Name: an efficient strategy for generating tissue-specific binary transcription systems in drosophila by genome editing
Uploaded: 2018-09-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing at JoVE.com

نشكر الدكتور ف. منفذ والدكتور ك. أوكونور-جايلز الدكتور س. فنغ للمناقشات بشأن الاستراتيجية كريسبر؛ الدكتور يد كورنبرغ، ومركز الأسهم بلومينغتون الكواشف؛ الخفة في التصوير المرافق الأساسية؛ وتمويل من المعاهد الوطنية للصحة: R00HL114867 و R35GM124878 بريال.

1-تصميم وتشييد جرنة "ناقلات التعبير"
<ol><li>لتحل محل منطقة محددة بفترة طويلة من إكسون دقة، استخدم جرنة مزدوج نهج6، التي تستهدف كل جرنة يمكن على وجه التحديد طرفي المنطقة المحددة التي تهم. للحصول على تعبير الزمانية المكانية الخاصة بالجينات دقيقة من برنامج التشغيل، حدد اثنين من ال?...

<ol>
	<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Lai, S. -. L., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+mosaic+with+dual+binary+transcriptional+systems+in+Drosophila.">Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila.</a> Nature Neuroscience. 9 (5), 703-709 (2006).</li><li>Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Q+system:+a+repressible+binary+system+for+transgene+expression,+lineage+tracing,+and+mosaic+analysis.">The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis.</a> Cell. 141 (3), 536-548 (2010).</li><li>Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Du, L., Zhou, A., Patel, A., Rao, M., Anderson, K., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+targeted+expression+system+for+branchless+and+characterization+of+novel+cellular+expression+patterns+of+the+gene+in+Drosophila.">Generation of a targeted expression system for branchless and characterization of novel cellular expression patterns of the gene in Drosophila.</a> Developmental Biology. 427 (1), 35-48 (2017).</li><li>Port, F., Chen, H. -. M., Lee, T., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+CRISPR/Cas+tools+for+efficient+germline+and+somatic+genome+engineering+in+Drosophila.">Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), E2967-E2976 (2014).</li><li>Gratz, S. J., Rubinstein, C. D., Harrison, M. M., Wildonger, J., O'Connor-Giles, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+Genome+Editing+in+Drosophila.">CRISPR-Cas9 Genome Editing in Drosophila.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 111 (1), (2015).</li><li>Doench, J. G., Hartenian, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+highly+active+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9-mediated+gene+inactivation.">Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation.</a> Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).</li><li>Port, F., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmenting+CRISPR+applications+in+Drosophila+with+tRNA-flanked+sgRNAs.">Augmenting CRISPR applications in Drosophila with tRNA-flanked sgRNAs.</a> Nature Methods. 13 (10), 852-854 (2016).</li><li>Beumer, K. J., Trautman, J. K., Mukherjee, K., Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor+DNA+Utilization+During+Gene+Targeting+with+Zinc-Finger+Nucleases.">Donor DNA Utilization During Gene Targeting with Zinc-Finger Nucleases.</a> G3. 3 (4), 657-664 (2013).</li><li>Pfeiffer, B. D., Ngo, T. -. T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refinement+of+tools+for+targeted+gene+expression+in+Drosophila.">Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila.</a> Genetics. 186 (2), 735-755 (2010).</li><li>Lin, C. -. C., Potter, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editing+Transgenic+DNA+Components+by+Inducible+Gene+Replacement+in+Drosophila+melanogaster.">Editing Transgenic DNA Components by Inducible Gene Replacement in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 203 (4), 1613-1628 (2016).</li><li>Li, W., K&#246;ster, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+control,+modeling,+and+visualization+of+CRISPR+screens+with+MAGeCK-VISPR.">Quality control, modeling, and visualization of CRISPR screens with MAGeCK-VISPR.</a> Genome Biology. 16 (1), 281 (2015).</li></ol>

تقليديا، تم إنشاؤها المورفولوجية محسن الفخاخ بطريقتين مختلفتين. واحدة من الطرق تشمل الإدراج عشوائي من برنامج التشغيل (على سبيل المثال.، Gal4) تسلسل جينوم بتبديل (مثلاً.، تبديل عنصر P)1 . بدلاً من ذلك، يمكن وضع تسلسل سائق تحت سيطرة منطقة محسن/المروج المفترضة في بناء ?...

الأدوات الجينية للجينات المستهدفة قد وضعت أيضا في المورفولوجية، يجعلها واحدة من أفضل أنظمة نموذجية للتحقيق في وظيفة الجينات المشاركة في مجموعة واسعة من العمليات الخلوية. نظم ثنائية التعبير، مثل الخميرة Gal4/UAS (التسلسل التنشيط المنبع)، اعتمد أولاً للأنسجة على حدة محسن ميسيكسبريشن الملائمة والجينات في نموذج الجينية المورفولوجية 1 (الشكل 1). هذا النظام على تيسير تطوير عدد كبير من تقنيات مثل تنظيم الزمانية المكانية overexpression الجينات، ميسيكسبريشن، وخروج المغلوب في مجموعات محددة من الخلايا، وكذلك كما هو الحال في خلية التذرية، ووسم الخلية، واقتفاء أثر مباشر الخلوية والجزيئية العمليات في الأجنة والأنسجة وتتبع النسب والتحليلات فسيفساء أثناء التطوير. عدد من النسخ ثنائي النظام، مثل البكتيريا ليزا نيوروسبورا س-نظام، ونظامليزاالبروتوكول الاختياري (الشكل 1) هي أدوات قوية الجينية التي تستخدم الآن على نطاق واسع في المورفولوجية، بالإضافة إلى نظام Gal4/UAS الأصلي للجينات المستهدفة التعبير1،،من23.
وهنا نقدم طريقة لإنشاء نظام موثوق بها للغاية الخاصة بالانسجة ثنائي التعبير باستخدام أسلوب التحرير الجينوم. التطورات الأخيرة في كريسبر/Cas9 الجينوم تكنولوجيا تحرير أتاحت فرصاً غير مسبوقة لإجراء تغييرات جينوم الموجهة في طائفة واسعة من الكائنات الحية. بالمقارنة مع التقنيات المتاحة الجينوم التحرير الأخرى، نظام كريسبر/Cas9 رخيصة وفعالة وموثوق بها. وتستخدم هذه التكنولوجيا مكونات الجهاز المناعي التكيفي البكتيرية: اندونوكليسي Cas9 العقدية المقيّحة يقوم بإنشاء فاصل مزدوج-ستراند (جهاز تسوية المنازعات)، ودليل تشيميريك رنا (جرنة)، التي توجه Cas9 لموقع معين جينوم ل جهاز تسوية المنازعات المستهدفة4. الخلايا تحتوي على إليه لإصلاح جهاز تسوية المنازعات باستخدام مسارات مختلفة. نهاية مثلى عدم الالتحاق بالعمل (نج) يؤدي إلى الصغيرة عمليات الإدراج أو الحذف لتعطيل وظيفة الجينات، وحين يدخل الإصلاح الموجه من التماثل (HDR) من معرفة الموجهة/مرغوب فيه الجينوم تدق-في/المغلوب باستخدام جهة مانحة خارجية في تقرير التنمية البشرية كقالب. كفاءة يمكن أن تستخدم استراتيجية استبدال المستندة إلى تقرير التنمية البشرية لإنشاء نظام موثوق بها للغاية الخاصة بالانسجة ثنائي تعبير، التي يمكن التغلب على جميع القيود المفروضة على أساليب فخ محسن التقليدية. يصف لنا إجراء خطوة بخطوة للاستفادة إصلاح HDR كريسبر/Cas9-تعتمد في توليد خط نسخ ثنائي برنامج تشغيل التي يتم التعبير عنها تحت سيطرة الذاتية تنظيم النسخي وبوستترانسكريبشونال المورفولوجية الجينات. في هذا البروتوكول، ونظهر توليد خط برنامج تشغيل محدد فروعها (bnl) الجينات ترميز بروتين أسرة صندوق الأجيال القادمة الذي ينظم morphogenesis المتفرعة من مجرى الهواء الرغامى ظهارة5. في هذا المثال، استعيض إكسون الترميز الأول من الجينات bnl تسلسل تسلسل ترانساكتيفاتور ليزا البكتيرية دون تغيير أي الذاتية رابطة الدول المستقلة-تسلسل الجين bnl التنظيمية. نظهر أن الاستراتيجية التي تم إنشاؤها بخط سائق bnl-ليزا سباتيوتيمبورالي يتحكم في التعبير عن الجينات مراسل وضعت المتلقين للمعلومات من ليكساوبيراتور (ليكساوب أو لكسو) حصرا في bnl- وإذ تعرب عن الخلايا الظهارية/الوسيطة/العصبية.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>X-Gal/IPTG</td>
			<td>Gentrox (Genesee Scientific)</td>
			<td>18-218</td>
			<td>cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-Agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>BD&#160;244520</td>
			<td>cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T3253</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E1161</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DNase/RNase-Free Water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10977-023</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10%SDS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71736</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOAc</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>P1190</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>04-355-451</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJET Miniprep</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K0503</td>
			<td>Miniprep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink HiPure Plasmid Maxipep kits</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K210006</td>
			<td>Maxiprep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbsI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0539S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>IDT-DNA</td>
			<td></td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCFD4</td>
			<td>Kornberg Lab</td>
			<td></td>
			<td>DNA template and vector for gRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi Hot Start- (Kapa Biosystems)</td>
			<td>Kapa biosystems</td>
			<td>KK2601</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5-high fidelity Taq</td>
			<td>NEB</td>
			<td>NEB #M0491</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson Assembly Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>NEB #E2611</td>
			<td>DNA assembly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBPnlsLexA:p65Uw</td>
			<td>Addgene</td>
			<td></td>
			<td>DNA template for LexA amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25530049</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x PCR PreMix, with dye (red)</td>
			<td>Sydlab</td>
			<td>MB067-EQ2R</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel elution kit</td>
			<td>Zymo Research (Genesee Scientific)</td>
			<td>11-300</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRI reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA purification kits</td>
			<td>Zymo Research (Genesee Scientific)</td>
			<td>11-330</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq One-Step RT-PCR Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E5315S</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lexO-CherryCAAX</td>
			<td>Kornberg Lab</td>
			<td></td>
			<td>Fly line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-CD8:GFP</td>
			<td>Kornberg lab</td>
			<td></td>
			<td>Fly line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>btl-Gal4</td>
			<td>Kornberg lab</td>
			<td></td>
			<td>Fly line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MKRS/TB6B</td>
			<td>Kornberg lab</td>
			<td></td>
			<td>Fly line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope SP5X</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Imaging expression pattern</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 station</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-122WCU</td>
			<td>fly pushing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ-61</td>
			<td>fly pushing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtube homogenizing pestles</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>03-421-217</td>
			<td>genomic DNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an efficient strategy for generating tissue-specific binary transcription systems in drosophila by genome editing

نظم النسخ ثنائي أدوات قوية الوراثية المستخدمة على نطاق واسع لتصور، والتلاعب بالخلية التعبير مصير والجينات في مجموعات محددة من الخلايا أو الأنسجة في الكائنات نموذج. هذه النظم تحتوي على عنصرين هما كخطوط منفصلة وراثيا. سطر برنامج تشغيل يعرب منشط النسخي تحت السيطرة من الأنسجة على حدة المروجين/القدرة على، ومرافئ خط مراسل/المستجيب جين المستهدف وضع مجرى النهر إلى موقع ربط المنشط النسخ. حمل الحيوانات التي تأوي كل من مكونات ترانساكتيفيشن الخاصة بالانسجة لتعبير الجينات المستهدفة. دقة التعبير الزمانية المكانية للجينات في الأنسجة المستهدفة حاسمة بالنسبة لتفسير غير متحيز لنشاط الخلية/الجينات. ولذلك، وضع أسلوب لتوليد خطوط الحصرية الخاصة بخلية/الأنسجة سائق ضروري. هنا نقدم طريقة لإنشاء نظام التعبير العالية الخاصة بالانسجة المستهدفة باستخدام "متفاوت بانتظام إينتيرسباسيد قصيرة المتناوب تكرار/كريسبر-المرتبطة" (كريسبر/Cas)-على أساس الجينوم تحرير الأسلوب. في هذا الأسلوب، دليل اندونوكليسي ويستهدف Cas9 اثنين تشيميريك الكشف (جرنة) إلى مواقع محددة في إكسون الترميز الأول للجينات في الجينوم المورفولوجية لإنشاء فواصل مزدوجة-ستراند (جهاز تسوية المنازعات). فيما بعد، باستخدام بلازميد مانحة خارجية تحتوي على تسلسل ترانساكتيفاتور، آلات إصلاح الخلية ذاتية تمكن الإصلاح الموجه من التماثل (HDR) من جهاز تسوية المنازعات، مما يؤدي إلى الحذف الدقيق واستبدال إكسون مع ترانساكتيفاتور التسلسل. وأعرب عن ترانساكتيفاتور طرقت في حصرا في الخلايا حيث رابطة الدول المستقلة-العناصر التنظيمية لاستبدال الجينات الوظيفية. البروتوكول خطوة بخطوة مفصلة تقدم هنا لتوليد سائق النسخي ثنائي المعرب عنها في صندوق الأجيال القادمة المورفولوجية/فروعها-إنتاج الخلايا الظهارية/العصبية يمكن اعتمادها لأي تعبير الجينات أو أنسجة محددة.

هذا البروتوكول استخدمت بنجاح لإنشاء تعبير ثنائي المستهدف مراسل نظام محدد ل bnl معربا عن الخلايا5. رابطة الدول المستقلة-لا تتسم العناصر التنظيمية (CREs) التي تتحكم في التعبير الزمانية المكانية المعقدة bnl . ولذلك، صمم إكسون الترميز الأول فقط من bnl</...

Watch this Scientific Journal Video about An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing at JoVE.com

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

نقدم هنا، وسيلة لتوليد النظم الخاصة بالانسجة النسخ ثنائي في المورفولوجية بالاستعاضة عن إكسون الترميز الأول من الجينات مع برامج النسخ. الأسلوب كريسبر/Cas9-تعتمد يضع تسلسل ترانساكتيفاتور تحت تنظيم الجين حل محل الذاتية، ويسهل التعبير ترانسكتيفاتور حصرا في أنماط الزمانية المكانية الخاصة بالجينات وبالتالي.

استراتيجية فعالة لتوليد النظم الخاصة بالانسجة النسخ ثنائي في المورفولوجية بتحرير الجينوم

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of ...

الهدف العام لهذه الطريقة هو إنشاء نظام تعبير موجه خاص بالأنسجة. في هذه الطريقة، أظهرنا جيل برنامج تشغيل النسخ الثنائي محددة لدينا Drosophila FGF homolog، branchless. دينامية، والتعبير الصدغي من دون فرع ينظم تكوين فرع من ظهارة مجرى الهواء القصبي.على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في التعبير الزماني الزاقاري وهجرة الخلايا المنتجة غير الفرعية ، يمكن تطبيقها بسهولة على الجينات والأنسجة الأخرى في دروسوفيليا أو في كائنات نموذجية أخرى ، مثل C.Elegans و zebrafish. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يولد أنظمة التعبير التي هي موثوقة للغاية ، والأنسجة وجين محددة ، ونشطة حصرا في الخلايا حيث العناصر التنظيمية لرابطة الدول المستقلة من الجين استبدال وظيفية. أنظمة النسخ الثنائية هي أدوات أساسية للتعبير الجيني الموجه والتلاعب.المنشط عبر، مثل GAL4 أو ليكسا، التي أعرب عنها تحت سيطرة العناصر التنظيمية رابطة الدول المستقلة من الجينات، محرك الجينات trans effector التي وضعت في المصب من مواقع محددة ملزمة النسخ، مثل UAS لGAL4 و / أو LexO لLexa. هذه المنهجية يستبدل إكسون الترميز الأول من الجين بلا فروع مع برنامج النسخ. تضع الطريقة القائمة على CRISPR Cas9 تسلسل يكسا عبر المنشط تحت التنظيم الداخلي للجينة غير المتفرعة ، وبالتالي ، تسهل التعبير عبر المنشط حصريًا في أنماط متزامنة متزامنة محددة بدون فروع.ابدأ بتحديد موقعين مستهدفين لـ RNA موجهين يستهدفان بشكل خاص طرفي المنطقة المختارة التي تهمك. افتح أداة تصميم CRISPR التي تختارها. يتم استخدام Fly CRISPR الهدف الأمثل مكتشف هنا.انقر على تحديد Genome'insert تسلسل الفائدة، وحدد أحدث تعليق توضيحي للجينوم Drosophila melanogaster تم تحميله، حاليا R سفلية ستة، في القائمة المنسدلة. بعد ذلك، انقر فوق تحديد طول الدليل'وإدخال 20. حدد كافة أهداف CRISPR'وانقر فوق البحث عن أهداف CRISPR.تقييم جميع أهداف دليل المرشح RNA عن طريق وضع الحد الأقصى للصرامة وNGG only'for PAM. لتوليد دليل جنبا إلى جنب RNA التعبير ناقلات، PCR الأولى تضخيم جزء الحمض النووي لإدخال اثنين من تسلسلات بروتو في التعبير pCFD4 RNA ناقلات التعبير العمود الفقري. استخدام التمهيدي إلى الأمام وعكس، مع كل تسلسل بروتو مفر، وتداخل مع تسلسل ناقلات pCFD4 في PCR باستخدام البوليميراز عالية الدقة والحمض النووي قالب pCFD4.لإعداد pCFD4 للاستنساخ، هضم البلازميد مع إنزيم BBS1. إعداد رد فعل في العازلة الهضم المناسبة التي تحتوي على اثنين إلى خمسة ميكروغرام من pCFD4 plasmid وميكر واحد من انزيم Bbs1 وحجم النهائي من 50 ميكرولترات. اخلط محتويات التفاعل عن طريق النقر على الأنبوب وجمع جميع القطرات المتناثرة من جدار الأنبوب إلى الأسفل عن طريق دوران قصير.احتضان مزيج رد الفعل في 37 درجة مئوية لمدة ساعتين بعد تشغيل المنتج PCR وهضم plasmid على هلام agarose واحد في المئة. تنقية 6.4 كيلو قاعدة زوج plasmid الخطية و 600 زوج قاعدة PCR الزوج المنتج باستخدام أعمدة تنقية هلام القياسية. إعداد تفاعل تجميع الحمض النووي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.بالنسبة لسلسلة من الـ GAL4 أو LexA، صمم متبرعًا مزدوجًا بتقنية HDR يحتوي على تسلسل المنشط عبر، ويحيط به ذراعان للتهكم. لتجنب إعادة استهداف RNA الدليل إلى موضع هندسي، تصميم الجهة المانحة البديلة بطريقة تعطل مواقع التعرف على RNA دليل من قبل تسلسل الخارجية المقدمة. أيضا، لتجنب تغيير نقاء رابطة الدول المستقلة العناصر التنظيمية، حدد دائما دليل مواقع الاعتراف RNA داخل المنطقة exon الترميز.لإنشاء كاسيت بديل، قم بتخطيط استراتيجية تجميع الحمض النووي للانضمام إلى أربعة أجزاء معًا. الخمسة الرئيسي وثلاثة الرئيسية homology الأسلحة ، middle exogenous trans activator DNA تسلسل ، وخطي استنساخ ناقلات العمود الفقري. تضخيم PCR GAL4 أو كاسيت تعبير LexA من ناقل مناسب وPCR تضخيم الأسلحة homology من الحمض النووي الجينوم المستخرج من خط يطير الأصل المحدد للحقن.استخدام البوليميراز عالية الدقة في كل PCR لتوليد شظايا الهدف. لإعداد تفاعل تجميع الحمض النووي ، وخلط ناقلات الاستنساخ الخطية والشظايا المستهدفة التي يولدها استنساخ PCR مع mastermix الجمعية الحمض النووي وحجم التفاعل النهائي إلى 20 ميكرولترات وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. احتضان مزيج رد فعل لمدة ساعة واحدة في 50 درجة مئوية.عندما الأجنة Nos-Cas9 حقن سابقا مع كل من دليل RNA التعبير plasmid والمتبرع استبدال, تتطور إلى البالغين, عبر G0 الذباب بشكل فردي لتحقيق التوازن بين الذباب الخاص بك من خط مناسب للأليل المستهدفة. تخدير ذرية F1 من كل عبر G0 على لوحة ثاني أكسيد الكربون. اختيار عشوائيا 10 إلى 20 الذكور تحت مجهر ستيريو.عبر فردي كل ذكر مختارة لأنثى موازن من خط مناسب لأليل المستهدفة. عندما تفقس يرقات F2، اختر الأب F1 من كل صليب. استخراج الحمض النووي الجينوم عن طريق السحق كل ذبابة لمدة 10 إلى 15 ثانية مع طرف ماصة، تحتوي على 50 ميكرولترات من المخزن المؤقت السحق دون الاستغناء عن العازلة.ثم، الاستغناء المخزن المؤقت المتبقي في الأنبوب وخلط جيدا. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 20 إلى 30 دقيقة. بعد الحضانة، ضع الأنابيب في كتلة حرارة 95 درجة مئوية لمدة دقيقة إلى دقيقتين لتنشيط البروتينات K.After تدور لمدة خمس دقائق في 10،000 مرة G، وتخزين إعداد في أربع درجات مئوية لمزيد من تحليل PCR.تنفيذ ثلاث خطوات PCR المستندة إلى الشاشات باستخدام التمهيديات إلى الأمام واحد وعكس واحد إلى الشاشة لوجود الإدراج أو الاستبدال. تنفيذ PCR باستخدام الأمام اثنين وعكس التمهيديين للتحقق من الإدراج أو الاستبدال من المنطقة الرئيسية الثلاثة. تنفيذ PCR باستخدام التمهيديات M13F وعكس ثلاثة للتحقق من ينتهي في'HDR.حافظ على خطوط الطيران مع انتهاء-out'HDR المؤكدة وإنشاء مخزونات متوازنة من جيل F2. خارج عبر التوازن الذباب مرة أخرى لإزالة أي طفرات غير مقصودة على الكروموسومات الأخرى. يظهر التعبير غير المتفرع، أو bnl، هنا باللون الأحمر في قرص جناح اليرقات النجمية الثالث، مع الخلايا التعبيرية اللاهثة المستقبلة، الموضحة باللون الأخضر، في قرص الهواء المتنامي.تظهر الخلايا التعبيرية غير المتفرعة هنا في فرع TR5 الضامة العرضية وفرع TR2 الظهرية. تظهر خلايا القصبة الهوائية اللاهثة هنا باللون الأخضر. تظهر الخلايا التعبيرية اللاهثة باللون الأخضر ، مما يضع علامة على القصبة الهوائية الجنينية النامية من المرحلة التاسعة إلى المرحلة 14 وتظهر الخلايا التعبيرية غير المتفرعة باللون الأحمر.تُظهر هذه الصورة التعبير غير المتفرع المستحث في مواقع الأنسجة المنتبذة في ظل ظروف نقص الأكسجين، نسبة إلى التحكم. وقد صممت هذه الطريقة للاحتفاظ بجميع اللوائح الأصلية اصمة الزمانية من النسخ الجينية غير المتفرعة. ولذلك، كان من المهم استبدال فقط إكسون الترميز الأول للجين مع تسلسل الترميز يكسا عبر المنشط.بعد تطورها ، مهدت هذه الأدوات الوراثية الجديدة الطريق لاستكشاف أنماط التعبير الأنسجة الجديدة للجينة غير المتفرعة. كما مكّن ذلك من سوء التعبير عن الجينات وأسقطه حصرياً في الخلايا التعبيرية غير المتفرعة وساعد في رصد الهجرة الخطية والإشارة إلى تفاعلات الخلايا.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

كفاءة نقل الجينات في شبكية العين الفرخ عن الخلية الأولية دراسات الثقافة: ل<em&gt; السابقين البيضة</em&gt; Electroporation للمنهج

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

لقطة على نطاق الجينوم من المنظمين لونين والدول في<em&gt; القيطم</em&gt; الأجنة عن طريق رقاقة تسلسل

The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and ...

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

توليد كريسبر / Cas9 ساطة Monoallelic الحذف لدراسة وظيفة محسن في الخلايا الجذعية الجنينية الماوس

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

Identification of Critical Conditions for Immunostaining in the Pea Aphid Embryos: Increasing Tissue Permeability and Decreasing Background Staining

تحديد الظروف الحرجة لالمناعية في البازلاء المن الأجنة: زيادة نفاذية الأنسجة وتقليل خلفية تلطيخ

The pea aphid Acyrthosiphon pisum, with a sequenced genome and abundant phenotypic plasticity, has become an emerging model for genomic and developmental ...

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

Microinjection لTransgenesis والجينوم التحرير في Threespine أبو شوكة

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

تشريح وتلطيخ المبايض المورفولوجية الخوادر

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

تطبيق [رني] والحرارة الناجمة عن صدمة "التعبير عامل النسخ" إلى "إعادة برمجة الخلايا الجرثومية" إلى الخلايا العصبية في C. ايليجانس

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

ذوبان الجليد واستزراع كريوبريسيرفينج خطوط الخلايا المورفولوجية

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

الأرقاء أعاده برمجه الخلايا الليفية البشرية عن طريق التعبير القسري من عوامل النسخ

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human ...

In Vitro Culture Strategy for Oocytes from Early Antral Follicle in Cattle

في استراتيجية ثقافة فيترو لبويضات من أوائل الجريب الأنترال في الماشية

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that ...