials+and+devices.">Polyoxometalate clusters, nanostructures and materials: from self assembly to designer materials and devices.</a> Chemical Society Reviews. 36 (1), 105-121 (2007).</li><li>Muller, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyoxovanadates:+High-nuclearity+spin+clusters+with+interesting+host-guest+systems+and+different+electron+populations.+Synthesis,+spin+organization,+magnetochemistry,+and+spectroscopic+studies.">Polyoxovanadates: High-nuclearity spin clusters with interesting host-guest systems and different electron populations. Synthesis, spin organization, magnetochemistry, and spectroscopic studies.</a> Inorganic Chemistry. 36 (23), 5239-5250 (1997).</li><li>Rausch, B., Symes, M. D., Chisholm, G., Cronin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoupled+catalytic+hydrogen+evolution+from+a+molecular+metal+oxide+redox+mediator+in+water+splitting.">Decoupled catalytic hydrogen evolution from a molecular metal oxide redox mediator in water splitting.</a> Science. 345 (6202), 1326-1330 (2014).</li><li>Dolbecq, A., Dumas, E., Mayer, C. R., Mialane, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+organic-inorganic+polyoxometalate+compounds:+from+structural+diversity+to+applications.">Hybrid organic-inorganic polyoxometalate compounds: from structural diversity to applications.</a> Chemical Reviews. 110 (10), 6009-6048 (2010).</li><li>Busche, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+fabrication+of+memory+devices+based+on+nanoscale+polyoxometalate+clusters.">Design and fabrication of memory devices based on nanoscale polyoxometalate clusters.</a> Nature. 515 (7528), 545-549 (2014).</li><li>Pope, M., M&#252;ller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Polyoxometalates: From Platonic Solids to Anti-Retroviral Activity. 10, (2012).</li><li>Rhule, J. T., Hill, C. L., Judd, D. A., Schinazi, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyoxometalates+in+medicine.">Polyoxometalates in medicine.</a> Chemical Reviews. 98 (1), 327-358 (1998).</li><li>Gao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transition-metal-substituted+polyoxometalate+derivatives+as+functional+anti-amyloid+agents+for+Alzheimer's+disease.">Transition-metal-substituted polyoxometalate derivatives as functional anti-amyloid agents for Alzheimer's disease.</a> Nature Communications. 5, 3422 (2014).</li><li>Pope, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Heteropoly and Isopoly Oxometalates. 8, (1983).</li><li>Braha, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designed+protein+pores+as+components+for+biosensors.">Designed protein pores as components for biosensors.</a> Chemistry &amp; Biology. 4 (7), 497-505 (1997).</li><li>Forstater, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOSAIC:+A+modular+single-molecule+analysis+interface+for+decoding+multistate+nanopore+data.">MOSAIC: A modular single-molecule analysis interface for decoding multistate nanopore data.</a> Analytical Chemistry. 88 (23), 11900-11907 (2016).</li><li>Balijepalli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+Short-Lived+Events+in+Multistate+Ionic+Current+Measurements.">Quantifying Short-Lived Events in Multistate Ionic Current Measurements.</a> ACS Nano. 8, 1547-1553 (2014).</li><li>Misakian, M. M., Kasianowicz, J. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrostatic+influence+on+ion+transport+through+the+alphaHL+channel.">Electrostatic influence on ion transport through the alphaHL channel.</a> Journal of Membrane Biology. 195 (3), 137-146 (2003).</li><li>Piguet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+single+amino+acid+differences+in+uniformly+charged+homopolymeric+peptides+with+aerolysin+nanopore.">Identification of single amino acid differences in uniformly charged homopolymeric peptides with aerolysin nanopore.</a> Nature Communication. 9 (966), (2018).</li></ol>

Aufgrund ihrer anionischen Ladung werden POMs wahrscheinlich durch elektrostatische Wechselwirkungen mit organischen Gegenkationen assoziiert. Daher ist es wichtig, die richtigen Lösungsbedingungen und die richtigen Elektrolytumgebungen (insbesondere Kationen in Lösung) zu identifizieren, um komplexe Bildungen mit POMs zu vermeiden. Besondere Sorgfalt ist bei der Pufferwahl erforderlich. Beispielsweise ist die Erfassungsrate von POMs mit Tris(Hydroxymethyl)Aminomethan und Zitronensäure-gepufferten Lösungen deutlich n...

Die Detektion biomolekularer Analyten auf einzelmolekülebene kann durch Nanoporen und Messung von Ionenstrommodulationen durchgeführt werden. Typischerweise werden Nanoporen aufgrund ihrer Herstellung in zwei Kategorien eingeteilt: biologisch (selbstzusammengesetzt aus Protein oder DNA-Origami)1,2,3, oder Festkörper (z.B.hergestellt mit Halbleiterverarbeitungswerkzeuge)4,5. Während Festkörper-Nanoporen als potenziell physikalisch robuster und über eine Vielzahl von Lösungsbedingungen verwendet werden können, bieten Protein-Nanoporen bisher eine höhere Empfindlichkeit, eine höhere Resistenz gegen Fouling, eine größere Bandbreite, eine bessere chemische Selektivität und ein größeres Signal-Rausch-Verhältnis.
Eine Vielzahl von Proteinionenkanälen, wie z. B. der von Staphylococcus aureus (Hämolysin (HL) gebildete, kann verwendet werden, um einzelne Moleküle zu detektieren, einschließlich Ionen (z.B., H+ und D+)2,3, Polynukleotide (DNA und RNA)6,7,8, geschädigte DNA9, Polypeptide10, Proteine (gefaltet und entfaltet)11, Polymere (Polyethylenglykol und andere)12,13 , 14, gold nanoparticles15,16,17,18,19, und andere synthetische Moleküle20.
Kürzlich haben wir gezeigt, dass die 'HL-Nanopore auch metallische Cluster, Polyoxometalate (POMs), auf der Ebene einzelner Moleküle leicht erkennen und charakterisieren kann. POMs sind diskrete nanoskalige anionische Metallsauerstoff-Cluster, die 182621entdeckt wurden, und seitdem wurden viele weitere Typen synthetisiert. Die verschiedenen Größen, Strukturen und elementaren Zusammensetzungen von Polyoxometallen, die jetzt verfügbar sind, führten zu einer Vielzahl von Eigenschaften und Anwendungen, einschließlich Chemie22,23, Katalyse24, Materialwissenschaft25 ,26, und biomedizinische Forschung27,28,29.
Die POM-Synthese ist ein Selbstmontageverfahren, das typischerweise in Wasser durch Mischen der stoichiometrisch erforderlichen Mengen monomerer Metallsalze durchgeführt wird. Einmal gebildet, zeigen POMs eine große Vielfalt an Größen und Formen. Zum Beispiel besteht die Keggin Polyanion Struktur, XM12O40q- aus einem Heteroatom (X) umgeben von vier Sauerstoffn, um ein Tetraeder zu bilden (q ist die Ladung). Das Heteroatom befindet sich zentral in einem Käfig, der durch 12 oktaeder MO 6-Einheiten gebildet wird (wobei M = Übergangsmetalle in ihrem hohen Oxidationszustand), die durch benachbarte gemeinsame Sauerstoffatome miteinander verbunden sind. Während die Struktur von Wolframpolyoxometallaten unter sauren Bedingungen stabil ist, führen Hydroxidionen zur hydrolytischen Spaltung von Metall-Sauerstoff-Bindungen (M-O)30. Dieser komplexe Prozess führt zum Verlust einer oder mehrerer MO6 Oktaeder-Untereinheiten, was zur Bildung von monovacantn und trivacant Arten und schließlich zur vollständigen Zersetzung der POMs führt. Unsere Diskussion wird sich hier auf die partiellen Zersetzungsprodukte von 12-Phosphotungssigsäure bei pH 5,5 und 7,5 beschränken.
Ziel dieses Protokolls ist es, diskrete Metallsauerstoffcluster an der Grenze zu einzelnen Molekülen mithilfe einer biologischen nanoporenbasierten elektronischen Plattform zu erkennen. Diese Methode ermöglicht die Detektion von metallischen Clustern in Lösung. Mehrere Arten in Lösung können mit einer größeren Empfindlichkeit als herkömmliche Analysemethoden diskriminiert werden33. Damit können feine Unterschiede in der POM-Struktur aufgeklärt werden und bei Konzentrationen deutlich niedriger als bei der NMR-Spektroskopie. Wichtig ist, dass dieser Ansatz sogar die Diskriminierung von isomerischen Formen von Na8HPW9O341ermöglicht.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nanopatch DC System</td>
			<td>Electronic Biosciences, Inc., EBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore LC-PAK</td>
			<td>Millipore vacuum filter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-Diphytanoyl-sn- Glycero-3-Phosphocholine (DPhPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL</td>
			<td>850356P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decane, ReagentPlus, &#8805;99%,</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;HL</td>
			<td>List Biological Laboratories, Campbell, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ag wire</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mm Ag/AgCl disk electrode</td>
			<td>In Vivo Metric</td>
			<td>E202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-impedance amplifier system</td>
			<td>Electronic Biosciences, San Diego, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>quartz capillaries</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>custom polycarbonate test cell</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Processing and Analysis MOSAIC</td>
			<td>https://pages.nist.gov/mosaic/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphotungstic acid hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>455970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71507</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high resolution physical characterization of single metallic nanoparticles

Einzelne Moleküle können erkannt und charakterisiert werden, indem sie den Grad messen, durch den sie den ionenförmigen Strom reduzieren, der durch eine einzelne Nanometer-Pore fließt. Das Signal ist charakteristisch für die physikalisch-chemischen Eigenschaften des Moleküls und seine Wechselwirkungen mit der Pore. Wir zeigen, dass die durch das bakterielle Protein-Exotoxin Staphylococcus aureus alpha hämolysin (HL) gebildete Nanopore Polyoxometalate (POMs, anionische Metallsauerstoffcluster) an der Grenze zu einzelnen Molekülen nachweisen kann. Darüber hinaus werden mehrfache Abbauprodukte von 12-Phosphotungstic Acid POM (PTA, H3PW12O40) in Lösung gleichzeitig gemessen. Die Einzelmolekülempfindlichkeit der Nanoporenmethode ermöglicht es, POMs in deutlich niedrigeren Konzentrationen als für die Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) zu kennzeichnen. Diese Technik könnte als neues Werkzeug für Chemiker dienen, um die molekularen Eigenschaften von Polyoxometalaten oder anderen metallischen Clustern zu untersuchen, um pom synthetische Prozesse besser zu verstehen und möglicherweise ihre Ausbeute zu verbessern. Hypothetisch könnte mit dieser Methode die Position eines bestimmten Atoms oder die Rotation eines Fragments im Molekül und der Metalloxidationszustand untersucht werden. Darüber hinaus hat diese neue Technik den Vorteil, dass die Echtzeitüberwachung von Molekülen in Lösung ermöglicht wird.

In den letzten zwei Jahrzehnten wurden membrangebundene Protein-Nanometer-Poren als vielseitige Einzelmolekülsensoren nachgewiesen. Nanoporenbasierte Messungen sind relativ einfach durchzuführen.  Zwei mit Elektrolytlösung gefüllte Kammern sind durch eine Nanopore getrennt, die in eine elektrisch isolierende Lipidmembran eingebettet ist. Entweder ein Patch-Clamp-Verstärker oder ein externes Netzteil bietet über Ag/AgCl-Elektroden, die in die Elektrolytspeicher eingetaucht ...

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High Resolution Physical Characterization of Single Metallic Nanoparticles

Hier stellen wir ein Protokoll zur Detektion diskreter Metallsauerstoffcluster, Polyoxometallate (POMs) an der Grenze zu einzelnen Molekülen, mithilfe einer biologischen Nanoporen-basierten elektronischen Plattform vor. Die Methode bietet einen komplementären Ansatz zu traditionellen analytischen Chemiewerkzeugen, die bei der Untersuchung dieser Moleküle verwendet werden.

Physikalische Charakterisierung einzelner metallischer Nanopartikel in hoher Auflösung

Individual molecules can be detected and characterized by measuring the degree by which they reduce the ionic current flowing through a single ...

Diese nanoporbasierte Detektionsmethode hat das Potenzial gezeigt, einzelne Moleküle physikalisch zu charakterisieren und zu identifizieren. Die Arbeit mit Metallo-Nanopartikeln, die der Zweck dieses Videos ist, stellt unser Verständnis dessen in Frage, was die Genauigkeit und Präzision der Messung einschränkt. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass dieses Gerät eine größere Bandbreite als herkömmliche Lipid-Bilayer-Speicher-Setup hat, die uns schnellere Ergebnisse und mehr Reaktionen in Nanoporen sehen lässt.Diese Technik wurde ermöglicht, weil Anfang der 1990er Jahre gezeigt wurde, dass Das Gating in Protein-Nanoporen, d.h. das Wechseln zwischen verschiedenen Zuständen, gesteuert werden kann und Moleküle an die Porenwand binden können. Diese Technik wird für kommerzielle DNA-Sequenzierungsanwendungen entwickelt, da sie minimale Proben verwendet. Es erfordert keine fluoreszierenden Etiketten und verwendet viel längere Leselängen als herkömmliche Methoden.Diese Technik wurde auch entwickelt, um Polymere basierend auf ihrer Größe mit größerer Genauigkeit und Geschwindigkeit als Gelelektrophorese und Chromatographie zu unterscheiden. Bereiten Sie zunächst 500 Milliliter einer Lösung aus einmolarem Natriumchlorid und 10-Millimolar-Mononatriumphosphat in Reinstwasser als Elektrolyt vor. Es ist am besten, frische Lösungen und Proben mit diesem speziellen Setup zu verwenden.Darüber hinaus stellten wir fest, dass hochwertiges entionisiertes Wasser sehr wichtig ist, um erfolgreich Membranen zu bilden. Als nächstes kombinieren Sie ein Milligramm lyophilisiertes Monomeric-S.aureus-Alpha-Hämolysinpulver mit einem Milliliter Reinstwasser. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Staph aureus alpha Hämolysin-Toxin-Protein gefährlich sein kann.Befolgen Sie bei diesem Verfahren die Vorsichtsmaßnahmen im MsDS. Als nächstes bereiten Sie vier Milliliter von fünf Milligramm pro Milliliter DPhyPC in Endecain in einer Glasszintillationsdurchstechflasche vor. Die Durchstechflasche mit einer mit Polytetrafluorethylen gefütterten Kappe kappen und bis zu einem Monat bei vier Grad Celsius lagern.Danach 57,6 Milligramm 12-Phosphotungssäurehydrat in 10 Milliliter des Elektrolyten auflösen, um eine zweimillimolarle Polyoxometalat-Lösung zu bilden. Teilen Sie die POM-Lösung in zwei Fünf-Milliliter-Portionen auf. Verwenden Sie dreimolares Natriumhydroxid, um den pH-Wert einer POM-Lösung auf 5,5 einzustellen.Um mit der Vorbereitung auf den Test zu beginnen, montieren Sie die Testzelle eines planaren Lipid-Bilayer-Elektrophysiologiegeräts. Zuerst einen Silberdraht mit 600-Grit-Schleifpapier abschleifen und in handelsübliche Natriumhypochlorit-basierte Bleichmittel für 10 Minuten einweichen, um die Silber-Silber-Chlorid-Drahtelektrode herzustellen. Spülen und trocknen Sie die Drahtelektrode, bevor Sie sie in die Quarzkapillare des Geräts einsetzen.Bewahren Sie die Elektrode in der Quarz-Nanopore-Membran (QNM) auf und trennen Sie die Kapillare und das Reservoir. Dann legen Sie eine zylindrische Silber-Silber-Chlorid-Pellet-Elektrode auf einem Silberdraht im Reservoir montiert. Schließen Sie beide Elektroden an die Verstärkerplatine an.Öffnen Sie anschließend das Datenerfassungsprogramm und starten Sie das Netzteil bei null Millivolt. Vergewissern Sie sich, dass zwischen den Elektroden in der leeren Zelle kein Gleichstrom erkannt wird. Während dieser Demonstration ist es wichtig zu beobachten, wie sich der transkapillare Druck auf die Membranbildung und die anschließende Nanoporenbildung auswirken kann.Ohne diese beiden Schritte richtig zu machen, werden die Experimente nicht funktionieren. Laden Sie etwa einen Milliliter Elektrolyt in eine Spritze und schließen Sie sie an die mit dem Reservoir angeschlossene Flüssigkeitsleitung an. Fügen Sie Elektrolyt in das Reservoir, bis die Fläche des QNM untergetaucht ist, wie durch den Ionenstrom zwischen den Elektroden, die den Verstärker sätten, angezeigt wird.Wenn der Verstärker nicht sättigt, entstopft das QNM, indem sie eine Popspannung von plus oder minus einem Volt anbringen oder den Kapillardruck um etwa 300 Millimeter Quecksilber erhöhen. Verwenden Sie bei Bedarf beide Techniken. Sobald der Verstärker gesättigt ist, ziehen Sie Elektrolyt aus dem Reservoir, bis die Lösungspegel unter das QNM fallen, wie durch den Strom angegeben, der auf Null zurückkehrt.Um den Lipid-Bilayer-Bildungsprozess zu beginnen, heben Sie den Elektrolytlösungspegel weit über das Gesicht des QNM und beachten Sie, wie viel Lösung das benötigte. Dann tauchen Sie eine 10-Mikroliter-Pipettenspitze in die DPHyPC-Lösung und ziehen Sie alle sichtbaren Lipide in die Spitze. Berühren Sie die Spitze der Pipette an die Oberfläche der Elektrolytlösung und lassen Sie das Lipid von der Pipette über die Luft-Wasser-Schnittstelle fließen.Warten Sie zwei bis fünf Minuten, bis sich das Lipid gleichmäßig über die Lösung ausbreitet. Als nächstes ziehen Sie den Elektrolyten langsam zurück, bis sich die Oberfläche der Lösung unterhalb des QNM befindet, und fügen Sie dann langsam genug Elektrolyt hinzu, um die Lösung über dem QNM zu erhöhen, um die isolierende Lipid-Bilayer-Membran zu bilden. Wenn sich die Bilayerin nach drei Versuchen nicht bildet, wenden Sie einen anderen Teil des Lipids wie zuvor beschrieben an und wiederholen Sie den Vorgang.Sobald sich der Zweischichter gebildet zu haben scheint, erhöhen Sie den Druck auf die Kapillare, den Doppelton zu knallen und ihn dann zu reformieren, indem Sie das Lösungsniveau langsam senken und auf die gleiche Weise wie zuvor erhöhen. Wiederholen Sie diesen Vorgang mehrmals, um sicherzustellen, dass das QNM nicht verstopft ist und sich eine Bilayergebildethatgebildet hat. Als nächstes tauen Sie ein Aliquot von Alpha-Hämolysin-Protein auf Eis oder bei Raumtemperatur auf.Füllen Sie das Reservoir mit 250 Nanogramm monomerem Alpha-Hämolysin-Protein und etwa 250 Mikroliter Reinstwasser. Wenden Sie dann eine 200 bis 400 Millivolt Bias an, um die Porenbildung zu induzieren. Um die Porenbildung zu erleichtern, erhöhen Sie den Kapillardruck um 40 bis 200 Millimeter Quecksilber, um die Doppelschicht aus dem QNM zu erweitern.Sobald sich eine Nanopore bildet, reduzieren Sie die angewendete Verzerrung auf die Messspannung und reduzieren Sie den Druck auf etwa die Hälfte des Einführdrucks. Um mit dem Test zu beginnen, richten Sie die DC-Offsetspannung neu, um sicherzustellen, dass kein gemessener Strom vorhanden ist, wenn das angewendete Potential auf Null gesetzt ist. Als nächstes erhalten Sie eine ionenische Stromspur für ein angewendetes Potential von 120 bis negative 120 Millivolt relativ zum Reservoir.Bestätigen Sie, dass es keine Verunreinigungen gibt, die durch spontane Stromblockaden angezeigt werden. Fügen Sie dem Reservoir einen bis sechs Mikroliter pH 5,5-POM-Clusterlösung mit zwei Millimolaren hinzu. Wenden Sie ionische Stromreihenmessungen bei einer angelegten Spannung von negativen 120 Millivolt an.Die Bewegung einzelner anionischer Phosphotungssäuremoleküle durch den Alpha-Hämolysinkanal erzeugte transiente Blockaden, die den mittleren offenporischen Ionenstrom um etwa 80% verringerten Der Dauer- und Blockadestrom stehen in direktem Zusammenhang mit der Partikel-Poren-Wechselwirkung, so dass ionische Arten in Histogrammen der relativen Blockadetiefenverhältnisse unterschieden werden können. Bei pH 5,5 wurden zwei Spitzen mit Tiefenverhältnissen von etwa 0,06 und 0,16 beobachtet. Basierend auf Phosphor NMR, der kleine Höhepunkt war die sechs-Minus-Phosphowolframat-Arten und der hauptgipfel war die Sieben-Minus-Arten.Bei pH 7,5 verlagerten sich die relativen Konzentrationen auf ein höheres Verhältnis der 6-Minus-Arten zu den Sieben-Minus-Arten. Der 20-fache Rückgang der Blockadeereignisse im Vergleich zu pH 5,5 wurde auf den Abbau freier Phosphat- und Wolframationen zurückgeführt. Die Anpassung der Verweilzeitverteilungen erforderte mehrere exponentielle Funktionen, die mehrere Arten von Partikel-Pore-Wechselwirkungen innerhalb jeder ionischen Spezies anzeigten.Die kürzeren Verweilzeiten bei pH 7,5 deuteten auf schwächere Partikel-Pore-Wechselwirkungen als pH 5,5 hin, die mit früheren Studien übereinstimmen, die pH-abhängige Veränderungen in der relativen Anzahl der fixen Ladungen in oder in der Nähe des Alpha-Hämolysinkanallumens zeigen. Hochreines deionisiertes Wasser ist für diese spezielle Einrichtung von entscheidender Bedeutung. Eine verbrauchte Bio-Filterpatrone war die wahrscheinliche Ursache dafür, dass unser Labor monatelang keine Membranen auf den QNMs bilden konnte.Personen, die neu in dieser speziellen Version der Methode könnte auch kämpfen, weil die Membranen so klein sind und es einen Trick gibt, Nanoporen zu bilden. Diese Methode, die vor mehreren Jahrzehnten ins Leben gerufen wurde, hat sich für die Analyse von Ionen, Nukleinsäuren und synthetischen Polymeren sowie für die DNA-Sequenzierung als nützlich erwiesen. Es könnte auch Anwendungen in der Biophysik und grundlegenden Zellbiologie finden.Beispielsweise kann dieses Verfahren verwendet werden, um die physikalischen Eigenschaften von synthetischen Polymeren und Biopolymeren zu untersuchen, um ihre Größe, Wechselwirkungen mit anderen Molekülen und andere wichtige Fragen zu untersuchen.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Untargeted Metabolomics aus biologischen Quellen Mit UltraPerformance Flüssigkeits-Chromatographie-hochauflösender Massenspektrometrie (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

Forschung

Chemie

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