Name: high resolution physical characterization of single metallic nanoparticles
Uploaded: 2019-06-28T11:00:00
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Siamo grati per il sostegno finanziario dell'Organizzazione europea di biologia molecolare per una borsa di studio post-dottorato (a J.E.) e una sovvenzione del NIH NHGRI (a J.J.K.). Apprezziamo l'aiuto dei professori Jingyue Ju e Sergey Kalachikov (Columbia University) per aver fornito eptameric SRl, e per aver ispirato le discussioni con il professor Joseph Reiner (Virginia Commonwealth University).

Nota:<</c0> Il protocollo riportato di seguito è specifico per il sistema Nanopatch DC di Electronic BioSciences (EBS). Tuttavia, può essere facilmente adattato ad altri apparecchi di elettrofisiologia utilizzati per misurare la corrente attraverso le membrane pianologiche planari (camera standard del bistrato lipidico, geometria U-tube, microcapillari tirati, ecc.). L'identificazione dei materiali commerciali e delle loro fonti è data per descrivere i risultati sperimentali. In nessun caso questa id...

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	<li>Ettedgui, J., Kasianowicz, J. J., Balijepalli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+discrimination+of+heteropolytungstates+and+their+Isomers+in+solution+with+a+nanometer-scale+pore.">Single molecule discrimination of heteropolytungstates and their Isomers in solution with a nanometer-scale pore.</a> Journal of the American Chemical Society. 138 (23), 7228-7231 (2016).</li><li>Bezrukov, S., Kasianowicz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+noise+reveals+protonation+kinetics+and+number+of+ionizable+sites+in+an+open+protein+ion+channel.">Current noise reveals protonation kinetics and number of ionizable sites in an open protein ion channel.</a> Physical Review Letters. 70 (15), 2352-2355 (1993).</li><li>Kasianowicz, J. J., Bezrukov, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protonation+dynamics+of+the+alpha-toxin+ion+channel+from+spectral+analysis+of+pH-dependent+current+fluctuations.">Protonation dynamics of the alpha-toxin ion channel from spectral analysis of pH-dependent current fluctuations.</a> Biophysj. 69 (1), 94-105 (1995).</li><li>Please, T. R., Ayub, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-State+Nanopore.">Solid-State Nanopore.</a> Engineered Nanopores for Bioanalytical Applications. , 121-140 (2013).</li><li>Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-state+nanopores.">Solid-state nanopores.</a> Nature Nanotechnology. 2 (4), 209-215 (2007).</li><li>Kasianowicz, J. J., Brandin, E., Branton, D., Deamer, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+individual+polynucleotide+molecules+using+a+membrane+channel.">Characterization of individual polynucleotide molecules using a membrane channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (24), 13770-13773 (1996).</li><li>Akeson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsecond+time-scale+discrimination+among+polycytidylic+acid,+polyadenylic+acid,+and+polyuridylic+acid+as+homopolymers+or+as+segments+within+single+RNA+molecules.">Microsecond time-scale discrimination among polycytidylic acid, polyadenylic acid, and polyuridylic acid as homopolymers or as segments within single RNA molecules.</a> Biophysical Journal. 77 (6), 3227-3233 (1999).</li><li>Singer, A., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopore-based+Sensing+of+Individual+Nucleic+Acid+Complexes.">Nanopore-based Sensing of Individual Nucleic Acid Complexes.</a> Israel Journal of Chemistry. 49 (3-4), 323-331 (2010).</li><li>Jin, Q., Fleming, A. M., Burrows, C. J., White, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unzipping+kinetics+of+duplex+DNA+containing+oxidized+lesions+in+an+&#945;-hemolysin+nanopore.">Unzipping kinetics of duplex DNA containing oxidized lesions in an &#945;-hemolysin nanopore.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (26), 11006-11011 (2012).</li><li>Halverson, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anthrax+biosensor,+protective+antigen+ion+channel+asymmetric+blockade.">Anthrax biosensor, protective antigen ion channel asymmetric blockade.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (40), 34056-34062 (2005).</li><li>Oukhaled, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unfolding+of+proteins+and+long+transient+conformations+detected+by+single+nanopore+recording.">Unfolding of proteins and long transient conformations detected by single nanopore recording.</a> Physical Review Letters. 98 (15), 158101 (2007).</li><li>Reiner, J. E., Kasianowicz, J. J., Nablo, B. J., Robertson, J. W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory+for+polymer+analysis+using+nanopore-based+single-molecule+mass+spectrometry.">Theory for polymer analysis using nanopore-based single-molecule mass spectrometry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12080-12085 (2010).</li><li>Robertson, J. W. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+mass+spectrometry+in+solution+using+a+solitary+nanopore.">Single-molecule mass spectrometry in solution using a solitary nanopore.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (20), 8207-8211 (2007).</li><li>Baaken, G., Ankri, N., Schuler, A. -. K., R&#252;he, J., Behrends, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopore-based+single-molecule+mass+spectrometry+on+a+lipid+membrane+microarray.">Nanopore-based single-molecule mass spectrometry on a lipid membrane microarray.</a> ACS Nano. 5 (10), 8080-8088 (2011).</li><li>Angevine, C. E., Chavis, A. E., Kothalawala, N., Dass, A., Reiner, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+single+molecule+mass+spectrometry+via+charged+metallic+clusters.">Enhanced single molecule mass spectrometry via charged metallic clusters.</a> Analytical Chemistry. 86 (22), 11077-11085 (2014).</li><li>Astier, Y., Uzun, O., Stellacci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+study+of+single+gold+nanoparticle/alpha-Hemolysin+complex+formation:+a+nanotool+to+slow+down+ssDNA+through+the+alpha-Hemolysin+nanopore.">Electrophysiological study of single gold nanoparticle/alpha-Hemolysin complex formation: a nanotool to slow down ssDNA through the alpha-Hemolysin nanopore.</a> Small. 5 (11), 1273-1278 (2009).</li><li>Chavis, A. E., Brady, K. T., Kothalawala, N., Reiner, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage+and+blockade+state+optimization+of+cluster-enhanced+nanopore+spectrometry.">Voltage and blockade state optimization of cluster-enhanced nanopore spectrometry.</a> Analyst. 140 (22), 7718-7725 (2015).</li><li>Campos, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensing+single+mixed-monolayer+protected+gold+nanoparticles+by+the+&#945;-hemolysin+nanopore.">Sensing single mixed-monolayer protected gold nanoparticles by the &#945;-hemolysin nanopore.</a> Analytical Chemistry. 85 (21), 10149-10158 (2013).</li><li>Campos, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Lys147+in+the+interaction+between+MPSA-gold+nanoparticles+and+the+&#945;-hemolysin+nanopore.">The role of Lys147 in the interaction between MPSA-gold nanoparticles and the &#945;-hemolysin nanopore.</a> Langmuir. 28 (44), 15643-15650 (2012).</li><li>Baaken, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Resolution+Size-Discrimination+of+Single+Nonionic+Synthetic+Polymers+with+a+Highly+Charged+Biological+Nanopore.">High-Resolution Size-Discrimination of Single Nonionic Synthetic Polymers with a Highly Charged Biological Nanopore.</a> ACS Nano. 9 (6), 6443-6449 (2015).</li><li>Berzelius, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beitrag+zur+n&#228;heren+Kenntniss+des+Molybd&#228;ns.">Beitrag zur n&#228;heren Kenntniss des Molybd&#228;ns.</a> Annalen Der Physik. 82 (1), 369-392 (1826).</li><li>Long, D. -. L., Burkholder, E., Cronin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyoxometalate+clusters,+nanostructures+and+materials:+from+self+assembly+to+designer+materials+and+devices.">Polyoxometalate clusters, nanostructures and materials: from self assembly to designer materials and devices.</a> Chemical Society Reviews. 36 (1), 105-121 (2007).</li><li>Muller, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyoxovanadates:+High-nuclearity+spin+clusters+with+interesting+host-guest+systems+and+different+electron+populations.+Synthesis,+spin+organization,+magnetochemistry,+and+spectroscopic+studies.">Polyoxovanadates: High-nuclearity spin clusters with interesting host-guest systems and different electron populations. Synthesis, spin organization, magnetochemistry, and spectroscopic studies.</a> Inorganic Chemistry. 36 (23), 5239-5250 (1997).</li><li>Rausch, B., Symes, M. D., Chisholm, G., Cronin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoupled+catalytic+hydrogen+evolution+from+a+molecular+metal+oxide+redox+mediator+in+water+splitting.">Decoupled catalytic hydrogen evolution from a molecular metal oxide redox mediator in water splitting.</a> Science. 345 (6202), 1326-1330 (2014).</li><li>Dolbecq, A., Dumas, E., Mayer, C. R., Mialane, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+organic-inorganic+polyoxometalate+compounds:+from+structural+diversity+to+applications.">Hybrid organic-inorganic polyoxometalate compounds: from structural diversity to applications.</a> Chemical Reviews. 110 (10), 6009-6048 (2010).</li><li>Busche, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+fabrication+of+memory+devices+based+on+nanoscale+polyoxometalate+clusters.">Design and fabrication of memory devices based on nanoscale polyoxometalate clusters.</a> Nature. 515 (7528), 545-549 (2014).</li><li>Pope, M., M&#252;ller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Polyoxometalates: From Platonic Solids to Anti-Retroviral Activity. 10, (2012).</li><li>Rhule, J. T., Hill, C. L., Judd, D. A., Schinazi, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyoxometalates+in+medicine.">Polyoxometalates in medicine.</a> Chemical Reviews. 98 (1), 327-358 (1998).</li><li>Gao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transition-metal-substituted+polyoxometalate+derivatives+as+functional+anti-amyloid+agents+for+Alzheimer's+disease.">Transition-metal-substituted polyoxometalate derivatives as functional anti-amyloid agents for Alzheimer's disease.</a> Nature Communications. 5, 3422 (2014).</li><li>Pope, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Heteropoly and Isopoly Oxometalates. 8, (1983).</li><li>Braha, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designed+protein+pores+as+components+for+biosensors.">Designed protein pores as components for biosensors.</a> Chemistry &amp; Biology. 4 (7), 497-505 (1997).</li><li>Forstater, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOSAIC:+A+modular+single-molecule+analysis+interface+for+decoding+multistate+nanopore+data.">MOSAIC: A modular single-molecule analysis interface for decoding multistate nanopore data.</a> Analytical Chemistry. 88 (23), 11900-11907 (2016).</li><li>Balijepalli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+Short-Lived+Events+in+Multistate+Ionic+Current+Measurements.">Quantifying Short-Lived Events in Multistate Ionic Current Measurements.</a> ACS Nano. 8, 1547-1553 (2014).</li><li>Misakian, M. M., Kasianowicz, J. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrostatic+influence+on+ion+transport+through+the+alphaHL+channel.">Electrostatic influence on ion transport through the alphaHL channel.</a> Journal of Membrane Biology. 195 (3), 137-146 (2003).</li><li>Piguet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+single+amino+acid+differences+in+uniformly+charged+homopolymeric+peptides+with+aerolysin+nanopore.">Identification of single amino acid differences in uniformly charged homopolymeric peptides with aerolysin nanopore.</a> Nature Communication. 9 (966), (2018).</li></ol>

A causa della loro carica anionica, i POM probabilmente si associano alle contro-zioni organiche attraverso interazioni elettrostatiche. Pertanto, è importante identificare le condizioni di soluzione appropriate e gli ambienti elettrolitici corretti (in particolare le cazioni nella soluzione) per evitare la formazione complessa con i POM. Particolare attenzione è necessaria nella scelta del buffer. Ad esempio, la velocità di acquisizione dei POM con soluzioni tris(idrossimetile) aminomethane e citrico-buffered è sign...

Il rilevamento di analiti biomolecolari a livello di singola molecola può essere eseguito utilizzando nanopori e misurando modulazioni di corrente ionica. Tipicamente, i nanopori sono divisi in due categorie in base alla loro fabbricazione: biologica (auto-assemblata da proteine o origami di DNA)1,2,3o stato solido (adesempio, prodotto con strumenti di elaborazione dei semiconduttori)4,5. Mentre i nanopori allo stato solido sono stati suggeriti come potenzialmente più robusti fisicamente e possono essere utilizzati in un'ampia gamma di condizioni di soluzione, i nanopori proteici finora offrono una maggiore sensibilità, maggiore resistenza all'incrostazione, una maggiore larghezza di banda, una migliore chimica selettività e un maggiore rapporto segnale/rumore.
Una varietà di canali ionici proteici, come quello formato da Staphylococcus aureus -emolysina ( , può essere utilizzato per rilevaresingolemolecole, compresi gli ioni (ad es. e RNA)6,7,8, DNA danneggiato9, polipeptidi10, proteine (piegate e spiegate)11, polimeri (glicole di polietilene e altri)12,13 , 14, nanoparticelle d'oro15,16,17,18,19e altre molecole sintetiche20.
Recentemente abbiamo dimostrato che il nanoporo di HL può anche facilmente rilevare e caratterizzare ammassi metallici, poliossimetalati (POM), a livello di singola molecola. I POM sono cluster di ossigeno metallici su scala nanometrica discreti che sono stati scoperti nel 182621, e da allora, molti altri tipi sono stati sintetizzati. Le diverse dimensioni, strutture e composizioni elementali di poliossimetalati che sono ora disponibili hanno portato a una vasta gamma di proprietà e applicazioni tra cui chimica22,23, catalisi24, scienza dei materiali25 ,26, e ricerca biomedica27,28,29.
La sintesi POM è un processo di auto-assemblaggio tipicamente eseguito in acqua mescolando le quantità stoichiometricamente richieste di sali metallici monomerici. Una volta formati, i POM mostrano una grande diversità di dimensioni e forme. Ad esempio, la struttura in polianione di Keggin, XM12O40q- è composta da un eteroatoma (X) circondato da quattro ossigeno per formare un tetraedro (q è la carica). L'eteroatomo si trova in posizione centrale all'interno di una gabbia formata da 12 ottaedriMO MO6 unità (dove M - metalli di transizione nel loro stato di alta ossidazione), che sono collegati tra loro da atomi di ossigeno condivisi vicini. Mentre la struttura dei tungsteno poliossimetalati è stabile in condizioni acide, gli ioni idrossidi portano alla scissione idrolitica dei legami metallo-ossigeno (M-O)30. Questo complesso processo comporta la perdita di una o più sottounità ottahedrali MO6, che porta alla formazione di specie monovacanti e trivacanti e alla fine alla completa decomposizione dei POM. La nostra discussione qui sarà limitata ai prodotti di decomposizione parziale dell'acido 12-foshotungstic a pH 5.5 e 7.5.
L'obiettivo di questo protocollo è quello di rilevare cluster di ossigeno metallico discreti al limite di singola molecola utilizzando una piattaforma elettronica biologica basata su nanopori. Questo metodo consente il rilevamento di cluster metallici nella soluzione. Più specie in soluzione possono essere discriminate con maggiore sensibilità rispetto ai metodi analitici convenzionali33. Con esso, sottili differenze nella struttura POM possono essere chiarite, e a concentrazioni nettamente inferiori a quelle richieste per la spettroscopia NMR. È importante sottolineare che questo approccio consente anche la discriminazione delle forme isomeriche di Na8HPW9O341.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nanopatch DC System</td>
			<td>Electronic Biosciences, Inc., EBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore LC-PAK</td>
			<td>Millipore vacuum filter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-Diphytanoyl-sn- Glycero-3-Phosphocholine (DPhPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL</td>
			<td>850356P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decane, ReagentPlus, &#8805;99%,</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;HL</td>
			<td>List Biological Laboratories, Campbell, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ag wire</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mm Ag/AgCl disk electrode</td>
			<td>In Vivo Metric</td>
			<td>E202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-impedance amplifier system</td>
			<td>Electronic Biosciences, San Diego, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>quartz capillaries</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>custom polycarbonate test cell</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Processing and Analysis MOSAIC</td>
			<td>https://pages.nist.gov/mosaic/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphotungstic acid hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>455970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71507</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high resolution physical characterization of single metallic nanoparticles

Le singole molecole possono essere rilevate e caratterizzate misurando il grado con cui riducono la corrente ionica che scorre attraverso un singolo poro su scala nanometrica. Il segnale è caratteristico delle proprietà fisico della molecola e delle sue interazioni con il poro. Dimostriamo che i nanopori formati dalla proteina batterica exotoxin Staphylococcus aureus alpha hemolysin (ZHL) sono in grado di rilevare i poliossimiti (POM, ammassi di ossigeno anionico), al limite della singola molecola. Inoltre, più prodotti di degradazione di 12-foshotungstic acid POM (PTA, H3PW12O40) in soluzione sono misurati simultaneamente. La sensibilità a singola molecola del metodo nanoporo consente di caratterizzare i POM a concentrazioni significativamente inferiori a quelle richieste per la spettroscopia a risonanza magnetica nucleare (NMR). Questa tecnica potrebbe servire come nuovo strumento per i chimici per studiare le proprietà molecolari dei poliossimetalati o di altri cluster metallici, per comprendere meglio i processi sintetici POM e possibilmente migliorare la loro resa. Ipoteticamente, la posizione di un dato atomo, o la rotazione di un frammento nella molecola, e lo stato di ossidazione del metallo potrebbero essere studiati con questo metodo. Inoltre, questa nuova tecnica ha il vantaggio di consentire il monitoraggio in tempo reale delle molecole in soluzione.

Negli ultimi due decenni, i pori su scala nanometrica delle proteine legate alla membrana sono stati dimostrati come sensori versatili a singola molecola. Le misurazioni basate su nanopori sono relativamente semplici da eseguire.  Due camere piene di soluzione elettrolitica sono separate da un nanoporo incorporato in una membrana lipidica isolante elettricamente. Un amplificatore patch-clamp o un alimentatore esterno fornisce un potenziale elettrostatico attraverso i nanopori tramite...

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High Resolution Physical Characterization of Single Metallic Nanoparticles

Qui, presentiamo un protocollo per rilevare cluster di ossigeno metallico discreti, poliossimetalati (POM), al limite di singole molecole utilizzando una piattaforma elettronica biologica basata su nanopori. Il metodo fornisce un approccio complementare agli strumenti chimici analitici tradizionali utilizzati nello studio di queste molecole.

Caratterizzazione fisica ad alta risoluzione di nanoparticelle metalliche singole

Individual molecules can be detected and characterized by measuring the degree by which they reduce the ionic current flowing through a single ...

Questo metodo di rilevamento basato su nanopore ha dimostrato il potenziale per caratterizzare fisicamente e identificare singole molecole. Lavorare con metallo-nanoparticelle, che è lo scopo di questo video, sta sfidando la nostra comprensione di ciò che limita l'accuratezza e la precisione della misurazione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che questo apparato ha una maggiore larghezza di banda rispetto al tradizionale set-up di memoria lipidica bistrato, che ci consente di vedere risultati più veloci e più reazioni in nanopore.Questa tecnica è stata resa possibile perché nei primi anni '90 è stato dimostrato che il gating nei nanopori proteici, cioè il passaggio da uno stato all'altro, può essere controllato e le molecole possono legarsi alla parete dei pori. Questa tecnica è in fase di sviluppo per applicazioni commerciali di sequenziamento del DNA perché utilizza campioni minimi. Non richiede etichette fluorescenti e utilizza lunghezze di lettura molto più lunghe rispetto ai metodi convenzionali.Questa tecnica è stata anche sviluppata per discriminare tra polimeri in base alle loro dimensioni con maggiore precisione e velocità rispetto all'elettroforesi del gel e alla cromatografia. In primo luogo, preparare 500 millilitri di una soluzione di cloruro di sodio un molare e fosfato monosodico 10 millimolare in acqua ultrapura come elettrolita. È meglio utilizzare soluzioni e campioni freschi con questo particolare set-up.Inoltre, abbiamo scoperto che l'acqua deionizzata di alta qualità è molto importante per formare con successo le membrane. Quindi, combinare un milligrammo di polvere monomerica S.aureus alfa emolisina di tipo selvatico liofilizzato con un millilitro di acqua ultrapura. Non dimenticare che lavorare con la proteina della tossina alfa emolisina Staph aureus può essere pericoloso.Seguire le precauzioni nell'MSDS durante l'esecuzione di questa procedura. Successivamente, preparare quattro millilitri da cinque milligrammi per millilitro DPhyPC in endecaina in una fiala a scintillazione di vetro. Tappare la fiala con un cappuccio rivestito in politetrafluoroetilene e conservarla a quattro gradi Celsius per un massimo di un mese.Successivamente, sciogliere 57,6 milligrammi di acido 12-fosfotungstico idratare in 10 millilitri dell'elettrolita per fare una soluzione di polioxometalato bimolare. Dividere la soluzione POM in due porzioni da cinque millilitri. Utilizzare idrossido di sodio trimolare per regolare il pH di una soluzione POM a 5,5.Per iniziare a prepararsi per il test, assemblare la cellula di prova di un apparato elettrofisiologico planare lipidico bistrato. In primo luogo, abradere un filo d'argento con carta vetrata da 600 graniglia e immergerlo nella candeggina a base di ipoclorito di sodio disponibile in commercio per 10 minuti per realizzare l'elettrodo di filo di cloruro argento-argento. Risciacquare e asciugare l'elettrodo di filo prima di inserirlo nel capillare al quarzo dell'apparecchio.Mantenere l'elettrodo all'interno della membrana quarzo-nanopore, o QNM, separando il capillare e il serbatoio. Quindi posizionare un elettrodo cilindrico in pelle di cloruro d'argento-argento montato su un filo d'argento nel serbatoio. Collegare entrambi gli elettrodi alla scheda del circuito dell'amplificatore.Aprire quindi il programma di acquisizione dati e avviare l'alimentatore a zero millivolt. Verificare che non sia rilevata corrente CC tra gli elettrodi nella cella vuota. Durante questa dimostrazione è importante osservare come la pressione trascapillare può influire sulla formazione della membrana e sulla successiva formazione di nanopore.Senza fare correttamente questi due passaggi, gli esperimenti non funzioneranno. Caricare circa un millilitro di elettrolita in una siringa e collegarlo alla linea del fluido collegata al serbatoio. Aggiungere l'elettrolita al serbatoio fino a quando la faccia del QNM non è sommersa, come indicato dalla corrente ionica tra gli elettrodi che saturano l'amplificatore.Se l'amplificatore non si satura, sbloccare il QNM applicando una tensione pop di più o meno un volt o aumentando la pressione capillare di circa 300 millimetri di mercurio. Utilizzare entrambe le tecniche, se necessario. Una volta che l'amplificatore si satura, ritirare l'elettrolita dal serbatoio fino a quando i livelli della soluzione scende al di sotto del QNM, come indicato dalla corrente che ritorna a zero.Per iniziare il processo di formazione dei bistrati lipidici, aumentare il livello della soluzione elettrolita ben al di sopra della faccia del QNM e notare quanta soluzione ha preso. Quindi immergere una punta di pipetta da 10 microliter nella soluzione DPHyPC e disegnare tutti i lipidi visibili nella punta. Toccare la punta della pipetta sulla superficie della soluzione elettrolita e lasciare fluire il lipide dalla pipetta attraverso l'interfaccia aria-acqua.Attendere da due a cinque minuti affinché il lipide si diffonda uniformemente attraverso la soluzione. Successivamente, ritirare lentamente l'elettrolita fino a quando la superficie della soluzione non è inferiore al QNM e quindi aggiungere lentamente abbastanza elettrolita per sollevare la soluzione al di sopra del QNM per formare la membrana isolante dei due strati lipidici. Se il bistrato non si forma dopo tre tentativi, applicare un'altra porzione di lipidi come descritto in precedenza e ripetere il processo.Una volta che il bistrato sembra aver formato, aumentare la pressione al capillare per far scoppiare il bistrato e quindi riformarlo abbassando lentamente e alzando il livello della soluzione nello stesso modo di prima. Ripetere questo processo più volte per assicurarsi che il QNM non sia intasato e che si sia formato un bistrato. Successivamente, scongelare un'aliquota di proteina alfa emolisina sul ghiaccio o a temperatura ambiente.Riempire il serbatoio con 250 nanogrammi di proteina monomerica alfa emolisina e circa 250 microlitri di acqua ultrapura. Quindi, applicare una distorsione da 200 a 400 millivolt per indurre la formazione dei pori. Per facilitare la formazione dei pori, aumentare la pressione capillare di 40-200 millimetri di mercurio per espandere il bistrato dal QNM.Una volta che un nanopore si forma, ridurre la distorsione applicata alla tensione di misura e ridurre la pressione a circa la metà della pressione di inserimento. Per iniziare il test, regolare la tensione di offset CC per assicurarsi che non vi sia corrente misurata quando il potenziale applicato è impostato su zero. Successivamente, acquisire una traccia di corrente ionica per un potenziale applicato da 120 a -120 millivolt rispetto al serbatoio.Confermare che non ci sono contaminanti, che sarebbero indicati da blocchi spontanei della corrente. Aggiungere uno o sei microlitri di pH 5,5 soluzione a grappolo POM bimolare al serbatoio. Applicare misurazioni della serie temporali di corrente ionica a una tensione applicata di 120 millivolt negativi.Il movimento delle singole molecole di acido fosfotungstico anionico attraverso il canale alfa emolisina ha prodotto blocchi transitori che hanno diminuito la corrente ionica media a poro aperto di circa l'80%La durata e la corrente di blocco sono entrambe direttamente correlate all'interazione particella-poro, permettendo alle specie ioniche di essere differenziate negli istogrammi dei rapporti di profondità di blocco relativi. A pH 5,5, sono stati osservati due picchi con rapporti di profondità di circa 0,06 e 0,16. Basato sulla NMR al fosforo, il picco minore era la specie fosfotungsta a sei meno e il picco maggiore era la specie a sette meno.A pH 7,5, le concentrazioni relative si spostarono verso un rapporto più elevato tra la specie 6-minus e la specie a sette meno. La diminuzione di 20 volte degli eventi di blocco rispetto al pH 5,5 è stata attribuita alla degradazione agli ioni fosfato e tungsta liberi. Adattare le distribuzioni tempo di residenza richiedeva molteplici funzioni esponenziali, indicando più tipi di interazioni particella-pori all'interno di ogni specie ionica.I tempi di soggiorno più brevi a pH 7,5 suggerivano interazioni particella-pori più deboli rispetto al pH 5,5, coerentemente con studi precedenti che mostravano variazioni dipendenti dal pH nel numero relativo di cariche fisse nel lume del canale alfa emolisina o vicino ad esso. L'acqua deionizzata ad alta purezza è fondamentale per questo particolare set-up. Una cartuccia filtrante organica spesa è stata la probabile causa dell'incapacità del nostro laboratorio di formare membrane sui QMM per mesi.Gli individui nuovi di questa particolare versione del metodo potrebbero anche lottare perché le membrane sono così piccole e c'è un trucco per far formare i nanopori. Questo metodo, iniziato diversi decenni fa, si è dimostrato utile per analizzare ioni, acidi nucleici e polimeri sintetici, nonché il sequenziamento del DNA. Potrebbe anche trovare applicazioni in biofisica e biologia cellulare di base.Ad esempio, questa procedura può essere utilizzata per studiare le proprietà fisiche dei polimeri sintetici e dei biopolimeri per studiarne le dimensioni, le interazioni con altre molecole e altre questioni importanti.

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