Name: an efficient strategy for generating tissue-specific binary transcription systems in drosophila by genome editing
Uploaded: 2018-09-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing at JoVE.com

CRISPR 戦略に関する議論、博士・ f ・ ポート、博士・ k ・ オコナー-ジャイルズと博士 s. 風水に感謝します。博士結核コーンバーグと試薬; ブルーミントン ストック センターUMD イメージングの中核施設。NIH の資金調達: R00HL114867 と R35GM124878 の sr。

1. 設計と gRNA 発現ベクターの構築
<ol><li>エクソンの長い定義された領域を正確に置き換える、デュアル gRNA アプローチ6、各 gRNA することができます具体的には選択した関心領域の両端をターゲットを使用します。ドライバーの正確な遺伝子特定の時空間表現を得るためには、遺伝子の最初のコーディング エクソン内の 2 つの gRNA ターゲット サイトを選択します。</li>
	<li>...

<ol>
	<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Lai, S. -. L., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+mosaic+with+dual+binary+transcriptional+systems+in+Drosophila.">Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila.</a> Nature Neuroscience. 9 (5), 703-709 (2006).</li><li>Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Q+system:+a+repressible+binary+system+for+transgene+expression,+lineage+tracing,+and+mosaic+analysis.">The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis.</a> Cell. 141 (3), 536-548 (2010).</li><li>Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Du, L., Zhou, A., Patel, A., Rao, M., Anderson, K., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+targeted+expression+system+for+branchless+and+characterization+of+novel+cellular+expression+patterns+of+the+gene+in+Drosophila.">Generation of a targeted expression system for branchless and characterization of novel cellular expression patterns of the gene in Drosophila.</a> Developmental Biology. 427 (1), 35-48 (2017).</li><li>Port, F., Chen, H. -. M., Lee, T., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+CRISPR/Cas+tools+for+efficient+germline+and+somatic+genome+engineering+in+Drosophila.">Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), E2967-E2976 (2014).</li><li>Gratz, S. J., Rubinstein, C. D., Harrison, M. M., Wildonger, J., O'Connor-Giles, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+Genome+Editing+in+Drosophila.">CRISPR-Cas9 Genome Editing in Drosophila.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 111 (1), (2015).</li><li>Doench, J. G., Hartenian, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+highly+active+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9-mediated+gene+inactivation.">Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation.</a> Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).</li><li>Port, F., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmenting+CRISPR+applications+in+Drosophila+with+tRNA-flanked+sgRNAs.">Augmenting CRISPR applications in Drosophila with tRNA-flanked sgRNAs.</a> Nature Methods. 13 (10), 852-854 (2016).</li><li>Beumer, K. J., Trautman, J. K., Mukherjee, K., Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor+DNA+Utilization+During+Gene+Targeting+with+Zinc-Finger+Nucleases.">Donor DNA Utilization During Gene Targeting with Zinc-Finger Nucleases.</a> G3. 3 (4), 657-664 (2013).</li><li>Pfeiffer, B. D., Ngo, T. -. T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refinement+of+tools+for+targeted+gene+expression+in+Drosophila.">Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila.</a> Genetics. 186 (2), 735-755 (2010).</li><li>Lin, C. -. C., Potter, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editing+Transgenic+DNA+Components+by+Inducible+Gene+Replacement+in+Drosophila+melanogaster.">Editing Transgenic DNA Components by Inducible Gene Replacement in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 203 (4), 1613-1628 (2016).</li><li>Li, W., K&#246;ster, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+control,+modeling,+and+visualization+of+CRISPR+screens+with+MAGeCK-VISPR.">Quality control, modeling, and visualization of CRISPR screens with MAGeCK-VISPR.</a> Genome Biology. 16 (1), 281 (2015).</li></ol>

伝統的に、ショウジョウバエエンハンサー トラップは、2 つの異なるメソッドによって生成されました。いずれかのドライバーのランダム挿入が含まれています (例えば。、 Gal4) 転位によってゲノムのシーケンス (e.g。、P 要素の転位)1 。また、ゲノム3,11の異所性サイトに統合される、プラスミドの構成体で推...

ターゲット遺伝子発現の遺伝のツールボックスをショウジョウバエ、それにさまざまな細胞プロセスにかかわる遺伝子の機能を調べるための最高のモデル システムの 1 つでも開発しました。ショウジョウバエの遺伝学的モデル1 (図 1) で組織固有のエンハンサー トラップと遺伝子ヒトのGal4/UA (上流活性化配列)、酵母などのバイナリ表現システム初採用。このシステムは、多数の遺伝子の過剰発現、ヒト、セルもセル アブレーション、セル マーキング、細胞と分子のライブ トレースの選択されたグループでノックアウトの時空間的制御などの技術の開発を促進開発中にモザイク解析トレースする血統と組織胚プロセス。LexA細菌のようなバイナリの転写システムの数/LexAopシステム (図 1) およびアカパンカビQ システム、強力な遺伝学的ツールに加えて、ショウジョウバエ、広く使われるようになりました目標とされた遺伝子発現1,2,3元の Gal4/UAS システム。
ゲノム編集技術を採用することにより信頼性の高い組織固有のバイナリ表現システムを生成する方法を紹介します。CRISPR/Cas9 ゲノム編集技術の最近の進歩は、有機体の広い範囲で指示されたゲノムを変更する前例のない機会を許可しています。その他の利用可能なゲノム編集技術と比較して、CRISPR/Cas9 システムは安価で効率的、かつ信頼性の高いです。この技術は細菌の適応免疫系の構成要素を利用:化膿連鎖球菌二重鎖切断 (DSB) を作成して特定のゲノムのサイト、Cas9 をガイドするキメラ ガイド RNA (gRNA) の Cas9 エンドヌクレアーゼターゲットを絞った DSB4。セルには、異なる経路を用いて DSB の修復する機械が含まれて。非相同末端結合 (NHEJ) は、ホモロジー監督修理 (HDR) がテンプレートとして外因性の HDR ドナーを使用して、定義された監督/望ましいゲノム ノック-/ノック アウトを紹介しながら遺伝子機能を混乱させる小さな挿入または削除に します。HDR ベース交換戦略は、伝統的なエンハンサー トラップ法のすべての制限を克服することができます信頼性の高い組織固有のバイナリ表現システムを生成する効率的に利用できます。ショウジョウバエの内因性転写と転写後調節の制御の下で表されるバイナリ転写ドライバー行を生成する HDR の CRISPR/Cas9 ベース修理の利用手順について述べる遺伝子。このプロトコル ドライバーのラインのために特定の世代を示す無店舗気管の気道上皮5の分岐の形態形成を調節する FGF ファミリー蛋白質 (bnl) 遺伝子。この例では、 bnl遺伝子の最初のコーディング エクソンが細菌LexA転写活性化シーケンスのシーケンスによって、内因性のcisを変更することがなく置き換えられました- bnl遺伝子の制御配列。戦略が時空bnl -排他的にLexAoperator (LexAopまたはシャワー) の下流に配置されますレポーター遺伝子の発現を制御するbnl LexAドライバー行を生成することを示す上皮・間葉系/神経細胞を表現します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>X-Gal/IPTG</td>
			<td>Gentrox (Genesee Scientific)</td>
			<td>18-218</td>
			<td>cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-Agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>BD&#160;244520</td>
			<td>cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T3253</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E1161</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DNase/RNase-Free Water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10977-023</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10%SDS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71736</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOAc</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>P1190</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>04-355-451</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJET Miniprep</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K0503</td>
			<td>Miniprep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink HiPure Plasmid Maxipep kits</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K210006</td>
			<td>Maxiprep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbsI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0539S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>IDT-DNA</td>
			<td></td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCFD4</td>
			<td>Kornberg Lab</td>
			<td></td>
			<td>DNA template and vector for gRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi Hot Start- (Kapa Biosystems)</td>
			<td>Kapa biosystems</td>
			<td>KK2601</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5-high fidelity Taq</td>
			<td>NEB</td>
			<td>NEB #M0491</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson Assembly Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>NEB #E2611</td>
			<td>DNA assembly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBPnlsLexA:p65Uw</td>
			<td>Addgene</td>
			<td></td>
			<td>DNA template for LexA amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25530049</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x PCR PreMix, with dye (red)</td>
			<td>Sydlab</td>
			<td>MB067-EQ2R</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel elution kit</td>
			<td>Zymo Research (Genesee Scientific)</td>
			<td>11-300</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRI reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA purification kits</td>
			<td>Zymo Research (Genesee Scientific)</td>
			<td>11-330</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq One-Step RT-PCR Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E5315S</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lexO-CherryCAAX</td>
			<td>Kornberg Lab</td>
			<td></td>
			<td>Fly line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-CD8:GFP</td>
			<td>Kornberg lab</td>
			<td></td>
			<td>Fly line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>btl-Gal4</td>
			<td>Kornberg lab</td>
			<td></td>
			<td>Fly line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MKRS/TB6B</td>
			<td>Kornberg lab</td>
			<td></td>
			<td>Fly line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope SP5X</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Imaging expression pattern</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 station</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-122WCU</td>
			<td>fly pushing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ-61</td>
			<td>fly pushing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtube homogenizing pestles</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>03-421-217</td>
			<td>genomic DNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an efficient strategy for generating tissue-specific binary transcription systems in drosophila by genome editing

バイナリ転写システムは、広く可視化して細胞の特定のグループの細胞運命と遺伝子発現やモデル生物の組織を操作するための強力な遺伝的ツールです。これらのシステムは、個別の遺伝子組換え行に 2 つのコンポーネントを含まれています。ドライバーのラインはターゲット遺伝子は転写活性化因子の結合部位に下流に置かれたレポーター/エフェクター ライン港湾組織固有のプロモーター/エンハンサーは、の管理下の転写活性化因子を表しています。両方のコンポーネントをかくまっている動物は、ターゲット遺伝子発現の組織特異を転写活性化を誘導します。対象となる組織の遺伝子発現の正確な時空間は、細胞・遺伝子活動の公平な解釈にとって重要です。したがって、排他的な細胞/組織固有のドライバーの行を生成するための手法の開発が不可欠です。ここで採用することにより高い組織特異的標的発現システムを生成する手法を提案、「定期的にクラスター化 Interspaced 短い回文繰り返し/CRISPR 関連」(CRISPR/Cas)-ゲノム編集技術をベース。このメソッドでは、Cas9 は、2 つのキメラを狙われてエンドヌクレアーゼ (DSB) の二重鎖切断を作成するショウジョウバエのゲノムの遺伝子の最初のコーディングのエクソンの特定のサイトに Rna (gRNA) をガイドします。転写活性化シーケンスを含む外因性ドナー プラスミドを使用すると、その後、セル自律修復機械正確な削除と、トランスと、エクソンの交換の結果、DSB のホモロジー監督修復 (HDR) が可能にします。シーケンス。ノックでトランスは細胞でのみ発現するcis-置き換えられた遺伝子の調節配列が機能。ショウジョウバエ fgfで表されるバイナリ転写ドライバーを生成するここで説明した詳細なステップバイ ステップ プロトコル/無店舗-任意遺伝子の組織特異的発現に採用されることができます/神経上皮細胞を作り出します。

このプロトコルは、ターゲット バイナリ式レポーター システム特定のbnlセル5を表現するための生成に使用された正常に。Cis-複雑な時空間bnl式を制御する規制要素 (クレス) が特徴付けされていません。したがって、内因性bnl規制シーケンスの制御の下での時空間表現を成し遂げるためには、 bnlのだけ最初のコーデ?...

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An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

ショウジョウバエの遺伝子の最初のコーディングのエクソンを転写ドライバーと置き換えることにより組織特異的転写、バイナリ システムを生成する方法を紹介します。CRISPR/Cas9 ベースのメソッド交換遺伝子の内因性の規制の下での転写活性化シーケンスを配置、その結果遺伝子特定の時空間パターンを排他的に transctivator 式が容易になります。

ショウジョウバエのゲノム編集による組織固有のバイナリ転写システムを生成するための効率的な戦略

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of ...

この方法の全体的な目的は、組織特異的な標的発現系を生成することである。この方法では、我々のショウジョウバエFGFホモログに特異的なバイナリ転写ドライバの生成を実証した。枝のない動的で時空間的な発現は、気管気道上皮の枝の血行形成を調節する。この方法は、枝分かれのない産生細胞の時空間的発現および移動に関する洞察を提供することができるが、ショウジョウバエまたはC.Elegansおよびゼブラフィッシュのような他のモデル生物の他の遺伝子および組織に容易に適用することができる。この技術の主な利点は、信頼性が高く、組織および遺伝子特異的であり、置換された遺伝子のシス調節要素が機能する細胞内で排他的に活性である発現系を生成することである。バイナリ転写システムは、標的遺伝子発現および操作に不可欠なツールです。GAL4やLexAなどのトランスアクチベーターは、遺伝子のシス調節要素の制御下で発現され、GAL4のUASやLexAのLexOのような特定の転写結合部位の下流に配置されたエフェクタートランス遺伝子を駆動します。この方法論は、分岐のない遺伝子の最初のコーディングエキソンを転写ドライバに置き換えます。CRISPR Cas9ベースの方法は、LexAトランスアクチベーター配列を分岐のない遺伝子の内因性調節下に配置し、その結果、分岐のない特異的時空間パターンにおいてトランスアクチベーター発現を促進する。まず、選択した対象領域の2つの端を特異的に標的とする2つのガイドRNA標的部位を選択します。CRISPR デザインツールを開きます。フライCRISPR最適ターゲットファインダーはここで使用されています。[ゲノムの選択]をクリックして目的のシーケンスを挿入し、ドロップダウンメニューから最新のアップロード済みショウジョウバエメラノガスターゲノムアノテーション(現在Rアンダースコア6)を選択します。次に、[ガイドの長さを選択]をクリックし、入力20をクリックします。[すべての CRISPR ターゲット] を選択し、[CRISPR ターゲットを検索] をクリックします。すべての候補ガイドRNAターゲットを、PAMのストリンジェンシーおよびNGGのみの最大値を設定して評価します。タンデムガイドRNA発現ベクターを生成するために、まずPCRはDNA断片を増幅し、2つのプロトスペーサー配列をpCFD4 RNA発現ベクター骨格に導入する。前方および逆プライマーを使用し、それぞれプロトスペーサー配列を有し、高忠実度ポリメラーゼおよびpCFD4テンプレートDNAを使用したPCRでpCFD4ベクター配列と重複する。クローニング用のpCFD4を調製するには、プラスミドをBbs1酵素で消化します。pCFD4プラスミドの2〜5マイクログラムとBbs1酵素の1マイクロリットルと50マイクロリットルの最終体積を含む適切な消化バッファーに反応を設定します。チューブをタップし、短いスピンでチューブの壁から底まで、すべての散乱液滴を集めることによって、反応内容物を混ぜます。PCR産物を実行した後、2時間摂氏37度で反応ミックスをインキュベートし、1%のアガロースゲルでプラスミドを消化します。標準ゲル精製カラムを使用して、6.4キロベースペアリニアプラスミドおよび600塩基ペアPCR産物を精製します。メーカーのプロトコルに従ってDNAアセンブリ反応を設定します。GAL4またはLexAシーケンスのゲノムノックインの場合、トランスアクチベーター配列を含む二本鎖HDRドナーを2つの相同性アームで設計します。ガイドRNAを操作した軌跡に再ターゲティングすることを避けるために、ガイドRNA認識部位が導入された外因性配列によって破壊されるように、代替ドナーを設計します。また、シス調節元素の純度を変化させないために、必ずコーディングエキソン領域内のガイドRNA認識部位を選択してください。置換カセットを生成するには、4 つのセグメントを結合する DNA アセンブリ戦略を計画します。5つの素数および3つの素相同性アーム、中外外性トランスアクチベーターDNA配列、および線形化クローニングベクター骨格を有する。PCRは適切なベクターからGAL4またはLexA発現カセットを増幅し、PCRは注射用に選択された親フライラインから抽出されたゲノムDNAから相同性の腕を増幅する。各 PCR で高忠実度ポリメラーゼを使用して、ターゲットフラグメントを生成します。DNAアセンブリ反応をセットアップするには、PCRクローニングによって生成されたリニア化クローニングベクターとターゲットフラグメントをDNAアセンブリマスターミックスと、最終反応量をメーカーの指示に従って20マイクロリットルに混合します。反応ミックスを摂氏50度で1時間インキュベートします。以前にガイドRNA発現プラスミドと代替ドナーの両方を注入したNos-Cas9胚が成人に発展すると、G0を横切って個別に飛び、標的となるアリールに適したラインからハエのバランスを取ります。二酸化炭素パッド上の各G0クロスからF1子孫を麻酔します。ステレオ顕微鏡の下で10〜20人の男性を無作為に選ぶ。個別にターゲットアレーレに適したラインからバランサメスに選択した各男性を横断します。F2幼虫が孵化したら、各十字架からF1の父親を選びます。ピペットチップで各フライを10〜15秒間押しつぶし、バッファーを分配せずに50マイクロリットルのスクッシュングバッファを含んでゲノムDNAを抽出します。その後、残りのバッファーをチューブに分配し、よく混ぜます。摂氏37度で20~30分インキュベートします。インキュベーションに続いて、チューブを95°Cのヒートブロックに1〜2分間入れてプロテナーゼK.を不活性化し、G10,000倍で5分間回転した後、さらにPCR分析のために摂氏4度で調製を保存します。3段階PCRベースのスクリーンをプライマーを1つ前方にして実行し、挿入または置換の存在をスクリーニングするために1つを逆にします。3つの素数領域からの挿入または置換を検証するために、2つのプライマーを前方および逆2つのプライマーを使用してPCRを行います。プライマーM13Fを使用してPCRを実行し、3つを逆にしてエンドインHDRをチェックします。確認されたエンドアウト'HDRでフライラインを維持し、F2世代からバランスの取れた株式を確立します。他の染色体の意図しない突然変異を取り除くために、バランサが再び飛ぶアウトクロス。枝分かれ、またはbnl発現は、第3のインスター幼虫翼円盤において赤で、緑色で示される受容体の息をのむような発現細胞を有し、成長する空気嚢プリモルジウムに示される。分岐のない発現細胞はTR5横方向結合枝およびTR2後部分岐にここに示される。息を切らして発現する気管細胞を緑色でここに示す。呼吸のない発現細胞は緑色で示され、発育中の胚気管をステージ9からステージ14にマーキングし、分岐のない発現細胞を赤色で示している。この画像は、制御に対して、低酸素状態下の異所組織の位置で誘導される分岐のない発現を示す。この方法は、分岐のない遺伝子転写の全ての元の時空間的な規則を保持するように設計された。したがって、遺伝子の最初のコードエキソンのみをLexAトランスアクチベーターコード配列に置き換える必要がありました。その開発後、この新しい遺伝的ツールセットは、分岐のない遺伝子の新しい組織発現パターンを探求する道を開いた。また、遺伝子の誤発現を可能にし、分岐のない発現細胞で独占的にノックダウンし、細胞の直線的な移動およびシグナル伝達相互作用の監視に役立った。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

初代細胞培養研究のためのひよこ網膜における効率的な遺伝子導入：<em&gt;元オボ</em&gt;エレクトロポレーションアプローチ

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

クロマチンレギュレータと米国でのゲノムワイドスナップショット<em&gt;アフリカツメガエル</emChIPの-配列によって&gt;胚

The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and ...

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

生成CRISPR / Cas9媒介1アレル欠失マウス胚性幹細胞でエンハンサー機能を研究するために、

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

Identification of Critical Conditions for Immunostaining in the Pea Aphid Embryos: Increasing Tissue Permeability and Decreasing Background Staining

エンドウアブラムシ胚における免疫染色のための重要な条件の同定：組織透過性を増大し、バックグラウンド染色を減少

The pea aphid Acyrthosiphon pisum, with a sequenced genome and abundant phenotypic plasticity, has become an emerging model for genomic and developmental ...

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

Threespineトゲウオにおける遺伝子導入およびゲノム編集のためのマイクロインジェクション

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

郭清およびショウジョウバエ蛹卵巣の汚損

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

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線虫のニューロンに生殖細胞を再プログラムする RNAi と熱衝撃による転写因子の発現のアプリケーション

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

解凍、養殖、ショウジョウバエ細胞をトウキョウ

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

転写因子の強制発現によるヒト線維芽細胞のヘモジェニックリプログラミング

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human ...

In Vitro Culture Strategy for Oocytes from Early Antral Follicle in Cattle

牛の初期のアンタル卵胞からの卵母細胞のための体外培養戦略

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that ...