Name: producing gene deletions in escherichia coli by p1 transduction with excisable antibiotic resistance cassettes
Uploaded: 2018-09-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes at JoVE.com

Keio-Sammlung-Sorten stammen aus dem nationalen BioResource Projekt (NIG, Japan): E. Coli. Wir danken Dirk Linke (Institut für Biowissenschaften, Universität Oslo) für seine kontinuierliche Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch den Forschungsrat von Norwegen Young Researcher Grant 249793 (zu Jack C. Leo) finanziert.

(1) Stämme und Plasmide
<ol><li>
Bakterienstämme
	<ol>
<li>Verwenden Sie die E. Coli -Stämme BW251135, JW4179 (BW25113 tamA::kan)7BL21(DE3)20und BL21ΔABCF21. Weitere Informationen finden Sie in der Tabelle der Materialien .</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bakteriophagen
	<ol>
<li>Die allgemeine Transduktion Phage P1Vir dient. Das Bakterium als eine Fl?...

<ol>
	<li>Blount, Z. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unexhausted+potential+of+E.+coli.">The unexhausted potential of E. coli.</a> eLife. 4, e05826 (2015).</li><li>Hamilton, C. M., Aldea, M., Washburn, B. K., Babitzke, P., Kushner, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+for+generating+deletions+and+gene+replacements+in+Escherichia+coli.">New method for generating deletions and gene replacements in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 171 (9), 4617-4622 (1989).</li><li>Link, A. J., Phillips, D., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+generating+precise+deletions+and+insertions+in+the+genome+of+wild-type+Escherichia+coli:+application+to+open+reading+frame+characterization.">Methods for generating precise deletions and insertions in the genome of wild-type Escherichia coli: application to open reading frame characterization.</a> Journal of Bacteriology. 179 (20), 6228-6237 (1997).</li><li>Sawitzke, J. A., Thomason, L. C., Costantino, N., Bubunenko, M., Datta, S., Court, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombineering:+in+vivo+genetic+engineering+in+E.+coli,+S.+enterica,+and+beyond.">Recombineering: in vivo genetic engineering in E. coli, S. enterica, and beyond.</a> Methods in Enzymology. 421, 171-199 (2007).</li><li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products.">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6640-6645 (2000).</li><li>Muyrers, J. P., Zhang, Y., Stewart, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques:+Recombinogenic+engineering--new+options+for+cloning+and+manipulating+DNA.">Techniques: Recombinogenic engineering--new options for cloning and manipulating DNA.</a> Trends in Biochemical Sciences. 26 (5), 325-331 (2001).</li><li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame,+single-gene+knockout+mutants:+the+Keio+collection.">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Molecular Systems Biology. 2, (2006).</li><li>Yamamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+the+Keio+collection+of+Escherichia+coli+single-gene+deletion+mutants.">Update on the Keio collection of Escherichia coli single-gene deletion mutants.</a> Molecular Systems Biology. 5, 335 (2009).</li><li>Baba, T., Huan, H. -. C., Datsenko, K., Wanner, B. L., Mori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+applications+of+systematic+in-frame,+single-gene+knockout+mutant+collection+of+Escherichia+coli+K-12.">The applications of systematic in-frame, single-gene knockout mutant collection of Escherichia coli K-12.</a> Methods in Molecular Biology. 416, 183-194 (2008).</li><li>Chattopadhyay, M. K., Tabor, C. W., Tabor, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyamines+are+not+required+for+aerobic+growth+of+Escherichia+coli:+preparation+of+a+strain+with+deletions+in+all+of+the+genes+for+polyamine+biosynthesis.">Polyamines are not required for aerobic growth of Escherichia coli: preparation of a strain with deletions in all of the genes for polyamine biosynthesis.</a> Journal of Bacteriology. 191 (17), 5549-5552 (2009).</li><li>Xie, X., Wong, W. W., Tang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+simvastatin+bioconversion+in+Escherichia+coli+by+deletion+of+bioH.">Improving simvastatin bioconversion in Escherichia coli by deletion of bioH.</a> Metabolic Engineering. 9 (4), 379-386 (2007).</li><li>Maeda, T., Sanchez-Torres, V., Wood, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+hydrogenase+3+is+a+reversible+enzyme+possessing+hydrogen+uptake+and+synthesis+activities.">Escherichia coli hydrogenase 3 is a reversible enzyme possessing hydrogen uptake and synthesis activities.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 76 (5), 1035-1042 (2007).</li><li>Meehan, B. M., Landeta, C., Boyd, D., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+disulfide+bond+formation+pathway+is+essential+for+anaerobic+growth+of+Escherichia+coli.">The disulfide bond formation pathway is essential for anaerobic growth of Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 199 (16), (2017).</li><li>Niba, E. T. E., Naka, Y., Nagase, M., Mori, H., Kitakawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+approach+to+identify+the+genes+involved+in+biofilm+formation+in+E.+coli.">A genome-wide approach to identify the genes involved in biofilm formation in E. coli.</a> DNA Research. 14 (6), 237-246 (2008).</li><li>Heinz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+features+in+the+structure,+mechanism,+and+biogenesis+of+the+inverse+autotransporter+protein+family.">Conserved features in the structure, mechanism, and biogenesis of the inverse autotransporter protein family.</a> Genome Biology and Evolution. 8 (6), 1690-1705 (2016).</li><li>Selkrig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+an+archetypal+protein+transport+system+in+bacterial+outer+membranes.">Discovery of an archetypal protein transport system in bacterial outer membranes.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 19 (5), 506-510 (2012).</li><li>Stubenrauch, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+assembly+of+fimbriae+in+Escherichia+coli+depends+on+the+translocation+assembly+module+nanomachine.">Effective assembly of fimbriae in Escherichia coli depends on the translocation assembly module nanomachine.</a> Nature Microbiology. 1 (7), 16064 (2016).</li><li>Leo, J. C., Goldman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunoglobulin-binding+Eib+proteins+from+Escherichia+coli+are+receptors+for+IgG+Fc.">The immunoglobulin-binding Eib proteins from Escherichia coli are receptors for IgG Fc.</a> Molecular Immunology. 46 (8-9), 1860-1866 (2009).</li><li>M&#252;hlenkamp, M., Oberhettinger, P., Leo, J. C., Linke, D., Sch&#252;tz, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yersinia+adhesin+A+(YadA)+-+Beauty+&amp;+beast.">Yersinia adhesin A (YadA) - Beauty &amp; beast.</a> International Journal of Medical Microbiology. 305 (2), 252-258 (2015).</li><li>Studier, F. W., Moffatt, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+bacteriophage+T7+RNA+polymerase+to+direct+selective+high-level+expression+of+cloned+genes.">Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes.</a> Journal of Molecular Biology. 189 (1), 113-130 (1986).</li><li>Meuskens, I., Michalik, M., Chauhan, N., Linke, D., Leo, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+strain+collection+for+improved+expression+of+outer+membrane+proteins.">A new strain collection for improved expression of outer membrane proteins.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 464 (2017).</li><li>Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+disruption+in+Escherichia+coli:+TcR+and+KmR+cassettes+with+the+option+of+Flp-catalyzed+excision+of+the+antibiotic-resistance+determinant.">Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant.</a> Gene. 158 (1), 9-14 (1995).</li><li>Grosskinsky, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+glycine+residue+of+trimeric+autotransporter+domains+plays+a+key+role+in+Yersinia+adhesin+A+autotransport.">A conserved glycine residue of trimeric autotransporter domains plays a key role in Yersinia adhesin A autotransport.</a> Journal of Bacteriology. 189 (24), 9011-9019 (2007).</li><li>Leo, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+E.+coli+IgG-binding+protein+D+suggests+a+general+model+for+bending+and+binding+in+trimeric+autotransporter+adhesins.">The structure of E. coli IgG-binding protein D suggests a general model for bending and binding in trimeric autotransporter adhesins.</a> Structure. 19 (7), 1021-1030 (1993).</li><li>Bertani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+lysogenesis.+I.+The+mode+of+phage+liberation+by+lysogenic+Escherichia+coli.">Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 62 (3), 293-300 (1951).</li><li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids.">Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Journal of Molecular Biology. 166 (4), 557-580 (1983).</li><li>Leo, J. C., Oberhettinger, P., Linke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+outer+membrane+insertion+and+folding+of+multimeric+transmembrane+&#946;-barrel+proteins.">Assessing the outer membrane insertion and folding of multimeric transmembrane &#946;-barrel proteins.</a> Methods in Molecular Biology. , 157-167 (2015).</li><li>Mikula, K. M., Leo, J. C., &#321;yskowski, A., Kedracka-Krok, S., Pirog, A., Goldman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+translocation+domain+in+trimeric+autotransporter+adhesins+is+necessary+and+sufficient+for+trimerization+and+autotransportation.">The translocation domain in trimeric autotransporter adhesins is necessary and sufficient for trimerization and autotransportation.</a> Journal of Bacteriology. 194 (4), 827-838 (2012).</li><li>Thomason, L. C., Costantino, N., Court, D. L., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E.+coli+genome+manipulation+by+P1+transduction.">E. coli genome manipulation by P1 transduction.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2007).</li><li>Franklin, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+in+gal+U+gene+of+E.+coli+blocks+phage+P1+infection.">Mutation in gal U gene of E. coli blocks phage P1 infection.</a> Virology. 38 (1), 189-191 (1969).</li><li>Jeong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequences+of+Escherichia+coli+B+strains+REL606+and+BL21(DE3).">Genome sequences of Escherichia coli B strains REL606 and BL21(DE3).</a> Journal of Molecular Biology. 394 (4), 644-652 (2009).</li><li>Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Sequence+Alignment+during+Homologous+Recombination.">DNA Sequence Alignment during Homologous Recombination.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (22), 11572-11580 (2016).</li><li>Watt, V. M., Ingles, C. J., Urdea, M. S., Rutter, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homology+requirements+for+recombination+in+Escherichia+coli.">Homology requirements for recombination in Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (14), 4768-4772 (1985).</li><li>Ho, T. D., Waldor, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterohemorrhagic+Escherichia+coli+O157:H7+gal+mutants+are+sensitive+to+bacteriophage+P1+and+defective+in+intestinal+colonization.">Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 gal mutants are sensitive to bacteriophage P1 and defective in intestinal colonization.</a> Infection and Immunity. 75 (4), 1661-1666 (2006).</li><li>Ikeda, H., Tomizawa, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transducing+fragments+in+generalized+transduction+by+phage+P1.+I.+Molecular+origin+of+the+fragments.">Transducing fragments in generalized transduction by phage P1. I. Molecular origin of the fragments.</a> Journal of Molecular Biology. 14 (1), 85-109 (1965).</li><li>Murooka, Y., Harada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+the+host+range+of+coliphage+P1+and+gene+transfer+from+enteric+bacteria+to+other+Gam-negative+bacteria.">Expansion of the host range of coliphage P1 and gene transfer from enteric bacteria to other Gam-negative bacteria.</a> Applied and Environmental Microbiology. 38 (4), 754-757 (1979).</li><li>Goldberg, R. B., Bender, R. A., Streicher, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+selection+for+P1-sensitive+mutants+of+enteric+bacteria.">Direct selection for P1-sensitive mutants of enteric bacteria.</a> Journal of Bacteriology. 118 (3), 810-814 (1974).</li><li>O'Connor, K. A., Zusman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coliphage+P1-mediated+transduction+of+cloned+DNA+from+Escherichia+coli+to+Myxococcus+xanthus:+use+for+complementation+and+recombinational+analyses.">Coliphage P1-mediated transduction of cloned DNA from Escherichia coli to Myxococcus xanthus: use for complementation and recombinational analyses.</a> Journal of Bacteriology. 155 (1), 317-329 (1983).</li></ol>

P1 Transduktion ist eine schnelle, robuste und zuverlässige Methode zur Erzeugung von Gen-Deletionen in E. Coli. Davon zeugt hier transducing einen TamA Löschung Mutant aus einem Keio-Spender-Stamm an einen Empfänger BL21 abgeleitet. Die wichtigsten Schritte bei der Transduktion sind die Herstellung von den transducing lysate, die Transduktion selbst, die Exzision der Kan-Widerstand-Kassette und die Überprüfung der Knock-out-mittels PCR. Insgesamt der Prozess dauert ca. 1 Woche und erfordert keine ...

Eine gemeinsame erste Annäherung an die Funktion eines Gens zu untersuchen ist, Knock-out-Mutagenese durchzuführen und die daraus resultierenden Phänotyp zu beobachten. Dies wird auch reverse Genetik bezeichnet. Das Bakterium E. Coli wurde das "Arbeitspferd" der molekularen Biologie für den letzten 70 Jahren oder so, wegen der Leichtigkeit seiner Kultivierung und seine Bereitschaft zur Genmanipulation1. Verschiedene Methoden wurden entwickelt, um gen Streichungen in E. Coli, einschließlich Marker Austausch Mutagenese2,3 und in jüngerer Zeit, Restriktionsenzymen mit dem λ rot oder Rac ET Systeme4,5 produzieren , 6.
In einem weit verbreiteten System werden kodierende Sequenzen einzelner Gene durch eine Antibiotika-Resistenz-Kassette ersetzt, die später von Chromosom5,7herausgeschnitten werden können. Die kodierenden Sequenzen werden, zum Beispiel durch eine Kanamycin (Kan) Widerstand Kassette ersetzt, die von Flippase (FLP) Anerkennung (FRT) Zielseiten auf beiden Seiten flankiert wird. Die FRT-Websites werden durch die Rekombinase FLP, erkannt die ortsspezifische Rekombination zwischen den FRT Standorten führt zur Löschung des Kan-Kassette vermittelt. Auf diese Weise kann eine vollständige Löschung der eines bestimmten Gens kodierende Sequenz erreicht werden, hinterlässt nur eine minimale Narbe Sequenz von etwa 100 Basenpaaren (bp) (Abbildung 1).
Etwas mehr als einem Jahrzehnt war die so genannte Keio-Kollektion entwickelt. Dies ist eine bakterielle Bibliothek basierend auf einem standardlabor E. Coli K12 Stamm, wo fast alle nicht-essentiellen Gene von λ rote Rekombination7,8einzeln gelöscht wurden. Die Klone in dieser Auflistung jedes haben eine kodierende Sequenz mit einer verbrauchsteuerpflichtigen Kan Widerstand Kassette ersetzt. Die Keio-Kollektion hat sich als ein nützliches Werkzeug für viele Anwendungen-9. Eine solche Anwendung ist die Herstellung von Löschung Mutanten in anderen E. Coli -Stämme. Die Kan-Kassette aus einem gegebenen Löschung-Klon kann von in der Regel transducing Bakteriophagen, wie P110,11,12,13,14mobilisiert werden. Ein Phagen bestand aus ein solcher Stamm vorbereitet kann dann verwendet werden, einen Empfänger E. Coli -Stamm von Interesse, zu infizieren wo kann bei einer niedrigen, aber zuverlässige Frequenz der Kan Kassette-haltigen Region des Empfängers Genoms durch homologe Rekombination integriert werden (Abbildung 2). Transductants kann für das Wachstum auf dem Kan-haltigen Medium ausgewählt werden. Im Anschluss daran ggf. Entfernung der Antibiotika-Resistenz-Kassette die FLP-Rekombinase auf die Transductant Belastung in Trans lieferbar. Nach dem Aushärten der FLP-haltigen Plasmid, das welches eine Ampicillin (Amp) Widerstand Markierung trägt, Kan und Amp-sensitiven Klone sind geschirmt für, und die richtige Exzision der Wildtyp kodierende Sequenz und der Kan-Kassette werden durch Kolonie-PCR überprüft.
Hier ist ein detailliertes Protokoll präsentiert, die einzelnen Schritte bei der Herstellung eines Knock-out- E.-Coli -Stamm auf Basis der oben beschriebenen Strategie beschreiben. Als Beispiel wird eine Deletion des Gens TamA demonstriert. TamA kodiert eine äußere Membran β-Fass-Protein, die ist ein Teil von Transport und Montage-Modul (TAM), die in der Biogenese bestimmter Autotransporter Proteine und Pili15,16,17beteiligt ist. Verwendet wurde diese Knock-out-Stamm dann zu prüfen, die Wirkung der TamA -Löschung auf der Biogenese von zwei Trimere Autotransporter Adhesins (TAAs), Yersinia adhäsin YadA und E. Coli -Immunglobulin (Ig)-TAA EibD verbindlich 18,19.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BW25113</td>
			<td>NIG</td>
			<td>ME6092</td>
			<td>Wild-type strain of Keio collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21(DE3)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>69450-3</td>
			<td>Expression strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21DABCF</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>102270</td>
			<td>Derived from BL21(DE3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli JW4179</td>
			<td>NIG</td>
			<td>JW4179-KC</td>
			<td>tamA deletion mutant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1 vir</td>
			<td>NIG</td>
			<td>HR16</td>
			<td>Generally transducing bacteriophage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCP20</td>
			<td>CGSC</td>
			<td>14177</td>
			<td>conditionally replicating plasmid with FLP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pASK-IBA2</td>
			<td>IBA GmbH</td>
			<td>2-1301-000</td>
			<td>expression vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEibD10</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>for production of EibD; plasmid available on request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET22b+</td>
			<td>Merck</td>
			<td>69744-3</td>
			<td>expression vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pIBA2-YadA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>for production of YadA; plasmid available on request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>33209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>BD Bacto</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A0839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrotetracycline</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab145350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-collagen type I antibody COL-1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine collagen type I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-sodium hydrogen phosphate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA dye</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA molecular size marker</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N3232S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL HRP substrate</td>
			<td>Advansta</td>
			<td>K-12045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>24388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-mouse IgG-HRP</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-rabbit IgG-HRP</td>
			<td>Agrisera</td>
			<td>AS10668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR</td>
			<td>30487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl thiogalactoside</td>
			<td>VWR</td>
			<td>43714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A4972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-lauroyl sarcosine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L9150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>70166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tamA forward primer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Sequence 5&#39;-GAAAAAAGGATATTCAGGAGAAAATGTG-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tamA reverse primer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Sequence 5&#39;-TCATAATTCTGGCCCCAGACC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-sodium citrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>84610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Merck</td>
			<td>103753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose gel electrophoresis chamber</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SUB13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead beater</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>FP120A-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>4000R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvettes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation unit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imager</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>GP-03LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubating shaker</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>Minitron</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>390-0482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave oven</td>
			<td>Samsung</td>
			<td>CM1099A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td>Biometra</td>
			<td>Tpersonal</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strips</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-0208-CP-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Hanna Instruments</td>
			<td>HI2211-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>88518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAG electrophoresis chamber</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A25977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B06322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>GFL</td>
			<td>D3006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wet transfer unit</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>TE22</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

producing gene deletions in escherichia coli by p1 transduction with excisable antibiotic resistance cassettes

Eine erste Annäherung an die Funktion eines unbekannten Gens in Bakterien zu untersuchen ist die Schaffung einen Knock-out-dieses Gens. Hier beschreiben wir eine robuste und schnelle Protokoll für die Übertragung von Genmutationen Löschung aus einem Escherichia-coli -Stamm zum anderen mithilfe von generalisierten Transduktion mit Bakteriophagen P1. Diese Methode erfordert, dass die Mutation wählbar (z. B. basierend auf Gen Störungen mit Antibiotika Kassette Insertionen). Solche Antibiotika Kassetten können aus einem Spender Stamm mobilisiert werden und führte zu einem Empfänger Stamm von Interesse schnell und einfach erzeugen eine gen-Löschung-Mutante. Die antibiotische Kassette kann soll Flippase Anerkennung Aufstellungsorte schließen, mit denen die Exzision der Kassette durch eine ortsspezifische Rekombinase einen sauberen Knock-out-mit nur einer ~ 100-Base-paar-lange Narbe-Sequenz des Genoms zu produzieren. Wir demonstrieren das Protokoll durch das TamA -gen Kodierung einen Montage-Faktor beteiligt Autotransporter Biogenese ausschlagen und testen Sie die Wirkung von diesem Knock-out auf der Biogenese und Funktion der beiden Trimere Autotransporter Adhesins. Obwohl gen Löschung durch P1 Transduktion seine Grenzen hat, machen die Leichtigkeit und Geschwindigkeit der Umsetzung es eine attraktive Alternative zu anderen Methoden der Gen-Löschung.

Generation ein TamA Knock Out des BL21ΔABCF:
Die oben dargelegte Strategie hat früher zu produzieren einen abgeleiteten Stamm von BL21(DE3), ein standard laborstamm verwendet für Protein-Produktion, die für die äußere Membran-Protein-Produktion optimiert und BL21ΔABCF21genannt. Diese Sorte fehlt vier Genen, die für reichlich äußere Membranproteine kodieren und deshalb in der Lage, mehr het...

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Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Herstellung von Gen-Deletionen in Escherichia coli durch P1 Transduktion mit verbrauchsteuerpflichtigen Antibiotikaresistenz Kassetten

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Verwendung von bereits bestehenden antibiotische Resistenz-Kassette Löschung Konstrukte als Grundlage für die Herstellung von Löschung Mutanten in anderen E. Coli -Stämme. Solche Löschung Mutationen können mobilisiert und in den entsprechenden Locus eines Empfängers Stamm mit P1 Bakteriophagen Transduktion eingefügt.

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Zucht- und RNA-vermittelte Gene Knockdown in der ausblenden Doppelstrang-Käfer,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Forschung

Genetik

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping und CRISPR / Cas9 Bearbeitung zur Identifizierung eines Drug Resistance Gen in<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Bestimmung der optimalen chromosomalen Speicherorte für eine DNA-Element in Escherichia coli mit einem neuartigen Transposon-vermittelte Ansatz

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Eine Standardmethodik, vor-Ort-Mutagenität als Funktion der Punktmutation Reparatur katalysiert durch CRISPR/Cas9 und SsODN in den menschlichen Zellen zu untersuchen

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation von einem Gen gestört Streptococcus Mutans Belastung ohne Gene Klonen

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

Messung der Genexpression in bombardierten Gerste Aleuronschicht Schichten mit erhöhter Durchsatz

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...

Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance

Testen die Rolle des Multicopy Plasmide in der Entwicklung von Antibiotika-Resistenzen

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Kandidaten-Gen Tests in klinischen Kohortenstudien mit gemultiplexten Genotypisierung und Massenspektrometrie

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-vermittelte präzise Genbearbeitung durch Tube Electroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Quantification of Plasmid-Mediated Antibiotic Resistance in an Experimental Evolution Approach

Quantifizierung der Plasmid-vermittelten Antibiotikaresistenz in einem experimentellen Evolutionsansatz

Plasmids play a major role in microbial ecology and evolution as vehicles of lateral gene transfer and reservoirs of accessory gene functions in microbial ...