Name: high resolution physical characterization of single metallic nanoparticles
Uploaded: 2019-06-28T11:00:00
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Agradecemos el apoyo financiero de la Organización Europea de Biología Molecular para una beca postdoctoral (a J.E.) y una subvención de la NIH NHGRI (a J.J.K.). Agradecemos la ayuda de los profesores Jingyue Ju y Serguéi Kalachikov (Universidad de Columbia) por proporcionar heptérica hl, y por inspirar discusiones con el profesor Joseph Reiner (Virginia Commonwealth University).

Nota: El siguiente protocolo es específico del sistema Nanopatch DC de Electronic BioSciences (EBS). Sin embargo, se puede adaptar fácilmente a otros aparatos de electrofisiología utilizados para medir la corriente a través de membranas bicapa de lípidos planas (cámara de membrana bicapa de lípidos estándar, geometría de tubo U, microcapilares tirados, etc.). La identificación de materiales comerciales y sus fuentes se da para describir los resultados experimentales. En ningún caso es...

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	<li>Ettedgui, J., Kasianowicz, J. J., Balijepalli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+discrimination+of+heteropolytungstates+and+their+Isomers+in+solution+with+a+nanometer-scale+pore.">Single molecule discrimination of heteropolytungstates and their Isomers in solution with a nanometer-scale pore.</a> Journal of the American Chemical Society. 138 (23), 7228-7231 (2016).</li><li>Bezrukov, S., Kasianowicz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+noise+reveals+protonation+kinetics+and+number+of+ionizable+sites+in+an+open+protein+ion+channel.">Current noise reveals protonation kinetics and number of ionizable sites in an open protein ion channel.</a> Physical Review Letters. 70 (15), 2352-2355 (1993).</li><li>Kasianowicz, J. J., Bezrukov, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protonation+dynamics+of+the+alpha-toxin+ion+channel+from+spectral+analysis+of+pH-dependent+current+fluctuations.">Protonation dynamics of the alpha-toxin ion channel from spectral analysis of pH-dependent current fluctuations.</a> Biophysj. 69 (1), 94-105 (1995).</li><li>Please, T. R., Ayub, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-State+Nanopore.">Solid-State Nanopore.</a> Engineered Nanopores for Bioanalytical Applications. , 121-140 (2013).</li><li>Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-state+nanopores.">Solid-state nanopores.</a> Nature Nanotechnology. 2 (4), 209-215 (2007).</li><li>Kasianowicz, J. J., Brandin, E., Branton, D., Deamer, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+individual+polynucleotide+molecules+using+a+membrane+channel.">Characterization of individual polynucleotide molecules using a membrane channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (24), 13770-13773 (1996).</li><li>Akeson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsecond+time-scale+discrimination+among+polycytidylic+acid,+polyadenylic+acid,+and+polyuridylic+acid+as+homopolymers+or+as+segments+within+single+RNA+molecules.">Microsecond time-scale discrimination among polycytidylic acid, polyadenylic acid, and polyuridylic acid as homopolymers or as segments within single RNA molecules.</a> Biophysical Journal. 77 (6), 3227-3233 (1999).</li><li>Singer, A., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopore-based+Sensing+of+Individual+Nucleic+Acid+Complexes.">Nanopore-based Sensing of Individual Nucleic Acid Complexes.</a> Israel Journal of Chemistry. 49 (3-4), 323-331 (2010).</li><li>Jin, Q., Fleming, A. M., Burrows, C. J., White, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unzipping+kinetics+of+duplex+DNA+containing+oxidized+lesions+in+an+&#945;-hemolysin+nanopore.">Unzipping kinetics of duplex DNA containing oxidized lesions in an &#945;-hemolysin nanopore.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (26), 11006-11011 (2012).</li><li>Halverson, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anthrax+biosensor,+protective+antigen+ion+channel+asymmetric+blockade.">Anthrax biosensor, protective antigen ion channel asymmetric blockade.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (40), 34056-34062 (2005).</li><li>Oukhaled, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unfolding+of+proteins+and+long+transient+conformations+detected+by+single+nanopore+recording.">Unfolding of proteins and long transient conformations detected by single nanopore recording.</a> Physical Review Letters. 98 (15), 158101 (2007).</li><li>Reiner, J. E., Kasianowicz, J. J., Nablo, B. J., Robertson, J. W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory+for+polymer+analysis+using+nanopore-based+single-molecule+mass+spectrometry.">Theory for polymer analysis using nanopore-based single-molecule mass spectrometry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12080-12085 (2010).</li><li>Robertson, J. W. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+mass+spectrometry+in+solution+using+a+solitary+nanopore.">Single-molecule mass spectrometry in solution using a solitary nanopore.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (20), 8207-8211 (2007).</li><li>Baaken, G., Ankri, N., Schuler, A. -. K., R&#252;he, J., Behrends, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopore-based+single-molecule+mass+spectrometry+on+a+lipid+membrane+microarray.">Nanopore-based single-molecule mass spectrometry on a lipid membrane microarray.</a> ACS Nano. 5 (10), 8080-8088 (2011).</li><li>Angevine, C. E., Chavis, A. E., Kothalawala, N., Dass, A., Reiner, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+single+molecule+mass+spectrometry+via+charged+metallic+clusters.">Enhanced single molecule mass spectrometry via charged metallic clusters.</a> Analytical Chemistry. 86 (22), 11077-11085 (2014).</li><li>Astier, Y., Uzun, O., Stellacci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+study+of+single+gold+nanoparticle/alpha-Hemolysin+complex+formation:+a+nanotool+to+slow+down+ssDNA+through+the+alpha-Hemolysin+nanopore.">Electrophysiological study of single gold nanoparticle/alpha-Hemolysin complex formation: a nanotool to slow down ssDNA through the alpha-Hemolysin nanopore.</a> Small. 5 (11), 1273-1278 (2009).</li><li>Chavis, A. E., Brady, K. T., Kothalawala, N., Reiner, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage+and+blockade+state+optimization+of+cluster-enhanced+nanopore+spectrometry.">Voltage and blockade state optimization of cluster-enhanced nanopore spectrometry.</a> Analyst. 140 (22), 7718-7725 (2015).</li><li>Campos, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensing+single+mixed-monolayer+protected+gold+nanoparticles+by+the+&#945;-hemolysin+nanopore.">Sensing single mixed-monolayer protected gold nanoparticles by the &#945;-hemolysin nanopore.</a> Analytical Chemistry. 85 (21), 10149-10158 (2013).</li><li>Campos, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Lys147+in+the+interaction+between+MPSA-gold+nanoparticles+and+the+&#945;-hemolysin+nanopore.">The role of Lys147 in the interaction between MPSA-gold nanoparticles and the &#945;-hemolysin nanopore.</a> Langmuir. 28 (44), 15643-15650 (2012).</li><li>Baaken, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Resolution+Size-Discrimination+of+Single+Nonionic+Synthetic+Polymers+with+a+Highly+Charged+Biological+Nanopore.">High-Resolution Size-Discrimination of Single Nonionic Synthetic Polymers with a Highly Charged Biological Nanopore.</a> ACS Nano. 9 (6), 6443-6449 (2015).</li><li>Berzelius, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beitrag+zur+n&#228;heren+Kenntniss+des+Molybd&#228;ns.">Beitrag zur n&#228;heren Kenntniss des Molybd&#228;ns.</a> Annalen Der Physik. 82 (1), 369-392 (1826).</li><li>Long, D. -. L., Burkholder, E., Cronin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyoxometalate+clusters,+nanostructures+and+materials:+from+self+assembly+to+designer+materials+and+devices.">Polyoxometalate clusters, nanostructures and materials: from self assembly to designer materials and devices.</a> Chemical Society Reviews. 36 (1), 105-121 (2007).</li><li>Muller, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyoxovanadates:+High-nuclearity+spin+clusters+with+interesting+host-guest+systems+and+different+electron+populations.+Synthesis,+spin+organization,+magnetochemistry,+and+spectroscopic+studies.">Polyoxovanadates: High-nuclearity spin clusters with interesting host-guest systems and different electron populations. Synthesis, spin organization, magnetochemistry, and spectroscopic studies.</a> Inorganic Chemistry. 36 (23), 5239-5250 (1997).</li><li>Rausch, B., Symes, M. D., Chisholm, G., Cronin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoupled+catalytic+hydrogen+evolution+from+a+molecular+metal+oxide+redox+mediator+in+water+splitting.">Decoupled catalytic hydrogen evolution from a molecular metal oxide redox mediator in water splitting.</a> Science. 345 (6202), 1326-1330 (2014).</li><li>Dolbecq, A., Dumas, E., Mayer, C. R., Mialane, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+organic-inorganic+polyoxometalate+compounds:+from+structural+diversity+to+applications.">Hybrid organic-inorganic polyoxometalate compounds: from structural diversity to applications.</a> Chemical Reviews. 110 (10), 6009-6048 (2010).</li><li>Busche, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+fabrication+of+memory+devices+based+on+nanoscale+polyoxometalate+clusters.">Design and fabrication of memory devices based on nanoscale polyoxometalate clusters.</a> Nature. 515 (7528), 545-549 (2014).</li><li>Pope, M., M&#252;ller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Polyoxometalates: From Platonic Solids to Anti-Retroviral Activity. 10, (2012).</li><li>Rhule, J. T., Hill, C. L., Judd, D. A., Schinazi, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyoxometalates+in+medicine.">Polyoxometalates in medicine.</a> Chemical Reviews. 98 (1), 327-358 (1998).</li><li>Gao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transition-metal-substituted+polyoxometalate+derivatives+as+functional+anti-amyloid+agents+for+Alzheimer's+disease.">Transition-metal-substituted polyoxometalate derivatives as functional anti-amyloid agents for Alzheimer's disease.</a> Nature Communications. 5, 3422 (2014).</li><li>Pope, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Heteropoly and Isopoly Oxometalates. 8, (1983).</li><li>Braha, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designed+protein+pores+as+components+for+biosensors.">Designed protein pores as components for biosensors.</a> Chemistry &amp; Biology. 4 (7), 497-505 (1997).</li><li>Forstater, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MOSAIC:+A+modular+single-molecule+analysis+interface+for+decoding+multistate+nanopore+data.">MOSAIC: A modular single-molecule analysis interface for decoding multistate nanopore data.</a> Analytical Chemistry. 88 (23), 11900-11907 (2016).</li><li>Balijepalli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+Short-Lived+Events+in+Multistate+Ionic+Current+Measurements.">Quantifying Short-Lived Events in Multistate Ionic Current Measurements.</a> ACS Nano. 8, 1547-1553 (2014).</li><li>Misakian, M. M., Kasianowicz, J. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrostatic+influence+on+ion+transport+through+the+alphaHL+channel.">Electrostatic influence on ion transport through the alphaHL channel.</a> Journal of Membrane Biology. 195 (3), 137-146 (2003).</li><li>Piguet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+single+amino+acid+differences+in+uniformly+charged+homopolymeric+peptides+with+aerolysin+nanopore.">Identification of single amino acid differences in uniformly charged homopolymeric peptides with aerolysin nanopore.</a> Nature Communication. 9 (966), (2018).</li></ol>

Debido a su carga aniónica, los POP probablemente se asocian con los contracations orgánicos a través de interacciones electrostáticas. Por lo tanto, es importante identificar las condiciones adecuadas de la solución y los entornos de electrolitos adecuados (especialmente cationes en solución) para evitar la formación compleja con LOS POP. Se requiere un cuidado especial en la elección del búfer. Por ejemplo, la tasa de captura de POP con soluciones tris(hidroximetil)aminometano y tampón de ácido cítrico es s...

La detección de analitos biomoleculares a nivel de molécula única se puede realizar mediante el uso de nanoporos y la medición de modulaciones de corriente iónica. Típicamente, los nanoporos se dividen en dos categorías basadas en su fabricación: biológica (autoensamblada a partir de proteínas o o origami de ADN)1,2,3,o estado sólido (porejemplo,fabricado con herramientas de procesamiento de semiconductores)4,5. Mientras que los nanoporos de estado sólido se sugirieron como potencialmente más robustos físicamente y se pueden utilizar en una amplia gama de condiciones de solución, los nanoporos proteicos hasta ahora ofrecen una mayor sensibilidad, más resistencia a la suciedad, mayor ancho de banda, mejor selectividad, y una mayor relación señal-ruido.
Una variedad de canales de iones proteicos, como el formado por Staphylococcus aureus-hemolysin (HL), se puede utilizar para detectar moléculas individuales, incluyendo iones (porejemplo,, H+ y D+)2,3, polinucleótidos (DNA y ARN)6,7,8, ADN dañado9, polipéptidos10, proteínas (plegados y desplegados)11, polímeros (polietilenglicol y otros)12,13 , 14, nanopartículas de oro15,16,17,18,19, y otras moléculas sintéticas20.
Recientemente demostramos que el nanoporo de HL también puede detectar y caracterizar fácilmente racimos metálicos, polioxometalados (POP), a nivel de molécula única. Los POP son racimos discretos de oxígeno metálico aniónico a nanoescala que fueron descubiertos en 182621,y desde entonces, se han sintetizado muchos más tipos. Los diferentes tamaños, estructuras y composiciones elementales de polioxometalados que ahora están disponibles dieron lugar a una amplia gama de propiedades y aplicaciones, incluyendo química22,23, catálisis24, ciencia de materiales25 ,26,e investigación biomédica27,28,29.
La síntesis POM es un proceso de autoensamblaje típicamente llevado a cabo en agua mediante la mezcla de las cantidades estequiométricamente requeridas de sales metálicas monoméricas. Una vez formados, los POP exhiben una gran diversidad de tamaños y formas. Por ejemplo, la estructura de poliolano Keggin, XM12O40q- se compone de una heteroátomo (X) rodeada de cuatro oxígenos para formar un tetraedro (q es la carga). La heteroátomo se encuentra centralmente dentro de una jaula formada por 12 unidades DE MO 6 octahedrales (donde los metales de transición M en su estado de alta oxidación), que están unidos entre sí por átomos de oxígeno compartidos vecinos. Mientras que la estructura de polioxmetalados de tungsteno es estable en condiciones ácidas, iones de hidróxido conducen a la escisión hidrolítica de enlaces metal-oxígeno (M-O)30. Este complejo proceso resulta en la pérdida de una o más subunidades octáhedrticas MO 6, lo que conduce a la formación de especies monovacantes y triocupadas y, finalmente, a la descomposición completa de los POMs. Nuestra discusión aquí se limitará a los productos de descomposición parcial de ácido 12-fosfotúrtico a pH 5.5 y 7.5.
El objetivo de este protocolo es detectar cúmulos de oxígeno metálico discretos en el límite de molécula única utilizando una plataforma electrónica biológica basada en nanoporos. Este método permite la detección de racimos metálicos en solución. Múltiples especies en solución pueden ser discriminadas con mayor sensibilidad que los métodos analíticos convencionales33. Con él, se pueden esclarecer diferencias sutiles en la estructura pom, y en concentraciones marcadamente inferiores a las requeridas para la espectroscopia de RMN. Es importante destacar que este enfoque incluso permite la discriminación de formas isoméricas de Na8HPW9O341.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nanopatch DC System</td>
			<td>Electronic Biosciences, Inc., EBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore LC-PAK</td>
			<td>Millipore vacuum filter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-Diphytanoyl-sn- Glycero-3-Phosphocholine (DPhPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL</td>
			<td>850356P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decane, ReagentPlus, &#8805;99%,</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;HL</td>
			<td>List Biological Laboratories, Campbell, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ag wire</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mm Ag/AgCl disk electrode</td>
			<td>In Vivo Metric</td>
			<td>E202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-impedance amplifier system</td>
			<td>Electronic Biosciences, San Diego, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>quartz capillaries</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>custom polycarbonate test cell</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Processing and Analysis MOSAIC</td>
			<td>https://pages.nist.gov/mosaic/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphotungstic acid hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>455970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71507</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high resolution physical characterization of single metallic nanoparticles

Las moléculas individuales se pueden detectar y caracterizar midiendo el grado por el cual reducen la corriente iónica que fluye a través de un solo poro a escala nanométrica. La señal es característica de las propiedades fisicoquímicas de la molécula y sus interacciones con el poro. Demostramos que los nanoporos formados por la exotoxina proteica bacteriana Staphylococcus aureus alpha hemolysin (HL) pueden detectar polioxometalatos (POP, grupos de oxígeno metálico aniónico), en el límite de molécula única. Además, se miden simultáneamente múltiples productos de degradación de ácido 12-fosfotúltico POM (PTA, H3PW12O40) en solución. La sensibilidad de una sola molécula del método de nanoporos permite que los POP se caracten a concentraciones significativamente más bajas de lo requerido para la espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN). Esta técnica podría servir como una nueva herramienta para que los químicos estudien las propiedades moleculares de los polioxometalados u otros racimos metálicos, para comprender mejor los procesos sintéticos de POM y posiblemente mejorar su rendimiento. Hipotéticamente, la ubicación de un átomo dado, o la rotación de un fragmento en la molécula, y el estado de oxidación del metal podrían ser investigados con este método. Además, esta nueva técnica tiene la ventaja de permitir el monitoreo en tiempo real de moléculas en solución.

En las últimas dos décadas, los poros a escala nanométrica de proteínas unidas a membranas se han demostrado como versátiles sensores de una sola molécula. Las mediciones basadas en nanoporos son relativamente sencillas de ejecutar.  Dos cámaras llenas de solución de electrolitos están separadas por una nanoporo incrustada en una membrana lipídica aislante eléctricamente. Un amplificador de abrazadera de parche o una fuente de alimentación externa proporciona un potencial ele...

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High Resolution Physical Characterization of Single Metallic Nanoparticles

Aquí, presentamos un protocolo para detectar cúmulos de oxígeno metálico discretos, polioxometalados (POP), en el límite de molécula única utilizando una plataforma electrónica biológica basada en nanoporos. El método proporciona un enfoque complementario a las herramientas de química analítica tradicionales utilizadas en el estudio de estas moléculas.

Caracterización física de alta resolución de nanopartículas metálicas únicas

Individual molecules can be detected and characterized by measuring the degree by which they reduce the ionic current flowing through a single ...

Este método de detección basado en nanoporos ha demostrado el potencial de caracterizar e identificar físicamente moléculas individuales. Trabajar con metalo-nanopartículas, que es el propósito de este video, está desafiando nuestra comprensión de lo que limita la precisión y la precisión de la medición. La principal ventaja de esta técnica es que este aparato tiene mayor ancho de banda que la configuración tradicional de memoria bicapa lipídica, lo que nos permite ver resultados más rápidos y más reacciones en nanoporos.Esta técnica fue posible porque a principios de la década de 1990 se demostró que la gating en nanoporos proteicos, es decir, el cambio entre diferentes estados, se puede controlar y las moléculas pueden unirse a la pared de los poros. Esta técnica se está desarrollando para aplicaciones comerciales de secuenciación de ADN porque utiliza muestras mínimas. No requiere etiquetas fluorescentes y utiliza longitudes de lectura mucho más largas que los métodos convencionales.Esta técnica también ha sido desarrollada para discriminar entre polímeros en función de su tamaño con mayor precisión y velocidad que la electroforesis de gel y la cromatografía. En primer lugar, preparar 500 mililitros de una solución de cloruro sódico de un molar y fosfato monosódico de 10 mililitros en agua ultrapura como electrolito. Lo mejor es utilizar soluciones y muestras frescas con esta configuración en particular.Además, encontramos que el agua desionizada de alta calidad es muy importante para formar con éxito las membranas. A continuación, combine un miligramo de polvo monomérico de tipo S.aureus alfa hemolysin liofilizado con un mililitro de agua ultrapura. No olvides que trabajar con la proteína toxina stafita aureus alfa hemolysin puede ser peligroso.Siga las precauciones del MSDS al realizar este procedimiento. A continuación, preparar cuatro mililitros de cinco miligramos por mililitro DPhyPC en endecaine en un vial de centelleo de vidrio. Tapa el vial con una tapa forrada de politetrafluoroetileno y guárdalo a cuatro grados centígrados durante un mes.Después de eso, disolver 57,6 miligramos de 12-fosfotúncístico ácido hidrato en 10 mililitros del electrolito para hacer una solución de polioxometalato de dos milímetros. Divida la solución POM en dos porciones de cinco mililitros. Utilice hidróxido de sodio de tres molares para ajustar el pH de una solución POM a 5.5.Para comenzar a prepararse para la prueba, ensamble la célula de ensayo de un aparato de electrofisiología de la bicapa de lípidos planos. En primer lugar, abrasar un alambre de plata con papel de lija de 600 granos y remojarlo en lejía a base de hipoclorito de sodio disponible comercialmente durante 10 minutos para hacer el electrodo de alambre de cloruro de plata plateada. Enjuague y seque el electrodo de alambre antes de insertarlo en el capilar de cuarzo del aparato.Mantenga el electrodo dentro de la membrana de cuarzo-nanoporo, o QNM, separando el capilar y el depósito. A continuación, coloque un electrodo de pellet de cloruro de plata y plata cilíndrico montado en un alambre de plata en el depósito. Conecte ambos electrodos a la placa de circuito del amplificador.A continuación, abra el programa de adquisición de datos e inicie la fuente de alimentación a cero milivoltios. Confirme que no se detecta corriente continua entre los electrodos de la celda vacía. Durante esta demostración es importante observar cómo la presión transcapilar puede afectar la formación de membranas y la posterior formación de nanoporos.Sin realizar estos dos pasos correctamente, los experimentos no funcionarán. Cargue alrededor de un mililitro de electrolito en una jeringa y conéctelo a la línea de fluido conectada al depósito. Añadir electrolito al depósito hasta que la cara del QNM esté sumergida, como indica la corriente iónica entre los electrodos que saturan el amplificador.Si el amplificador no se satura, desbloje el QNM aplicando una tensión de pop de más o menos voltios o aumentando la presión capilar en unos 300 milímetros de mercurio. Utilice ambas técnicas si es necesario. Una vez que el amplificador se satura, retire el electrolito del depósito hasta que los niveles de solución caigan por debajo del QNM, como indica la corriente que vuelve a cero.Para comenzar el proceso de formación de la bicaca lipídica, elevar el nivel de solución de electrolitos muy por encima de la cara del QNM y tenga en cuenta la cantidad de solución que tomó. A continuación, sumerja una punta de pipeta de 10 microlitiles en la solución DPHyPC y extraiga todos los lípidos visibles en la punta. Toque la punta de la pipeta a la superficie de la solución de electrolitos y permita que el lípido fluya desde la pipeta a través de la interfaz aire-agua.Espere de dos a cinco minutos para que el lípido se propague uniformemente a través de la solución. A continuación, retire lentamente el electrolito hasta que la superficie de la solución esté por debajo del QNM y luego agregue lentamente suficiente electrolito para elevar la solución por encima del QNM para formar la membrana bicapa lipídica aislante. Si la bicacapa no se forma después de tres intentos, aplique otra porción de lípidos como se describió anteriormente y repita el proceso.Una vez que la bicapa parece haberse formado, aumentar la presión al capilar para hacer estallar la bicapa y luego reformarla bajando lentamente y elevando el nivel de solución de la misma manera que antes. Repita este proceso varias veces para asegurarse de que el QNM no está obstruido y se ha formado una bicacapa. A continuación, descongelar una alícuota de proteína alfa de hemolysin sobre hielo o a temperatura ambiente.Llene el depósito con 250 nanogramos de proteína monomérica alfa hemólica y alrededor de 250 microlitros de agua ultrapura. Luego, aplica un sesgo de 200 a 400 milivoltios para inducir la formación de poros. Para facilitar la formación de poros, aumente la presión capilar de 40 a 200 milímetros de mercurio para expandir la bicaplaca desde el QNM.Una vez que se forma un nanoporo, reducir el sesgo aplicado a la tensión de medición y reducir la presión a aproximadamente la mitad de la presión de inserción. Para comenzar la prueba, reajuste el voltaje de compensación de CC para asegurarse de que no hay corriente medida cuando el potencial aplicado se establece en cero. A continuación, adquiera un rastro de corriente iónica para un potencial aplicado de 120 a 120 milivoltios negativos en relación con el depósito.Confirme que no hay contaminantes, que estarían indicados por bloqueos espontáneos de corriente. Agregue de uno a seis microlitros de pH 5,5 solución de racimo POM de dos mililitrolares al depósito. Aplique mediciones de serie temporal de corriente iónica a una tensión aplicada de 120 milivoltios negativos.El movimiento de moléculas individuales de ácido fosfotúntúnstico aniónico a través del canal alfa hemosalís produjo bloqueos transitorios que disminuyeron la corriente iónica media de poro abierto en aproximadamente un 80%La duración y la corriente de bloqueo están directamente relacionadas con la interacción partícula-poro, lo que permite diferenciar las especies iónicas en histogramas de las relaciones de profundidad de bloqueo relativo. A pH 5,5, se observaron dos picos con relaciones de profundidad de aproximadamente 0,06 y 0,16. Basado en la RMN de fósforo, el pico menor era la especie de fosfotungstate de seis menos y el pico principal era la especie de siete menos.A pH 7,5, las concentraciones relativas cambiaron a una proporción más alta de las especies de 6 menos a las especies de siete menos. La disminución de 20 veces en los eventos de bloqueo en relación con el pH 5.5 se atribuyó a la degradación de fosfato libre e iones tungstatos. La adaptación de las distribuciones de tiempo de residencia requería múltiples funciones exponenciales, lo que indica múltiples tipos de interacciones partícula-poro dentro de cada especie iónica.Los tiempos de residencia más cortos en pH 7,5 sugirieron interacciones partículas-poros más débiles que el pH 5.5, de acuerdo con estudios previos que mostraban cambios dependientes del pH en el número relativo de cargas fijas en o cerca del lumen del canal de hemolísina alfa. El agua desionizada de alta pureza es fundamental para esta configuración en particular. Un cartucho de filtro orgánico gastado fue la causa probable de que nuestro laboratorio no pudiera formar membranas en los QNM durante meses.Individuos nuevos en esta versión particular del método también podrían luchar porque las membranas son tan pequeñas y hay un truco para conseguir nanoporos para formar. Este método, iniciado hace varias décadas, ha demostrado ser útil para analizar iones, ácidos nucleicos y polímeros sintéticos, así como secuenciación de ADN. También podría encontrar aplicaciones en biofísica y biología celular básica.Por ejemplo, este procedimiento se puede utilizar para estudiar las propiedades físicas de los polímeros sintéticos y biopolímeros para investigar su tamaño, interacciones con otras moléculas y otras preguntas importantes.

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