Name: an efficient strategy for generating tissue-specific binary transcription systems in drosophila by genome editing
Uploaded: 2018-09-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing at JoVE.com

Vi takker Dr. F. Port, Dr. K. O'Connor-Giles og Dr. S. Feng for diskusjoner om CRISPR strategi; Dr. T.B. Kornberg og Bloomington lager Center for reagenser; UMD tenkelig kjernen fasilitet; og finansiering fra NIH: R00HL114867 og R35GM124878 til SR

1. design og konstruere gRNA uttrykk vektor
<ol><li>Nettopp erstatning for en lang definerte region i en ekson, bruk en dobbel gRNA tilnærming6, der hver gRNA kan spesifikt mål to endene av den valgte regionen rundt. For å få et nøyaktig gen-spesifikke spatiotemporal uttrykk for driveren, kan du velge to gRNA målområder innen den første koding ekson av genet.</li>
	<li>
Drosophila melanogaster, Velg gRNA målområdene ved hjelp av verktøyet flyCRISPR Optimal målet Find...

<ol>
	<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Lai, S. -. L., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+mosaic+with+dual+binary+transcriptional+systems+in+Drosophila.">Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila.</a> Nature Neuroscience. 9 (5), 703-709 (2006).</li><li>Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Q+system:+a+repressible+binary+system+for+transgene+expression,+lineage+tracing,+and+mosaic+analysis.">The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis.</a> Cell. 141 (3), 536-548 (2010).</li><li>Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Du, L., Zhou, A., Patel, A., Rao, M., Anderson, K., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+targeted+expression+system+for+branchless+and+characterization+of+novel+cellular+expression+patterns+of+the+gene+in+Drosophila.">Generation of a targeted expression system for branchless and characterization of novel cellular expression patterns of the gene in Drosophila.</a> Developmental Biology. 427 (1), 35-48 (2017).</li><li>Port, F., Chen, H. -. M., Lee, T., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+CRISPR/Cas+tools+for+efficient+germline+and+somatic+genome+engineering+in+Drosophila.">Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), E2967-E2976 (2014).</li><li>Gratz, S. J., Rubinstein, C. D., Harrison, M. M., Wildonger, J., O'Connor-Giles, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+Genome+Editing+in+Drosophila.">CRISPR-Cas9 Genome Editing in Drosophila.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 111 (1), (2015).</li><li>Doench, J. G., Hartenian, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+highly+active+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9-mediated+gene+inactivation.">Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation.</a> Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).</li><li>Port, F., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmenting+CRISPR+applications+in+Drosophila+with+tRNA-flanked+sgRNAs.">Augmenting CRISPR applications in Drosophila with tRNA-flanked sgRNAs.</a> Nature Methods. 13 (10), 852-854 (2016).</li><li>Beumer, K. J., Trautman, J. K., Mukherjee, K., Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor+DNA+Utilization+During+Gene+Targeting+with+Zinc-Finger+Nucleases.">Donor DNA Utilization During Gene Targeting with Zinc-Finger Nucleases.</a> G3. 3 (4), 657-664 (2013).</li><li>Pfeiffer, B. D., Ngo, T. -. T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refinement+of+tools+for+targeted+gene+expression+in+Drosophila.">Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila.</a> Genetics. 186 (2), 735-755 (2010).</li><li>Lin, C. -. C., Potter, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editing+Transgenic+DNA+Components+by+Inducible+Gene+Replacement+in+Drosophila+melanogaster.">Editing Transgenic DNA Components by Inducible Gene Replacement in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 203 (4), 1613-1628 (2016).</li><li>Li, W., K&#246;ster, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+control,+modeling,+and+visualization+of+CRISPR+screens+with+MAGeCK-VISPR.">Quality control, modeling, and visualization of CRISPR screens with MAGeCK-VISPR.</a> Genome Biology. 16 (1), 281 (2015).</li></ol>

Tradisjonelt ble Drosophila enhancer feller generert av to ulike metoder. En av måtene inkluderer tilfeldige innsetting av en driver (f.eks., Gal4) rekkefølgen genomet av transponering (f.eks., P-element transponering)1 . Alternativt kan driveren sekvensene plasseres under transcriptional kontroll av antatte enhancer/arrangøren regionen i en plasmider konstruksjonen som vil deretter bli integrert i en ektopisk nettsted genomet3,<sup ...

Genetisk verktøykassen for målrettet genuttrykk er godt utviklet i Drosophila, en av de beste modell systemene å undersøke funksjonen i gener involvert i en rekke cellulære prosesser. Binær uttrykk systemer, som gjær Gal4/UAS (oppstrøms aktivisering sekvens), ble først vedtatt for vev-spesifikke enhancer fangst og gene misexpression i Drosophila genetisk modell1 (figur 1). Dette systemet tilrettelagt utviklingen av en rekke teknikker som spatiotemporal regulering av gene overuttrykte, misexpression, knockout i valgte grupper av celler så vel som i cellen ablasjon, celle merking, live sporing av mobilnettet og molekylære prosesser i fosteret og vev, avstamning sporing og mosaikk analyser under utvikling. En rekke binære transkripsjon systemet, for eksempel den bakterielle Meglos/Meglosop systemet (figur 1) og Neurospora Q-system, er kraftig genetisk verktøy som er nå mye brukt i Drosophila, i tillegg til den opprinnelige Gal4/UAS systemet for målrettet gene expression1,2,3.
Her presenterer vi en metode for å generere svært pålitelig vev-spesifikke binære uttrykk systemet ved hjelp av en teknikk som genomet-redigering. Den nylige fremskritt innen CRISPR/Cas9 genomet redigering teknologi har tillatt enestående muligheter til å gjøre regissert genom endringene i et bredt spekter av organismer. Sammenlignet med de andre tilgjengelige genom redigering teknikkene, er CRISPR/Cas9 systemet rimelig, effektiv og pålitelig. Denne teknologien benytter komponenter av bakteriell adaptive immunsystemet: en Cas9 endonuclease Streptococcus pyogenes som skaper en dobbel-strand pause (DSB) og en chimeric guide RNA (gRNA), som leder Cas9 til en bestemt genomet nettsted for målrettet DSB4. Cellene inneholder maskiner for å reparere DSB via ulike veier. Non-homologe slutten med (NHEJ) fører til små innsettinger eller slettinger å forstyrre gen funksjon, mens homologi-rettet reparasjon (HDR) introduserer en definert regissert/ønskelig genomisk knock-i/knock-out ved hjelp av en ytre HDR-giver som en mal. Erstatning for HDR-basert strategi kan effektivt brukes til å generere en pålitelig vev-spesifikke binære uttrykk system, som kan overvinne alle begrensningene av tradisjonelle enhancer felle metoder. Vi beskriver en trinnvis fremgangsmåte for utnyttelse av CRISPR/Cas9-baserte HDR reparasjon generere en binær transkripsjon driveren linje som uttrykkes under kontroll av endogene transcriptional og post-transcriptional regulering av en Drosophila gene. Denne protokollen, vi viser generasjonen av driveren linjen gjelder branchless (bnl) genet koding en FGF familie protein som regulerer branching morphogenesis tracheal airway epitel5. I dette første koding ekson av bnl genet ble erstattet av sekvensen av en bakteriell Meglos transactivator rekkefølge uten å endre alle endogene cis-regulatoriske sekvenser av bnl genet. Vi viser at strategien generert en Bnl-Meglos driveren linje som styrer spatiotemporally uttrykk for en reporter genet plassert nedstrøms LexAoperator (LexAop eller LexO) i bnl- uttrykke epithelial/mesenchymal/neuronal celler.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>X-Gal/IPTG</td>
			<td>Gentrox (Genesee Scientific)</td>
			<td>18-218</td>
			<td>cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-Agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>BD&#160;244520</td>
			<td>cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T3253</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E1161</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DNase/RNase-Free Water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10977-023</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10%SDS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71736</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOAc</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>P1190</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>04-355-451</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJET Miniprep</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K0503</td>
			<td>Miniprep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink HiPure Plasmid Maxipep kits</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K210006</td>
			<td>Maxiprep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbsI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0539S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>IDT-DNA</td>
			<td></td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCFD4</td>
			<td>Kornberg Lab</td>
			<td></td>
			<td>DNA template and vector for gRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi Hot Start- (Kapa Biosystems)</td>
			<td>Kapa biosystems</td>
			<td>KK2601</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5-high fidelity Taq</td>
			<td>NEB</td>
			<td>NEB #M0491</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson Assembly Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>NEB #E2611</td>
			<td>DNA assembly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBPnlsLexA:p65Uw</td>
			<td>Addgene</td>
			<td></td>
			<td>DNA template for LexA amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25530049</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x PCR PreMix, with dye (red)</td>
			<td>Sydlab</td>
			<td>MB067-EQ2R</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel elution kit</td>
			<td>Zymo Research (Genesee Scientific)</td>
			<td>11-300</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRI reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA purification kits</td>
			<td>Zymo Research (Genesee Scientific)</td>
			<td>11-330</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq One-Step RT-PCR Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E5315S</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lexO-CherryCAAX</td>
			<td>Kornberg Lab</td>
			<td></td>
			<td>Fly line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-CD8:GFP</td>
			<td>Kornberg lab</td>
			<td></td>
			<td>Fly line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>btl-Gal4</td>
			<td>Kornberg lab</td>
			<td></td>
			<td>Fly line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MKRS/TB6B</td>
			<td>Kornberg lab</td>
			<td></td>
			<td>Fly line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope SP5X</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Imaging expression pattern</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 station</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-122WCU</td>
			<td>fly pushing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ-61</td>
			<td>fly pushing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtube homogenizing pestles</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>03-421-217</td>
			<td>genomic DNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an efficient strategy for generating tissue-specific binary transcription systems in drosophila by genome editing

Binær transkripsjon systemer er kraftige genetisk verktøy brukte for å visualisere og manipulere celle skjebne og gene uttrykk i bestemte grupper av celler eller vev i modellen organismer. Disse systemene inneholder to komponenter som separate transgene linjer. En driver linje uttrykker en transcriptional aktivator under kontroll av vev-spesifikke arrangører/enhancers og en reporter/effektor linje havner et mål gen plassert nedstrøms til binding området av transkripsjon aktivatoren. Dyr skjule begge komponentene indusere vev-spesifikke transactivation av et mål genuttrykk. Presis spatiotemporal uttrykk av genet målrettet vev er avgjørende for upartiske tolkning av cellen/gen aktivitet. Derfor er det viktig å utvikle en metode for å generere eksklusive cellen/vev-spesifikk driver linjer. Her presenterer vi en metode for å generere svært vev-spesifikk målrettet uttrykk systemet ved hjelp av en "gruppert regelmessig Interspaced kort Palindromic gjenta/CRISPR-forbundet" (CRISPR/Cas)-basert genomet redigering teknikk. I denne metoden endonuclease Cas9 er rettet med to chimeric guide RNAs (gRNA) til bestemte nettsteder i de første koding ekson med et i Drosophila genomet opprette dobbel-strand bryter (DSB). Deretter muliggjør bruker en eksogene donor plasmider som inneholder den transactivator sekvensen, celle autonome reparasjon maskiner homologi-rettet reparasjon (HDR) av DSB, presis sletting og utskifting av ekson med transactivator sekvens. Banket i transactivator er uttrykt i celler der cis-regulatoriske elementer erstattet genet er funksjonelle. Detaljerte trinnvise protokollen presenteres her for å generere en binær transcriptional driver uttrykt i Drosophila fgf/branchless-produserende epithelial/neuronal celler kan brukes for alle gen - eller vev-spesifikke uttrykk.

Denne protokollen ble brukt til å generere en målrettet binære uttrykk reporter systemet bestemt for bnl uttrykke celler5. Cis-regulatoriske elementer (CREs) som styrer komplekse spatiotemporal bnl uttrykk er ikke preget. Derfor, for å oppnå spatiotemporal uttrykk under kontroll av endogene bnl regulatoriske sekvensen, bare den første koding ekson av bnl ble utformet erstattes med en rekke bakterielle Meglos</e...

Watch this Scientific Journal Video about An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing at JoVE.com

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Her presenterer vi en metode for å generere vev-spesifikke binære transkripsjon systemer i Drosophila ved å erstatte den første koding ekson av gener med transkripsjon drivere. Metoden CRISPR/Cas9-baserte steder en transactivator sekvens under endogene regulering av et erstattet gen, og dermed muliggjør transctivator uttrykk i genet-spesifikke spatiotemporal mønstre.

En effektiv strategi for å generere vev-spesifikke binære transkripsjon systemer i Drosophila av genomet redigering

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of ...

Det overordnede målet med denne metoden er å generere et svært vevsspesifikt målrettet uttrykkssystem. I denne metoden demonstrerte vi generering av en binær transkripsjonsdriver som er spesifikk for vår Drosophila FGF homolog, branchless. Dynamisk, spatiotemporal uttrykk for branchless regulerer gren hemogenese av trakeal luftveiepitelet.Selv om denne metoden kan gi innsikt i det spatiotemporale uttrykket og migrasjonen av grenløse produserende celler, kan den enkelt brukes på andre gener og vev i Drosophila eller i andre modellorganismer, som C.Elegans og sebrafisk. Den største fordelen med denne teknikken er at den genererer uttrykkssystemer som er svært pålitelige, vevs- og genspesifikke, og aktive utelukkende i celler der cis regulatoriske elementer av det erstattede genet er funksjonelle. Binære transkripsjonssystemer er viktige verktøy for målrettet genuttrykk og manipulasjon.En transaktivator, for eksempel GAL4 eller LexA, uttrykt under kontroll av cis regulatoriske elementer i et gen, driver et effektortransgen som er plassert nedstrøms av spesifikke transkripsjonsbindingssteder, som UAS for GAL4 og/ eller LexO for LexA. Denne metodikken erstatter den første kodeutsen av det grenløse genet med transkripsjonsdriveren. CRISPR Cas9-baserte metoden plasserer en LexA transaktivatorsekvens under endogene regulering av det grenløse genet, og letter derfor transaktivatoruttrykk utelukkende i grensløse spesifikke spatiotemporale mønstre.Begynn med å velge to RNA-målområder som spesifikt retter seg mot to ender av det valgte interesseområdet. Åpne crispr-designverktøyet du ønsker. Fly CRISPR Optimal Target Finder brukes her.Klikk på Velg Genome'sett inn sekvensen av interesse, og velg den nyeste opplastede Drosophila melanogaster genom merknad, for tiden R understreke seks, i rullegardinmenyen. Deretter klikker du velg føringslinjelengde og skriver inn 20. Velg Alle CRISPR-mål, og klikk på Finn CRISPR-mål.Evaluer alle RNA-mål for kandidatveiledning ved å angi maksimum for stringency og NGG only'for PAM. Hvis du vil generere en tandemguide RNA-uttrykksvektor, forsterker første PCR et DNA-fragment for å introdusere to proto spacer-sekvenser i en pCFD4 RNA-uttrykksvektorrad. Bruk en fremover og omvendt primer, hver med en proto avstandssekvens, og overlappe med pCFD4 vektorsekvensen i en PCR ved hjelp av høy-fidelity polymerase og pCFD4 mal DNA.For å forberede pCFD4 for kloning, fordøy plasmid med Bbs1 enzym. Sett opp en reaksjon i riktig fordøyelsesbuffer som inneholder to til fem mikrogram pCFD4 plasmid og en mikroliter Bbs1-enzym og et endelig volum på 50 mikroliter. Bland reaksjonsinnholdet ved å gentling tappe røret og samle alle spredte dråper fra veggen av røret til bunnen med et kort spinn.Inkuber reaksjonsblandingen ved 37 grader Celsius i to timer etter å ha kjørt PCR-produktet og fordøyd plasmid på en en prosent agarose gel. Rens 6,4 kilobasepar lineær plasmid og 600 base pair PCR-produkt ved hjelp av standard gelrensingskolonner. Sett opp DNA-monteringsreaksjonen i henhold til produsentens protokoll.For genomisk knock-in av en GAL4- eller LexA-sekvens, design en dobbelttrådet HDR-donor som inneholder transaktivatorsekvensen, flankert av to homologiarmer. For å unngå re-målretting av guiden RNA til den konstruerte locus, design erstatning donor på en slik måte at guiden RNA anerkjennelse nettsteder er forstyrret av eksogene sekvensen introdusert. For å unngå å endre renheten til cis-regulatoriske elementer, velg alltid guiden RNA-gjenkjenningsnettsteder i kode exon-regionen.Planlegg DNA-monteringsstrategien for å bli med fire segmenter sammen for å generere en erstatningskassett. De fem prime og tre førsteklasses homologi armene, den midterste eksogene trans aktivator DNA-sekvensen, og lineærisert kloning vektor ryggrad. PCR forsterker en GAL4- eller LexA-uttrykkskassett fra en passende vektor og PCR forsterker homologiarmene fra det genomiske DNA-et som er hentet fra den overordnede flylinjen som er valgt for injeksjon.Bruk high-fidelity polymerase i hver PCR for å generere målfragmentene. For å sette opp DNA-monteringsreaksjonen, bland den lineære kloningsvektoren og målfragmentene som genereres av PCR-kloning med DNA-monteringsmastermixen og et endelig reaksjonsvolum til 20 mikroliter i henhold til produsentens instruksjoner. Inkuber reaksjonsblandingen i en time ved 50 grader Celsius.Når Nos-Cas9 embryoer tidligere injisert med både guiden RNA uttrykk plasmid og erstatning donor, utvikle seg til voksne, kryss G0 flyr individuelt for å balansere fluene fra en linje som passer for målrettet allele. Bedøve F1 avkom fra hvert G0 kryss på en karbondioksidpute. Tilfeldig plukke 10 til 20 menn under et stereomikroskop.Individuelt krysse hver valgt mann til en balanserer kvinne fra en linje som passer for målrettet allele. Når F2 larver klekkes, velg F1-faren fra hvert kors. Trekk ut genomisk DNA ved å squishing hver flue i 10 til 15 sekunder med en pipettespiss, som inneholder 50 mikroliter squishing buffer uten å dispensere bufferen.Deretter dispenserer du den gjenværende bufferen inn i røret og blander godt. Inkuber ved 37 grader Celsius i 20 til 30 minutter. Etter inkubasjonen plasserer du rørene i 95 grader Celsius varmeblokk i ett til to minutter for å inaktivere proteinase K.Etter å ha snurret ned i fem minutter ved 10 000 ganger G, oppbevar preparatet på fire grader Celsius for videre PCR-analyse.Utfør tre-trinns PCR-baserte skjermer ved hjelp av primere fremover en og reversere en til skjermen for eksistensen av innsetting eller erstatning. Utfør PCR ved hjelp av to forover og reversere to primere for å bekrefte innsetting eller utskifting fra de tre prime regionen. Utfør PCR ved hjelp av primere M13F og reversere tre for å sjekke end-in'HDR.Hold flylinjene med den bekreftede ends-out'HDR og etablere balanserte aksjer fra F2-generasjonen. Kryss ut av balansereren flyr igjen for å fjerne utilsiktede mutasjoner på andre kromosomer. Branchless, eller bnl uttrykk, er vist her i rødt i den tredje instar larver vingeplate, med reseptoren andpusten uttrykke celler, vist i grønt, i den voksende luft sac primordium.Branchless expressing celler er vist her i TR5 tverrgående bindegren og TR2 dorsal gren. Andpusten uttrykke trakealceller er vist her i grønt. Andpusten uttrykkende celler er vist i grønt, merking den utviklende embryonale luftrøret fra trinn ni til trinn 14 og de grenløse uttrykkscellene er vist i rødt.Dette bildet viser grenløst uttrykk indusert i ektopiske vevssteder under hypoksiske forhold, i forhold til kontroll. Denne metoden ble designet for å beholde alle de opprinnelige spatiotemporale forskriftene for grenløs gentranskripsjon. Derfor var det viktig å erstatte bare den første kodeeksonen av genet med LexA transaktivatorkodingssekvensen.Etter utviklingen banet dette nye genetiske verktøysettet veien for å utforske nye vevsuttrykksmønstre i det grenløse genet. Det gjorde det også mulig å misuttrykk av gen og slått ned utelukkende i grenløse uttrykke celler og bidro til å overvåke lineær migrasjon og signalisere interaksjoner av cellene.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Effektiv Gene Transfer i Chick netthinne for primære cellekulturstudier: An<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Electroporation Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

Genome-wide Snapshot av Chromatin regulatorer og statene i<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryoer av Chip-Seq

The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and ...

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

Generering CRISPR / Cas9 mediert Monoallelic Slett å studere Enhancer funksjon i mus embryonale stamceller

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

Identification of Critical Conditions for Immunostaining in the Pea Aphid Embryos: Increasing Tissue Permeability and Decreasing Background Staining

Identifisering av kritiske forhold for Farging i Pea Aphid Embryoet: Økende Tissue Permeabilitet og Avtagende bakgrunnsfarging

The pea aphid Acyrthosiphon pisum, with a sequenced genome and abundant phenotypic plasticity, has become an emerging model for genomic and developmental ...

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

Mikroinjeksjon for transgenesis og Genome redigering i Threespine Sticklebacks

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Disseksjon og flekker av Drosophila Pupal eggstokkene

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Bruk av RNAi og varme-sjokk-indusert transkripsjon faktor uttrykk å omprogrammere bakterie celler til nerveceller i C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Tiner dyrking og Cryopreserving Drosophila linjer

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

Hemogenic omprogrammering av Human fibroblaster av tvungen uttrykk for transkripsjon faktorer

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human ...

In Vitro Culture Strategy for Oocytes from Early Antral Follicle in Cattle

In Vitro Kultur Strategi for Oocytes fra Tidlig Antral Follikkel i Storfe

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that ...