Name: a high-throughput luciferase assay to evaluate proteolysis of the single-turnover protease pcsk9
Uploaded: 2018-08-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-Throughput Luciferase Assay to Evaluate Proteolysis of the Single-Turnover Protease PCSK9 at JoVE.com

Yazarlar NHLBI/NIH (K08 HL124068 ve LRP HMOT1243), NCATS/NIH UCSF klinik ve çevirim Bilim Enstitüsü Catalyst programı (UL1 TR000004), UCSF akademik Senato Hellman Vakfı aracılığıyla cömert finansman desteğinden teşekkür bir Gilead Sciences araştırma bilim adamı Ödülü, bir Pfizer ASPIRE kardiyovasküler Ödülü (tüm John S. Chorba) ve Howard Hughes Tıp Enstitüsü (için Adri M. Galvan ve Kevan M. Shokat).

1. site yönettiği Mutagenesis proteaz vektör
<ol><li>Bir mutasyon ilgi standart site yönettiği mutagenesis protokolleri12bir değişiklik kullanarak yüklemek için tasarım ve düzen özel sentez oligonucleotides. (Olmadan ek arıtma) standart desalted astar tamamen kabul edilebilir. Not: Astar tasarımlar için genel bir yaklaşım faiz polimeraz için belirli bir erime sıcaklık (Tm) hesaplama kullanarak Tablo 1, gösterildiği gibi kısmen üst üste asta...

<ol>
	<li>Park, S. W., Moon, Y. A., Horton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcriptional+regulation+of+low+density+lipoprotein+receptor+protein+by+proprotein+convertase+subtilisin/kexin+type+9a+in+mouse+liver.">Post-transcriptional regulation of low density lipoprotein receptor protein by proprotein convertase subtilisin/kexin type 9a in mouse liver.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (48), 50630-50638 (2004).</li><li>Cohen, J. C., Boerwinkle, E., Mosley, T. H., Hobbs, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+variations+in+PCSK9,+low+LDL,+and+protection+against+coronary+heart+disease.">Sequence variations in PCSK9, low LDL, and protection against coronary heart disease.</a> New England Journal of Medicine. 354 (12), 1264-1272 (2006).</li><li>Ridker, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+Efficacy+and+Safety+of+Bococizumab+in+High-Risk+Patients.">Cardiovascular Efficacy and Safety of Bococizumab in High-Risk Patients.</a> New England Journal of Medicine. 376 (16), 1527-1539 (2017).</li><li>Sabatine, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolocumab+and+Clinical+Outcomes+in+Patients+with+Cardiovascular+Disease.">Evolocumab and Clinical Outcomes in Patients with Cardiovascular Disease.</a> New England Journal of Medicine. 376 (18), 1713-1722 (2017).</li><li>Kazi, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost-effectiveness+of+PCSK9+Inhibitor+Therapy+in+Patients+With+Heterozygous+Familial+Hypercholesterolemia+or+Atherosclerotic+Cardiovascular+Disease.">Cost-effectiveness of PCSK9 Inhibitor Therapy in Patients With Heterozygous Familial Hypercholesterolemia or Atherosclerotic Cardiovascular Disease.</a> Journal of the American Medical Association. 316 (7), 743-753 (2016).</li><li>Kazi, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Updated+Cost-effectiveness+Analysis+of+PCSK9+Inhibitors+Based+on+the+Results+of+the+FOURIER+Trial.">Updated Cost-effectiveness Analysis of PCSK9 Inhibitors Based on the Results of the FOURIER Trial.</a> Journal of the American Medical Association. 318 (8), (2017).</li><li>Pettersen, D., Fjellstr&#246;m, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+modulators+of+PCSK9+-+A+literature+and+patent+overview.">Small molecule modulators of PCSK9 - A literature and patent overview.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 28 (7), 1155-1160 (2018).</li><li>Chorba, J. S., Galvan, A. M., Shokat, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stepwise+processing+analyses+of+the+single-turnover+PCSK9+protease+reveal+its+substrate+sequence+specificity+and+link+clinical+genotype+to+lipid+phenotype.">Stepwise processing analyses of the single-turnover PCSK9 protease reveal its substrate sequence specificity and link clinical genotype to lipid phenotype.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (6), 1875-1886 (2018).</li><li>Maxwell, K. N., Breslow, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenoviral-mediated+expression+of+Pcsk9+in+mice+results+in+a+low-density+lipoprotein+receptor+knockout+phenotype.">Adenoviral-mediated expression of Pcsk9 in mice results in a low-density lipoprotein receptor knockout phenotype.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (18), 7100-7105 (2004).</li><li>Benjannet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NARC-1/PCSK9+and+its+natural+mutants:+zymogen+cleavage+and+effects+on+the+low+density+lipoprotein+(LDL)+receptor+and+LDL+cholesterol.">NARC-1/PCSK9 and its natural mutants: zymogen cleavage and effects on the low density lipoprotein (LDL) receptor and LDL cholesterol.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (47), 48865-48875 (2004).</li><li>Cunningham, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+biophysical+studies+of+PCSK9+and+its+mutants+linked+to+familial+hypercholesterolemia.">Structural and biophysical studies of PCSK9 and its mutants linked to familial hypercholesterolemia.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 14 (5), 413-419 (2007).</li><li>Liu, H., Naismith, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+one-step+site-directed+deletion,+insertion,+single+and+multiple-site+plasmid+mutagenesis+protocol.">An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol.</a> BMC Biotechnology. 8, 91 (2008).</li><li>Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Hall, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+luciferase+reporter+from+a+deep+sea+shrimp+utilizing+a+novel+imidazopyrazinone+substrate.">Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate.</a> ACS Chemical Biology. 7 (11), 1848-1857 (2012).</li><li>McNutt, M. C., Lagace, T. A., Horton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalytic+activity+is+not+required+for+secreted+PCSK9+to+reduce+low+density+lipoprotein+receptors+in+HepG2+cells.">Catalytic activity is not required for secreted PCSK9 to reduce low density lipoprotein receptors in HepG2 cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (29), 20799-20803 (2007).</li><li>Chorba, J. S., Shokat, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proprotein+convertase+subtilisin/kexin+type+9+(PCSK9)+active+site+and+cleavage+sequence+differentially+regulate+protein+secretion+from+proteolysis.">The proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) active site and cleavage sequence differentially regulate protein secretion from proteolysis.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (42), 29030-29043 (2014).</li><li>Benjannet, S., Rhainds, D., Hamelin, J., Nassoury, N., Seidah, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proprotein+convertase+(PC)+PCSK9+is+inactivated+by+furin+and/or+PC5/6A:+functional+consequences+of+natural+mutations+and+post-translational+modifications.">The proprotein convertase (PC) PCSK9 is inactivated by furin and/or PC5/6A: functional consequences of natural mutations and post-translational modifications.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30561-30572 (2006).</li><li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+loss-of-function+mutations+in+PCSK9+and+identification+of+a+compound+heterozygote.">Molecular characterization of loss-of-function mutations in PCSK9 and identification of a compound heterozygote.</a> American Journal of Human Genetics. 79 (3), 514-523 (2006).</li></ol>

Yukarıda açıklanan deneysel prosedürler tek-ciro proteaz PCSK9 özünde düşük etkinlik üstesinden gelmek ve proteolitik işlevini sağlam bir şekilde değerlendirmek için bir yöntem mevcut. Tahlil anahtar kavramı enzimatik güçlendirilmiş bir okuma bir tek-ciro olay dönüştürme üzerine dayanır. Güçlü bir tahlil nispeten kısa zaman dilimi ve rahatlık-in kullanma luciferase muhabir, hem de onun ölçeklenebilirliği yüksek üretilen iş yaklaşımlara içerir. Buna ek olarak, tahlil proteolizis onu...

PCSK9 hedefi LDL reseptör (LDL-R) bozulması için LDL kolesterol (LDL-C) yükselterek ve aterosklerotik kalp hastalığı1,2sürüş. Tedavi hedefleme PCSK9 sağlam LDL-C daha düşük ve kardiyovasküler sonuçlar hastalar için bile bir saldırgan lipid düşürücü tedavi statinler3,4ile eklendiğinde geliştirmek. Şu anda onaylanmış tedaviler antikor tabanlı yaklaşımlar, sınırlı ancak ve maliyet-etkililik5,6bir eksikliği muzdarip. Bu sorunu çözmek için daha az maliyetli tedavi alternatifleri, hastalar daha büyük yararlar elde etmek büyük olasılıkla tanımlamak için bir yol ya da her ikisi, gereklidir.
Küçük molekül yaklaşımlar hücre içi PCSK9 hedef, geliştirilmiş bir rota yönetim sağlamak ve onları yapma "Kutsal kase" içinde bu alan7maliyetleri azaltmak. Ancak, PCSK9 küçük moleküller tarafından uyuşturucu için zor kanıtlamıştır. Öz-proteolizis PCSK9 olgunlaşma8 hızı sınırlaması adım ve LDL-R9üzerindeki maksimal etkisi için gerekli gibi bir proteaz PCSK9'ın proteolitik işlevi hedefleme çekici bir strateji vardır. Bugüne kadar ancak, bu strateji büyük olasılıkla PCSK9'ın benzersiz Biyokimya nedeniyle başarılı olmamıştır: PCSK9 cleaves yalnızca kendisini10, bir tek-ciro tepki gerçekleştirme ve öz-bölünme sonra prodomain PCSK9 aktif bölgesinde bağlı kalır bir herhangi bir daha fazla proteaz aktivitesinin okuma engelleyen otomatik inhibitörü11.
Bu makale PCSK9 proteolitik işlevi yüksek üretilen iş moda8değerlendirmek için bir yöntem sunar. Site yönettiği mutagenesis Müfettişler bu tahlil onları proteolizis, PCSK9 olgunlaşma hızı sınırlaması adım üzerindeki etkileri için değerlendirmek için klinikte buldum SNPs kodlama etkilerini araştırmak için kullanabilirsiniz. Ayrıca, bu yöntem hangi sonuçta LDL-r PCSK9 sunumunu bozabilir (ve PCSK9'ın hypercholesterolemic etkisi modüle için) beklenen PCSK9 proteolizis, modülatörler tanımlamak için yüksek üretilen iş ekranlar tasarımında yararlı olacaktır . Son olarak, i) bir belirli substrat-proteaz çift bulunabilir ve uygun II) bir hücre içi bağlantı için belgili tanımlık substrate kurulabilir koşuluyla bu iletişim kuralı ile özünde düşük etkinlik, diğer proteaz için adapte edilebilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PCR Tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-2900</td>
			<td>For PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 Hot Start</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0493L</td>
			<td>High-fidelity DNA Polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxynucleotide Solution Mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0447L</td>
			<td>dNTPs (for PCR)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pPCSK9-NLucProteaseAssay-WT</td>
			<td>Authors</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Available from authors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386A</td>
			<td>Authors</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Available from authors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose LE</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>A-201-100</td>
			<td>For DNA gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-Gel Imager System with Blue Light Base</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4466612</td>
			<td>For imaging DNA gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S33102</td>
			<td>For DNA gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td>For DNA gel running buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A38-500</td>
			<td>For DNA gel running buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>3690</td>
			<td>EDTA, for DNA gel running buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 kb DNA ladder</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>D010</td>
			<td>DNA ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0176S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar plates with 100 &#181;g/mL carbenicillin</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>L1010</td>
			<td>LB-Carb plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot Mach1 T Phage-Resistent Chemically Competent E. coli</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C862003</td>
			<td>Chemically competent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, Miller</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td>LB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>C-103-5</td>
			<td>Selective antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I</td>
			<td>Omega BioTek</td>
			<td>D6942-02</td>
			<td>DNA Purification Miniprep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000 Spectrophotomer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-2000C</td>
			<td>Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T Cells</td>
			<td>American Tissue Culture Collection (ATCC)</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>HEK 293T cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, pyruvate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11995065</td>
			<td>DMEM, mammalian cell media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Sera</td>
			<td>Axenia Biologix</td>
			<td>F001</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25300062</td>
			<td>Trypsin, for cell dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess automated cell counter</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C10227</td>
			<td>Automated cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess cell counting chamber slides</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td>Slides for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR Tissue Culture Plates, White, White-Bottom, with Lid</td>
			<td>Grenier Bio-One</td>
			<td>655083</td>
			<td>White, white-bottom 96 well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TempPlate non-skirted 96-well PCR plate, natural</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1402-9596</td>
			<td>96 well plate for master plasmid plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 2.0mL DeepWell Plates</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>278743</td>
			<td>96 well deep well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L3000008</td>
			<td>Lipid transfection reagent, Lf3K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P3000 Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L3000008</td>
			<td>DNA pre-complexation reagent, provided with Lf3K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31985062</td>
			<td>Reduced serum medium for transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(+)-Sodium L-ascorbate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A4034</td>
			<td>Sodium ascorbate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin, Bovine Serum, Fraction V, Low Heavy Metals</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>12659</td>
			<td>BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (HPLC)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A4524</td>
			<td>MeOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JT9535-2</td>
			<td>Concentrated HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coelenterazine</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>CZ2.5</td>
			<td>Luciferase substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter, Sterile</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>09-720-3</td>
			<td>Sterile filter, PVDF, 0.22 &#181;m pore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17013810</td>
			<td>Multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17013808</td>
			<td>Multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite Multi Pipette L12-10XLS+</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17013807</td>
			<td>Multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent reservoir</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4870</td>
			<td>Trough for reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 15 mL</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>05-539-12</td>
			<td>15 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 50 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td>50 mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spark Microplate Reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>N/a</td>
			<td>Plate Reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>2016 for Mac</td>
			<td>Spreadsheet software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>v7</td>
			<td>Scientific data analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput luciferase assay to evaluate proteolysis of the single-turnover protease pcsk9

Proprotein konvertaz subtilisin/kexin 9 (PCSK9) türüdür serum düşük yoğunluklu lipoprotein (LDL) düzeyleri düzenleyen bir tek-ciro proteaz ve sonuç olarak, kalp-damar hastalıkları. PCSK9 proteolizis tam hypercholesterolemic etkisi için gerekli olmasına rağmen proteolitik işlevini değerlendirilmesi zordur: PCSK9 sadece kendisini ayırmak için bilinen, sadece tek bir ciro uğrar ve proteolizis sonra substrat korur onun aktif bir otomatik inhibitörü olarak. Burada sunulan yöntemleri bu zorlukların üstesinden gelir bir tahlil açıklanmaktadır. Cins proteolizis bir hücre tabanlı içerik ve bağlantılar başarılı bölünme klimalı ortamda kolayca okunabilir salgılanan luciferase etkinlik için tahlil odaklanır. Via sıralı adımları mutagenesis, geçici transfection ve bir luciferase okuma tahlil PCSK9 proteolizis ya da moleküler genetik pertürbasyon koşullar altında bir yüksek-den geçerek şekilde sonda. Bu sistem klinik olarak keşfedilen missense tek nükleotid polimorfizmleri (SNPs), de PCSK9 proteolizis küçük molekül inhibitörleri ile taranması gelince biyokimyasal değerlendirme için son derece uygundur.

Yüksek işlem hacmi proteolizis tahlil üç büyük zorlukların üstesinden üzerine dayanır. İlk olarak, bir tek-ciro PCSK9 proteaz inhibitör eksik bir PCSK9 proteaz özünde düşük çıktı aşmak için prodomain, bölünme serisi prodomain kuyruğunu, salgılanan14olabilir bir luciferase bağlantılı kullanılır. İkinci olarak, pas proteaz ihtiyacını karşılamak için onun inhibitör kompleksi prodomain, iki polipeptitler olan trans içinde...

Watch this Scientific Journal Video about A High-Throughput Luciferase Assay to Evaluate Proteolysis of the Single-Turnover Protease PCSK9 at JoVE.com

A High-Throughput Luciferase Assay to Evaluate Proteolysis of the Single-Turnover Protease PCSK9

Tek-ciro proteaz PCSK9 proteolizis değerlendirmek için bir yüksek-den geçerek Luciferase tahlil

Bu iletişim kuralı bir özünde düşük aktivite, tek ciro proteaz hücresel bir bağlamda proteolitik aktivite değerlendirmek için bir yöntem sunuyor. Özellikle, bu yöntem PCSK9, lipid metabolizması proteolitik olan faaliyet son hypercholesterolemic işlevi için gerekli olan bir anahtar sürücü proteolitik aktivite değerlendirmek için uygulanır.

Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) is a single-turnover protease which regulates serum low-density lipoprotein (LDL) levels and, ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

Yeni çözünmez Kromojenik altyapı deneyiyle kitleri kullanılarak karbonhidrat parçalayıcı Enzimlerin yüksek verimli tarama

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Yöntem HCN1 ve TRIP8b arasında protein-protein etkileşimi küçük molekül önleyicilerinin tespit edilmesi için

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

Basit, sağlam ve yüksek üretilen iş tek bir molekül akışı germe tahlil uygulama boyunca DNA moleküllerinin taşıma eğitimi için

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Yüksek işlem hacmi Caenorhabditis Elegans kimyasal tarama için basit bir yöntem

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Rekombinant füzyon protein flüoresan proteaz tahlil Platform ve onların jel Renaturation kullanımı

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

Dna İlkase tarafından DNA Dizisi Tanıma Yüksek-Throughput Primase Profilleme kullanarak

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

Küçük Molekül Inhibitörlerinin Taranması için NADH-Coupled ATPase Tsay'ın Yarı-Yüksek İş-İşLenme Adaptasyonu

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

Fotonik Çip Kullanarak Yüksek İşLeç Toplam İç Yansıma Floresansı ve Direkt Stokastik Optik Rekonstrüksiyon Mikroskobu

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening

Enzim Karakterizasyonundan Yüksek Verimli Taramaya Kadar Apolipoprotein N-asiltransferaz için Click-Kimya Tabanlı Florometrik Analiz

Lipoproteins from proteobacteria are posttranslationally modified by fatty acids derived from membrane phospholipids by the action of three integral ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...