Name: a high-throughput luciferase assay to evaluate proteolysis of the single-turnover protease pcsk9
Uploaded: 2018-08-28T15:00:00
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Os autores graças ao apoio generoso financiamento do NHLBI/NIH (K08 HL124068 e LRP HMOT1243), NCATS/NIH através da UCSF clínica e translacional ciência Instituto catalisador programa (UL1 TR000004), o Senado académico UCSF, a Fundação de Hellman, um Gilead Sciences Research Scholar Award, um prêmio Pfizer ASPIRE Cardiovascular (todos John S. Chorba) e do Howard Hughes Medical Institute (para Adri M. Galvan e Kevan M. Shokat).

1. local-dirigido Mutagenesis de Protease Vector
<ol><li>Design e ordem personalizada-sintetizados oligonucleotides instalar uma mutação de interesse usando uma modificação do padrão mutagenesis local-dirigido protocolos12. Norma primeiras demão demolhadas (sem purificação adicional) são perfeitamente aceitáveis. Nota: Uma abordagem geral para projetos cartilha envolve a criação de cartilhas parcialmente sobrepostas conforme indicado na tabela 1, usando uma calcul...

<ol>
	<li>Park, S. W., Moon, Y. A., Horton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcriptional+regulation+of+low+density+lipoprotein+receptor+protein+by+proprotein+convertase+subtilisin/kexin+type+9a+in+mouse+liver.">Post-transcriptional regulation of low density lipoprotein receptor protein by proprotein convertase subtilisin/kexin type 9a in mouse liver.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (48), 50630-50638 (2004).</li><li>Cohen, J. C., Boerwinkle, E., Mosley, T. H., Hobbs, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+variations+in+PCSK9,+low+LDL,+and+protection+against+coronary+heart+disease.">Sequence variations in PCSK9, low LDL, and protection against coronary heart disease.</a> New England Journal of Medicine. 354 (12), 1264-1272 (2006).</li><li>Ridker, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+Efficacy+and+Safety+of+Bococizumab+in+High-Risk+Patients.">Cardiovascular Efficacy and Safety of Bococizumab in High-Risk Patients.</a> New England Journal of Medicine. 376 (16), 1527-1539 (2017).</li><li>Sabatine, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolocumab+and+Clinical+Outcomes+in+Patients+with+Cardiovascular+Disease.">Evolocumab and Clinical Outcomes in Patients with Cardiovascular Disease.</a> New England Journal of Medicine. 376 (18), 1713-1722 (2017).</li><li>Kazi, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost-effectiveness+of+PCSK9+Inhibitor+Therapy+in+Patients+With+Heterozygous+Familial+Hypercholesterolemia+or+Atherosclerotic+Cardiovascular+Disease.">Cost-effectiveness of PCSK9 Inhibitor Therapy in Patients With Heterozygous Familial Hypercholesterolemia or Atherosclerotic Cardiovascular Disease.</a> Journal of the American Medical Association. 316 (7), 743-753 (2016).</li><li>Kazi, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Updated+Cost-effectiveness+Analysis+of+PCSK9+Inhibitors+Based+on+the+Results+of+the+FOURIER+Trial.">Updated Cost-effectiveness Analysis of PCSK9 Inhibitors Based on the Results of the FOURIER Trial.</a> Journal of the American Medical Association. 318 (8), (2017).</li><li>Pettersen, D., Fjellstr&#246;m, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+modulators+of+PCSK9+-+A+literature+and+patent+overview.">Small molecule modulators of PCSK9 - A literature and patent overview.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 28 (7), 1155-1160 (2018).</li><li>Chorba, J. S., Galvan, A. M., Shokat, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stepwise+processing+analyses+of+the+single-turnover+PCSK9+protease+reveal+its+substrate+sequence+specificity+and+link+clinical+genotype+to+lipid+phenotype.">Stepwise processing analyses of the single-turnover PCSK9 protease reveal its substrate sequence specificity and link clinical genotype to lipid phenotype.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (6), 1875-1886 (2018).</li><li>Maxwell, K. N., Breslow, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenoviral-mediated+expression+of+Pcsk9+in+mice+results+in+a+low-density+lipoprotein+receptor+knockout+phenotype.">Adenoviral-mediated expression of Pcsk9 in mice results in a low-density lipoprotein receptor knockout phenotype.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (18), 7100-7105 (2004).</li><li>Benjannet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NARC-1/PCSK9+and+its+natural+mutants:+zymogen+cleavage+and+effects+on+the+low+density+lipoprotein+(LDL)+receptor+and+LDL+cholesterol.">NARC-1/PCSK9 and its natural mutants: zymogen cleavage and effects on the low density lipoprotein (LDL) receptor and LDL cholesterol.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (47), 48865-48875 (2004).</li><li>Cunningham, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+biophysical+studies+of+PCSK9+and+its+mutants+linked+to+familial+hypercholesterolemia.">Structural and biophysical studies of PCSK9 and its mutants linked to familial hypercholesterolemia.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 14 (5), 413-419 (2007).</li><li>Liu, H., Naismith, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+one-step+site-directed+deletion,+insertion,+single+and+multiple-site+plasmid+mutagenesis+protocol.">An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol.</a> BMC Biotechnology. 8, 91 (2008).</li><li>Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Hall, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+luciferase+reporter+from+a+deep+sea+shrimp+utilizing+a+novel+imidazopyrazinone+substrate.">Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate.</a> ACS Chemical Biology. 7 (11), 1848-1857 (2012).</li><li>McNutt, M. C., Lagace, T. A., Horton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalytic+activity+is+not+required+for+secreted+PCSK9+to+reduce+low+density+lipoprotein+receptors+in+HepG2+cells.">Catalytic activity is not required for secreted PCSK9 to reduce low density lipoprotein receptors in HepG2 cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (29), 20799-20803 (2007).</li><li>Chorba, J. S., Shokat, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proprotein+convertase+subtilisin/kexin+type+9+(PCSK9)+active+site+and+cleavage+sequence+differentially+regulate+protein+secretion+from+proteolysis.">The proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) active site and cleavage sequence differentially regulate protein secretion from proteolysis.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (42), 29030-29043 (2014).</li><li>Benjannet, S., Rhainds, D., Hamelin, J., Nassoury, N., Seidah, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proprotein+convertase+(PC)+PCSK9+is+inactivated+by+furin+and/or+PC5/6A:+functional+consequences+of+natural+mutations+and+post-translational+modifications.">The proprotein convertase (PC) PCSK9 is inactivated by furin and/or PC5/6A: functional consequences of natural mutations and post-translational modifications.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30561-30572 (2006).</li><li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+loss-of-function+mutations+in+PCSK9+and+identification+of+a+compound+heterozygote.">Molecular characterization of loss-of-function mutations in PCSK9 and identification of a compound heterozygote.</a> American Journal of Human Genetics. 79 (3), 514-523 (2006).</li></ol>

Os procedimentos experimentais descritos acima apresentam um método para superar a intrinsecamente baixa atividade de protease a single-volume de negócios PCSK9 e avaliar sua função proteolítica de forma robusta. O conceito-chave do ensaio depende de conversão de um evento único-volume de negócios em uma leitura enzimaticamente amplificada. Os pontos fortes do ensaio incluem o prazo relativamente curto e facilidade de uso do repórter do luciferase, bem como sua capacidade de expansão para abordagens de alto ren...

PCSK9 metas o receptor de LDL (LDL-R) para degradação, aumentando o LDL colesterol (LDL-C) e conduzir a doença aterosclerótica do coração1,2. Terapêutica alvo PCSK9 robustamente abaixar o LDL-C e melhorar resultados cardiovasculares para pacientes, mesmo quando adicionado a uma terapia agressiva hipolipemiantes com estatinas3,4. Terapias actualmente aprovadas limitam-se a abordagens baseadas em anticorpos, no entanto e sofrem com a falta de rentabilidade5,6. Para resolver este problema, alternativas terapêuticas menos onerosos, um meio para identificar pacientes propensos a obter maiores benefícios, ou ambos, são necessários.
Abordagens da pequeno-molécula poderiam alvo PCSK9 intracelular, fornecer uma melhor via de administração e reduzir custos, tornando-o "Santo Graal" nesta zona7. No entanto, PCSK9 provou difícil de drogas por pequenas moléculas. Como uma protease, direcionamento função proteolítica do PCSK9 é uma estratégia atraente, como autoproteólise é a etapa limitante de PCSK9 maturação8 e é necessário para o seu máximo efeito no LDL-R9. Até à data, no entanto, esta estratégia não teve êxito, provavelmente devido a bioquímica exclusiva do PCSK9: PCSK9 apenas se fende10, realizando uma reação de single-volume de negócios, e depois autoclivagem, o PCSK9 prodomínio permanece ligado no sítio activo como um autoinibidor11, impedindo a leitura de qualquer atividade de protease mais.
Este artigo apresenta um método para avaliar PCSK9 função proteolítica na moda do elevado-throughput8. Através do mutagenesis local-dirigido, investigadores podem usar este teste para investigar os efeitos da codificação SNPs encontrados na clínica para avaliar os efeitos na proteólise, a etapa limitante de maturação PCSK9. Além disso, este método será útil no design de telas de alta produtividade para identificar moduladores de PCSK9 proteólise, que são antecipadas para, finalmente, interromper a apresentação de PCSK9 ao LDL-r (e modulam hipercolesterolêmicos efeito do PCSK9) . Por último, este protocolo pode ser adaptado para outras proteases com intrinsecamente baixa atividade, desde que i) um par de substrato-protease específico pode ser encontrado, e ii) uma âncora intracelular adequada pode ser estabelecida para o substrato.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PCR Tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-2900</td>
			<td>For PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Hot Start</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0493L</td>
			<td>High-fidelity DNA Polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxynucleotide Solution Mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0447L</td>
			<td>dNTPs (for PCR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pPCSK9-NLucProteaseAssay-WT</td>
			<td>Authors</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Available from authors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386A</td>
			<td>Authors</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Available from authors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose LE</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>A-201-100</td>
			<td>For DNA gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-Gel Imager System with Blue Light Base</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4466612</td>
			<td>For imaging DNA gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S33102</td>
			<td>For DNA gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td>For DNA gel running buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A38-500</td>
			<td>For DNA gel running buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>3690</td>
			<td>EDTA, for DNA gel running buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 kb DNA ladder</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>D010</td>
			<td>DNA ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0176S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar plates with 100 &#181;g/mL carbenicillin</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>L1010</td>
			<td>LB-Carb plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot Mach1 T Phage-Resistent Chemically Competent E. coli</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C862003</td>
			<td>Chemically competent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, Miller</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td>LB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>C-103-5</td>
			<td>Selective antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I</td>
			<td>Omega BioTek</td>
			<td>D6942-02</td>
			<td>DNA Purification Miniprep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000 Spectrophotomer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-2000C</td>
			<td>Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T Cells</td>
			<td>American Tissue Culture Collection (ATCC)</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>HEK 293T cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, pyruvate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11995065</td>
			<td>DMEM, mammalian cell media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Sera</td>
			<td>Axenia Biologix</td>
			<td>F001</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25300062</td>
			<td>Trypsin, for cell dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess automated cell counter</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C10227</td>
			<td>Automated cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess cell counting chamber slides</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td>Slides for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR Tissue Culture Plates, White, White-Bottom, with Lid</td>
			<td>Grenier Bio-One</td>
			<td>655083</td>
			<td>White, white-bottom 96 well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TempPlate non-skirted 96-well PCR plate, natural</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-9596</td>
			<td>96 well plate for master plasmid plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 2.0mL DeepWell Plates</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>278743</td>
			<td>96 well deep well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L3000008</td>
			<td>Lipid transfection reagent, Lf3K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P3000 Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L3000008</td>
			<td>DNA pre-complexation reagent, provided with Lf3K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31985062</td>
			<td>Reduced serum medium for transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(+)-Sodium L-ascorbate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A4034</td>
			<td>Sodium ascorbate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin, Bovine Serum, Fraction V, Low Heavy Metals</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>12659</td>
			<td>BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (HPLC)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A4524</td>
			<td>MeOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JT9535-2</td>
			<td>Concentrated HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coelenterazine</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>CZ2.5</td>
			<td>Luciferase substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter, Sterile</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>09-720-3</td>
			<td>Sterile filter, PVDF, 0.22 &#181;m pore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17013810</td>
			<td>Multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17013808</td>
			<td>Multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite Multi Pipette L12-10XLS+</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17013807</td>
			<td>Multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent reservoir</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4870</td>
			<td>Trough for reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 15 mL</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>05-539-12</td>
			<td>15 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 50 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td>50 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spark Microplate Reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>N/a</td>
			<td>Plate Reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>2016 for Mac</td>
			<td>Spreadsheet software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>v7</td>
			<td>Scientific data analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput luciferase assay to evaluate proteolysis of the single-turnover protease pcsk9

Proprotein convertase subtilisina/kexin tipo 9 (PCSK9) é uma protease de single-volume de negócios que regula os níveis de lipoproteína de baixa densidade (LDL) de soro e, consequentemente, as doenças cardiovasculares. Embora PCSK9 proteólise é necessária para seu efeito completo hipercolesterolêmicos, a avaliação da sua função proteolítica é desafiador: PCSK9 só é conhecido para decompor-se, submete-se apenas um único volume de negócios e após proteólise, retém seu substrato em seu sítio ativo como um inibidor de auto. Os métodos apresentados aqui descrevem um ensaio que supera esses desafios. O ensaio centra-se na proteólise intermolecular em um contexto de baseada em célula e decote bem sucedida de ligações para a atividade de luciferase secretada, que pode ser facilmente lido para fora no meio de condicionado. Através de etapas sequenciais de mutagénese, transfecção transiente e uma leitura de luciferase, o ensaio pode sonda PCSK9 proteólise em condições de perturbação genética ou molecular de forma de alta produtividade. Este sistema é adequado para ambos avaliação bioquímica de missense clinicamente descobertos single-nucleotide polimorfismos (SNPs), bem como quanto a triagem de inibidores da pequeno-molécula de proteólise PCSK9.

O ensaio de proteólise de alto rendimento depende de superar três grandes desafios. Primeiro, para superar a saída intrinsecamente baixa de uma protease de PCSK9 single-volume de negócios, uma protease PCSK9 falta o inibitório prodomínio é usado, com a sequência de clivagem na cauda do prodomínio ligada a um luciferase que pode ser secretada14. Em segundo lugar, para satisfazer a necessidade da protease de dobrar em complexo com sua inibitório prodomínio...

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A High-Throughput Luciferase Assay to Evaluate Proteolysis of the Single-Turnover Protease PCSK9

Um ensaio de Luciferase de alto rendimento para avaliar a proteólise de PCSK9 a Protease Single-volume de negócios

Este protocolo apresenta um método para avaliar a atividade proteolítica de uma protease de baixa atividade intrinsecamente, único volume de negócios em um contexto celular. Especificamente, esse método é aplicado para avaliar a atividade proteolítica de PCSK9, um motor essencial do metabolismo lipídico, cuja atividade proteolítica é necessária para sua função final hipercolesterolêmicos.

Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) is a single-turnover protease which regulates serum low-density lipoprotein (LDL) levels and, ...

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