Name: a high-throughput luciferase assay to evaluate proteolysis of the single-turnover protease pcsk9
Uploaded: 2018-08-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-Throughput Luciferase Assay to Evaluate Proteolysis of the Single-Turnover Protease PCSK9 at JoVE.com

Les auteurs remercient le généreux soutien financier du NHLBI/NIH (K08 HL124068 et LRP HMOT1243), NCATS/NIH par le biais de l’UCSF clinique et translationnelle Science Institute programme catalyseur (UL1 TR000004), le Sénat académique UCSF, la Fondation de Hellman, un Gilead Sciences Research Scholar Award, un prix cardiovasculaire de Pfizer ASPIRE (tout John S. Chorba) et le Howard Hughes Medical Institute (à Adri M. Galvan et Kevan M. Shokat).

1. mutagenèse du vecteur de la protéase
<ol><li>Conception et commande personnalisée-synthétisés oligonucléotides d’installer une mutation d’intérêt à l’aide d’une modification des protocoles de mutagenèse standard12. Des amorces de morue dessalées standards (sans purification supplémentaire) sont parfaitement acceptables. Remarque : Une approche générale aux conceptions de l’apprêt consiste à créer des amorces partiellement superposés comme indiqué au ta...

<ol>
	<li>Park, S. W., Moon, Y. A., Horton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcriptional+regulation+of+low+density+lipoprotein+receptor+protein+by+proprotein+convertase+subtilisin/kexin+type+9a+in+mouse+liver.">Post-transcriptional regulation of low density lipoprotein receptor protein by proprotein convertase subtilisin/kexin type 9a in mouse liver.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (48), 50630-50638 (2004).</li><li>Cohen, J. C., Boerwinkle, E., Mosley, T. H., Hobbs, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+variations+in+PCSK9,+low+LDL,+and+protection+against+coronary+heart+disease.">Sequence variations in PCSK9, low LDL, and protection against coronary heart disease.</a> New England Journal of Medicine. 354 (12), 1264-1272 (2006).</li><li>Ridker, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+Efficacy+and+Safety+of+Bococizumab+in+High-Risk+Patients.">Cardiovascular Efficacy and Safety of Bococizumab in High-Risk Patients.</a> New England Journal of Medicine. 376 (16), 1527-1539 (2017).</li><li>Sabatine, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolocumab+and+Clinical+Outcomes+in+Patients+with+Cardiovascular+Disease.">Evolocumab and Clinical Outcomes in Patients with Cardiovascular Disease.</a> New England Journal of Medicine. 376 (18), 1713-1722 (2017).</li><li>Kazi, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost-effectiveness+of+PCSK9+Inhibitor+Therapy+in+Patients+With+Heterozygous+Familial+Hypercholesterolemia+or+Atherosclerotic+Cardiovascular+Disease.">Cost-effectiveness of PCSK9 Inhibitor Therapy in Patients With Heterozygous Familial Hypercholesterolemia or Atherosclerotic Cardiovascular Disease.</a> Journal of the American Medical Association. 316 (7), 743-753 (2016).</li><li>Kazi, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Updated+Cost-effectiveness+Analysis+of+PCSK9+Inhibitors+Based+on+the+Results+of+the+FOURIER+Trial.">Updated Cost-effectiveness Analysis of PCSK9 Inhibitors Based on the Results of the FOURIER Trial.</a> Journal of the American Medical Association. 318 (8), (2017).</li><li>Pettersen, D., Fjellstr&#246;m, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+modulators+of+PCSK9+-+A+literature+and+patent+overview.">Small molecule modulators of PCSK9 - A literature and patent overview.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 28 (7), 1155-1160 (2018).</li><li>Chorba, J. S., Galvan, A. M., Shokat, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stepwise+processing+analyses+of+the+single-turnover+PCSK9+protease+reveal+its+substrate+sequence+specificity+and+link+clinical+genotype+to+lipid+phenotype.">Stepwise processing analyses of the single-turnover PCSK9 protease reveal its substrate sequence specificity and link clinical genotype to lipid phenotype.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (6), 1875-1886 (2018).</li><li>Maxwell, K. N., Breslow, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenoviral-mediated+expression+of+Pcsk9+in+mice+results+in+a+low-density+lipoprotein+receptor+knockout+phenotype.">Adenoviral-mediated expression of Pcsk9 in mice results in a low-density lipoprotein receptor knockout phenotype.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (18), 7100-7105 (2004).</li><li>Benjannet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NARC-1/PCSK9+and+its+natural+mutants:+zymogen+cleavage+and+effects+on+the+low+density+lipoprotein+(LDL)+receptor+and+LDL+cholesterol.">NARC-1/PCSK9 and its natural mutants: zymogen cleavage and effects on the low density lipoprotein (LDL) receptor and LDL cholesterol.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (47), 48865-48875 (2004).</li><li>Cunningham, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+biophysical+studies+of+PCSK9+and+its+mutants+linked+to+familial+hypercholesterolemia.">Structural and biophysical studies of PCSK9 and its mutants linked to familial hypercholesterolemia.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 14 (5), 413-419 (2007).</li><li>Liu, H., Naismith, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+one-step+site-directed+deletion,+insertion,+single+and+multiple-site+plasmid+mutagenesis+protocol.">An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol.</a> BMC Biotechnology. 8, 91 (2008).</li><li>Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Hall, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+luciferase+reporter+from+a+deep+sea+shrimp+utilizing+a+novel+imidazopyrazinone+substrate.">Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate.</a> ACS Chemical Biology. 7 (11), 1848-1857 (2012).</li><li>McNutt, M. C., Lagace, T. A., Horton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalytic+activity+is+not+required+for+secreted+PCSK9+to+reduce+low+density+lipoprotein+receptors+in+HepG2+cells.">Catalytic activity is not required for secreted PCSK9 to reduce low density lipoprotein receptors in HepG2 cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (29), 20799-20803 (2007).</li><li>Chorba, J. S., Shokat, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proprotein+convertase+subtilisin/kexin+type+9+(PCSK9)+active+site+and+cleavage+sequence+differentially+regulate+protein+secretion+from+proteolysis.">The proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) active site and cleavage sequence differentially regulate protein secretion from proteolysis.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (42), 29030-29043 (2014).</li><li>Benjannet, S., Rhainds, D., Hamelin, J., Nassoury, N., Seidah, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proprotein+convertase+(PC)+PCSK9+is+inactivated+by+furin+and/or+PC5/6A:+functional+consequences+of+natural+mutations+and+post-translational+modifications.">The proprotein convertase (PC) PCSK9 is inactivated by furin and/or PC5/6A: functional consequences of natural mutations and post-translational modifications.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30561-30572 (2006).</li><li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+loss-of-function+mutations+in+PCSK9+and+identification+of+a+compound+heterozygote.">Molecular characterization of loss-of-function mutations in PCSK9 and identification of a compound heterozygote.</a> American Journal of Human Genetics. 79 (3), 514-523 (2006).</li></ol>

Les procédures expérimentales décrites ci-dessus présentent une méthode pour surmonter l’intrinsèquement faible activité de la protéase de simple-chiffre d’affaires PCSK9 et évaluer sa fonction protéolytique de manière robuste. Le concept clé de l’analyse repose sur la conversion d’un événement unique-chiffre d’affaires en un affichage amplifié enzymatiquement. Les points forts de l’analyse sont relativement court délai et facilité d’utilisation de la luciférase journaliste, ainsi que son ...

PCSK9 cible le récepteur des LDL (LDL-R) pour la dégradation, élever le taux de cholestérol LDL (LDL-C) et la conduite de maladie cardiaque athéroscléreuse1,2. PCSK9 ciblage thérapeutique solidement abaisser le LDL-C et améliorer les effets cardiovasculaires des patients, même quand on ajoute un traitement hypolipidémiant agressif avec statines3,4. Cependant, thérapies actuellement approuvées se limitent aux approches axées sur les anticorps et souffrent d’un manque de rentabilité de5,6. Pour résoudre ce problème, les alternatives thérapeutiques moins coûteux, un moyen d’identifier les patients susceptibles de gagner le plus d’avantages, ou les deux, sont nécessaires.
Approches de petit-molécule pourraient cibler PCSK9 intracellulaire, fournir une meilleure voie d’administration et réduire les coûts, rendant le « Saint Graal » dans cette zone7. Cependant, PCSK9 s’avère difficile à drogue de petites molécules. Comme une protéase, ciblant la fonction protéolytique de PCSK9 est une stratégie séduisante, comme self-protéolyse est l’étape cinétiquement limitante de PCSK9 maturation8 et est requise pour son effet maximal sur le LDL-R9. A ce jour, cependant, cette stratégie n’a pas été couronnée de succès, probablement en raison de la biochimie unique de PCSK9 : PCSK9 seulement se fend10, effectuant une réaction de simple-chiffre d’affaires, et après soi-clivage, la PCSK9 prodomain demeure lié au site actif comme une auto-inhibiteur11, empêchant l’affichage de toute autre activité de la protéase.
Cet article présente une méthode pour évaluer la fonction protéolytique PCSK9 en mode haut débit8. Par le biais de mutagenèse dirigée, enquêteurs peuvent utiliser ce test pour sonder les effets du codage SNP dans la clinique afin d’évaluer les effets sur la protéolyse, l’étape cinétiquement limitante de PCSK9 maturation. En outre, cette méthode sera utile dans la conception d’écrans de haut débit afin d’identifier des modulateurs de la protéolyse de PCSK9, qui devraient finalement perturbent la présentation de PCSK9 du LDL-r (et moduler l’effet hypercholestérolémiant de PCSK9) . Enfin, ce protocole peut être adapté aux autres protéases avec intrinsèquement faible activité, pourvu que i) une paire de substrat-protéase spécifique se retrouve, et ii) un point d’ancrage intracellulaire approprié peut être établi pour le substrat.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PCR Tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-2900</td>
			<td>For PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Hot Start</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0493L</td>
			<td>High-fidelity DNA Polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxynucleotide Solution Mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0447L</td>
			<td>dNTPs (for PCR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pPCSK9-NLucProteaseAssay-WT</td>
			<td>Authors</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Available from authors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386A</td>
			<td>Authors</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Available from authors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose LE</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>A-201-100</td>
			<td>For DNA gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-Gel Imager System with Blue Light Base</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4466612</td>
			<td>For imaging DNA gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S33102</td>
			<td>For DNA gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td>For DNA gel running buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A38-500</td>
			<td>For DNA gel running buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>3690</td>
			<td>EDTA, for DNA gel running buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 kb DNA ladder</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>D010</td>
			<td>DNA ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0176S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar plates with 100 &#181;g/mL carbenicillin</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>L1010</td>
			<td>LB-Carb plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot Mach1 T Phage-Resistent Chemically Competent E. coli</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C862003</td>
			<td>Chemically competent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, Miller</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td>LB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>C-103-5</td>
			<td>Selective antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I</td>
			<td>Omega BioTek</td>
			<td>D6942-02</td>
			<td>DNA Purification Miniprep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000 Spectrophotomer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-2000C</td>
			<td>Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T Cells</td>
			<td>American Tissue Culture Collection (ATCC)</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>HEK 293T cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, pyruvate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11995065</td>
			<td>DMEM, mammalian cell media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Sera</td>
			<td>Axenia Biologix</td>
			<td>F001</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25300062</td>
			<td>Trypsin, for cell dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess automated cell counter</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C10227</td>
			<td>Automated cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess cell counting chamber slides</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td>Slides for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR Tissue Culture Plates, White, White-Bottom, with Lid</td>
			<td>Grenier Bio-One</td>
			<td>655083</td>
			<td>White, white-bottom 96 well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TempPlate non-skirted 96-well PCR plate, natural</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-9596</td>
			<td>96 well plate for master plasmid plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 2.0mL DeepWell Plates</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>278743</td>
			<td>96 well deep well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L3000008</td>
			<td>Lipid transfection reagent, Lf3K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P3000 Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L3000008</td>
			<td>DNA pre-complexation reagent, provided with Lf3K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31985062</td>
			<td>Reduced serum medium for transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(+)-Sodium L-ascorbate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A4034</td>
			<td>Sodium ascorbate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin, Bovine Serum, Fraction V, Low Heavy Metals</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>12659</td>
			<td>BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (HPLC)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A4524</td>
			<td>MeOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JT9535-2</td>
			<td>Concentrated HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coelenterazine</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>CZ2.5</td>
			<td>Luciferase substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter, Sterile</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>09-720-3</td>
			<td>Sterile filter, PVDF, 0.22 &#181;m pore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17013810</td>
			<td>Multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17013808</td>
			<td>Multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite Multi Pipette L12-10XLS+</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17013807</td>
			<td>Multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent reservoir</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4870</td>
			<td>Trough for reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 15 mL</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>05-539-12</td>
			<td>15 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 50 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td>50 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spark Microplate Reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>N/a</td>
			<td>Plate Reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>2016 for Mac</td>
			<td>Spreadsheet software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>v7</td>
			<td>Scientific data analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput luciferase assay to evaluate proteolysis of the single-turnover protease pcsk9

Proprotéine convertase subtilisine/kexin type 9 (PCSK9) est une protéase de simple-chiffre d’affaires qui régule le taux de lipoprotéines de basse densité (LDL) de sérum et, par conséquent, les maladies cardiovasculaires. Bien que PCSK9 protéolyse est nécessaire pour son effet hypercholestérolémique complet, l’évaluation de sa fonction protéolytique est difficile : PCSK9 est connue uniquement en conjonction avec elle-même, subit une seul un chiffre d’affaires unique et après protéolyse, conserve son substrat dans son site actif comme auto-inhibiteur. Les méthodes présentées ici décrivent un test qui permet de surmonter ces défis. Le test se concentre sur la protéolyse intermoléculaire dans un contexte de base de cellules et clivage réussie de liens à l’activité de la luciférase sécrétées, qui peut être lues facilement dans le milieu conditionné. Via les étapes séquentielles de la mutagenèse, transfection transitoire et une lecture de la luciférase, le dosage peut sonder PCSK9 protéolyse dans des conditions d’une perturbation soit génétique ou moléculaire de manière haut débit. Ce système est bien adapté pour les deux l’évaluation biochimique des faux-sens cliniquement découverte single-nucléotides simples (SNP), ainsi que pour le dépistage des inhibiteurs de petites molécules de PCSK9 protéolyse.

Le dosage de la protéolyse du haut débit dépend de surmonter trois défis majeurs. Tout d’abord, pour pallier la sortie intrinsèquement faible d’une protéase de PCSK9 single-chiffre d’affaires, une protéase de PCSK9 manque l’inhibiteur prodomain sert, avec la séquence de clivage à la queue de le prodomain liée à une luciférase qui peut être sécrétées14. Deuxièmement, pour répondre au besoin de la protéase à plier complexe avec ses inhibit...

Watch this Scientific Journal Video about A High-Throughput Luciferase Assay to Evaluate Proteolysis of the Single-Turnover Protease PCSK9 at JoVE.com

A High-Throughput Luciferase Assay to Evaluate Proteolysis of the Single-Turnover Protease PCSK9

Un haut débit de luciferase pour évaluer la protéolyse de la PCSK9 protéase de simple-chiffre d’affaires

Ce protocole présente une méthode pour évaluer l’activité protéolytique d’une protéase intrinsèquement peu fréquentés, seul chiffre d’affaires dans un contexte cellulaire. Plus précisément, cette méthode est appliquée pour évaluer l’activité protéolytique de PCSK9, un facteur clé du métabolisme lipidique, dont l’activité protéolytique est requise pour sa fonction ultime hypercholestérolémique.

Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) is a single-turnover protease which regulates serum low-density lipoprotein (LDL) levels and, ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

Criblage à haut débit d&#39;Enzymes Glucides dégradant Utilisation Novel Insoluble chromogénique Substrat Assay Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Recherche

Biochimie

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Procédé pour l&#39;identification d&#39;inhibiteurs de petites molécules de l&#39;interaction protéine-protéine entre HCN1 et TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

Une seule molécule Simple, robuste et haut débit débit étirement test mise en place pour étudier le Transport de molécules le long de l’ADN

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Une méthode Simple pour le criblage à haut débit chimique chez Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Utilisation des protéines de Fusion recombinantes dans une plate-forme de test de protéase Fluorescent et leur Renaturation en gel

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

Reconnaissance de séquence d'ADN par primase d'ADN utilisant le profilage primase à haut débit

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

Adaptation semi-haute débit de l'analyse ATPase couplée au NADH pour le dépistage des petits inhibiteurs des molécules

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

Fluorescence interne totale de réflexion à haut débit et microscopie optique stochastique directe de reconstruction utilisant une puce photonique

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening

Dosage fluorométrique basé sur la chimie Clic pour l’apolipoprotéine N-acyltransférase de la caractérisation enzymatique au criblage à haut débit

Lipoproteins from proteobacteria are posttranslationally modified by fatty acids derived from membrane phospholipids by the action of three integral ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...