Name: an efficient strategy for generating tissue-specific binary transcription systems in drosophila by genome editing
Uploaded: 2018-09-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing at JoVE.com

Мы благодарим д-р F. порт, доктор K. о ' Коннор-Джайлс и д-р S. Фэн для обсуждения стратегии ТРИФОСФАТЫ; Д-р т.б. Корнберг и центр фондовой Блумингтон реагентов; UMD изображений основного фонда; и финансирование из низ: R00HL114867 и R35GM124878 в СР.

1. Проектирование и строительство gRNA выражение вектор
<ol><li>Чтобы точно заменить долго определенную область экзона, используйте двойной gRNA подход6, в котором каждый gRNA можно конкретно два конца выбранной области интереса. Чтобы получить точное выражение пространственно-вр...

<ol>
	<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Lai, S. -. L., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+mosaic+with+dual+binary+transcriptional+systems+in+Drosophila.">Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila.</a> Nature Neuroscience. 9 (5), 703-709 (2006).</li><li>Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Q+system:+a+repressible+binary+system+for+transgene+expression,+lineage+tracing,+and+mosaic+analysis.">The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis.</a> Cell. 141 (3), 536-548 (2010).</li><li>Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Du, L., Zhou, A., Patel, A., Rao, M., Anderson, K., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+targeted+expression+system+for+branchless+and+characterization+of+novel+cellular+expression+patterns+of+the+gene+in+Drosophila.">Generation of a targeted expression system for branchless and characterization of novel cellular expression patterns of the gene in Drosophila.</a> Developmental Biology. 427 (1), 35-48 (2017).</li><li>Port, F., Chen, H. -. M., Lee, T., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+CRISPR/Cas+tools+for+efficient+germline+and+somatic+genome+engineering+in+Drosophila.">Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), E2967-E2976 (2014).</li><li>Gratz, S. J., Rubinstein, C. D., Harrison, M. M., Wildonger, J., O'Connor-Giles, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+Genome+Editing+in+Drosophila.">CRISPR-Cas9 Genome Editing in Drosophila.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 111 (1), (2015).</li><li>Doench, J. G., Hartenian, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+highly+active+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9-mediated+gene+inactivation.">Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation.</a> Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).</li><li>Port, F., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmenting+CRISPR+applications+in+Drosophila+with+tRNA-flanked+sgRNAs.">Augmenting CRISPR applications in Drosophila with tRNA-flanked sgRNAs.</a> Nature Methods. 13 (10), 852-854 (2016).</li><li>Beumer, K. J., Trautman, J. K., Mukherjee, K., Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor+DNA+Utilization+During+Gene+Targeting+with+Zinc-Finger+Nucleases.">Donor DNA Utilization During Gene Targeting with Zinc-Finger Nucleases.</a> G3. 3 (4), 657-664 (2013).</li><li>Pfeiffer, B. D., Ngo, T. -. T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refinement+of+tools+for+targeted+gene+expression+in+Drosophila.">Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila.</a> Genetics. 186 (2), 735-755 (2010).</li><li>Lin, C. -. C., Potter, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editing+Transgenic+DNA+Components+by+Inducible+Gene+Replacement+in+Drosophila+melanogaster.">Editing Transgenic DNA Components by Inducible Gene Replacement in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 203 (4), 1613-1628 (2016).</li><li>Li, W., K&#246;ster, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+control,+modeling,+and+visualization+of+CRISPR+screens+with+MAGeCK-VISPR.">Quality control, modeling, and visualization of CRISPR screens with MAGeCK-VISPR.</a> Genome Biology. 16 (1), 281 (2015).</li></ol>

Традиционно Drosophila enhancer ловушки были получены двумя различными способами. Один из способов включает случайные вставки водителя (например., Gal4) последовательность в геноме, транспонирования (например., P-элемент транспонирования)1 . Кроме того водитель последов...

Генетических элементов для экспрессии целевых генов был хорошо развита у дрозофилы, что делает его одним из лучших систем модель для изучения функции генов, вовлеченных в самых разнообразных клеточных процессов. Двоичные выражения систем, таких как дрожжи Gal4/Уан (вверх по течению активации последовательности), впервые был принят для ткани конкретных усилитель треппинга и Джин которое в дрозофилы генетических модель1 (рис. 1). Эта система способствовала развитию большое количество методов, таких как пространственно-временных правил гиперэкспрессия генов, которое, нокаут в отдельных групп клеток, также как и абляции клеток, клеток маркировки, Живая трассировка клеточной и молекулярной процессы в эмбриона и тканей, линии трассировки и мозаика анализов во время разработки. Количество двоичных транскрипции системы, такие как бактериальный LexA/LexAОП системы (рис. 1) и Нейроспора Q-системы, являются мощными инструментами генетических, которые сейчас широко используются в дрозофилы, в дополнение к Оригинальный Gal4/Уан система для целевых генов выражение1,2,3.
Здесь мы представляем метод для создания высоконадежных ткани конкретных двоичные выражения системы, используя метод изменения генома. Последние достижения в технологии редактирования генома ТРИФОСФАТЫ/Cas9 позволили беспрецедентные возможности для изменения направлены генома в широком диапазоне организмов. По сравнению с других методов редактирования доступны генома, ТРИФОСФАТЫ/Cas9 система является эффективной, недорогой и надежный. Эта технология использует компоненты бактериальных адаптивной иммунной системы: Cas9 эндонуклеазы Streptococcus pyogenes , который создает двухручьевой перерыв (DSB) и химерных руководство РНК (gRNA), которая направляет на конкретной генома сайт для Cas9 целевые DSB4. Ячейки содержат машины для ремонта DSB, используя различные пути. Non гомологичных конец присоединения (NHEJ) приводит к небольшой вставки или удаления нарушить функции гена, в то время как ориентированные на гомологии ремонт (HDR) вводит определенные направлены/желательно геномной в/стучите нокаут с помощью внешних доноров HDR как шаблон. Стратегии на основе HDR замена эффективно могут быть использованы для создания высоконадежных ткани конкретных двоичные выражения системы, которая может преодолеть все ограничения методов ловушку традиционной усилитель. Мы описываем пошаговые процедуры для использования на основе ТРИФОСФАТЫ/Cas9 HDR ремонта в генерации двоичного транскрипции драйвер линии, которая выражается под контролем эндогенного транскрипционный анализ и post-transcriptional регулирования дрозофила гена. В этом протоколе, мы демонстрируем поколения специфических для драйвера линии внеофисного гена (bnl) кодирования ФБП семьи протеина, который регулирует ветвления морфогенез эпителия трахеи сократимость5. В этом примере первый кодирования экзона гена bnl был заменен последовательность бактериальной Лекса transactivator последовательность без изменения любых эндогенных СНГ-регулирования последовательностей гена bnl . Мы покажем, что стратегия создается линия драйвер Bnl Лекса , spatiotemporally управляет экспрессии гена репортера, размещенных ниже по течению от LexAoperator (LexAop или LexO) исключительно в bnl- выражая эпителиальных/мезенхимальных/нейрональных клеток.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>X-Gal/IPTG</td>
			<td>Gentrox (Genesee Scientific)</td>
			<td>18-218</td>
			<td>cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-Agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>BD&#160;244520</td>
			<td>cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T3253</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E1161</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DNase/RNase-Free Water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10977-023</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10%SDS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71736</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOAc</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>P1190</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>04-355-451</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJET Miniprep</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K0503</td>
			<td>Miniprep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink HiPure Plasmid Maxipep kits</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>K210006</td>
			<td>Maxiprep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbsI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0539S</td>
			<td>Restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>IDT-DNA</td>
			<td></td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCFD4</td>
			<td>Kornberg Lab</td>
			<td></td>
			<td>DNA template and vector for gRNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi Hot Start- (Kapa Biosystems)</td>
			<td>Kapa biosystems</td>
			<td>KK2601</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5-high fidelity Taq</td>
			<td>NEB</td>
			<td>NEB #M0491</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson Assembly Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>NEB #E2611</td>
			<td>DNA assembly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBPnlsLexA:p65Uw</td>
			<td>Addgene</td>
			<td></td>
			<td>DNA template for LexA amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>25530049</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x PCR PreMix, with dye (red)</td>
			<td>Sydlab</td>
			<td>MB067-EQ2R</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel elution kit</td>
			<td>Zymo Research (Genesee Scientific)</td>
			<td>11-300</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRI reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA purification kits</td>
			<td>Zymo Research (Genesee Scientific)</td>
			<td>11-330</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq One-Step RT-PCR Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E5315S</td>
			<td>Molecular Biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lexO-CherryCAAX</td>
			<td>Kornberg Lab</td>
			<td></td>
			<td>Fly line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-CD8:GFP</td>
			<td>Kornberg lab</td>
			<td></td>
			<td>Fly line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>btl-Gal4</td>
			<td>Kornberg lab</td>
			<td></td>
			<td>Fly line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MKRS/TB6B</td>
			<td>Kornberg lab</td>
			<td></td>
			<td>Fly line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope SP5X</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Imaging expression pattern</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 station</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-122WCU</td>
			<td>fly pushing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ-61</td>
			<td>fly pushing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtube homogenizing pestles</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>03-421-217</td>
			<td>genomic DNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an efficient strategy for generating tissue-specific binary transcription systems in drosophila by genome editing

Системы Бинарные транскрипции являются мощные генетических инструменты широко используются для визуализации и обработки клеток судьба и ген выражение в конкретных группах клеток или тканей в модельных организмов. Эти системы содержат два компонента как отдельный трансгенных линий. Линии драйвер выражает transcriptional активатор под контролем ткани конкретных промоутеров/усилители и гаваней линии репортер/эффектор, целевого гена размещены ниже по течению на сайт связывания активатор транскрипции. Животные, укрывательство обоих компонентов побудить transactivation ткани конкретного целевого выражения гена. Точное пространственно-временных выражение гена в целевых тканях имеет решающее значение для объективное освещение деятельности клеток/ген. Таким образом разработка метода для создания эксклюзивных клеток/тканей конкретных драйверов линии имеет важное значение. Здесь мы представляем метод для создания системы весьма ткани конкретных целевых выражение, используя «кластерный регулярно Interspaced короткие палиндром Repeat/ТРИФОСФАТЫ связанные» (ТРИФОСФАТЫ/Cas)-основанные геном редактирования технику. В этом методе эндонуклеазы, которую Cas9 является объектом двух химерных руководство РНК (gRNA) на определенных сайтах в первом кодирования экзона гена в геном дрозофилы для создания двухнитевые разрывы (DSB). Впоследствии с помощью внешних доноров плазмида, содержащий последовательность transactivator, клетки автономного ремонт техники позволяет гомологии направленных ремонт (HDR) ОРС, в результате точного удаления и замены экзона с transactivator последовательности. Постучал в transactivator выражается исключительно в клетках где СНГ-регулирующие элементы заменены гена являются функциональными. Подробные пошаговые протокола, представленные здесь для генерации двоичного транскрипционный анализ драйверов, выраженные в ФБП дрозофилы/внеофисного-производящ клетки эпителия/нейронов может быть принят для любого выражения конкретных генов или ткани.

Этот протокол был успешно использован для создания конкретного целевого двоичного выражения системы репортер на bnl , выражая клетки5. СНГ-регуляторных элементов (КРЕС), которые контролируют сложных пространственно-временных bnl выражение не ...

Watch this Scientific Journal Video about An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing at JoVE.com

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Здесь мы представляем метод для генерации двоичного транскрипции ткани конкретных систем у дрозофилы , заменив первый кодирования экзона генов с драйверами транскрипции. Метод на основе ТРИФОСФАТЫ/Cas9 места transactivator последовательность под эндогенного регулирования сменил гена и следовательно облегчает transctivator выражение исключительно в пространственно-временных структур ген специфического.

Эффективная стратегия для генерации двоичного транскрипции ткани конкретных систем у дрозофилы путем изменения генома

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of ...

Общая цель этого метода заключается в создании высокой ткани конкретных целевой системы выражения. В этом методе мы продемонстрировали генерацию двоичного транскрипционные драйвера, специфичные для нашего омолога Drosophila FGF, без разветвленной. Динамическое, спатиотемпоральное выражение безотвечных регулирует ветвовой гемогенез трахеального эпителия дыхательных путей.Хотя этот метод может дать представление о спатиотемпоральной экспрессии и миграции неотвеки производящих клеток, он может быть легко применен к другим генам и тканям в Дрозофиле или в других модельных организмах, таких как C.Elegans и зебрафиш. Основным преимуществом этого метода является то, что он генерирует экспрессионные системы, которые являются высоко надежными, ткани и генные специфические, и активны исключительно в клетках, где цис нормативных элементов замененного гена являются функциональными. Бинарные транскрипционные системы являются важными инструментами для целевого экспрессии генов и манипуляций.Транс-активатор, такой как GAL4 или LexA, выраженный под контролем регуляторных элементов гена cis, управляет транс-геном effector, который находится ниже по течению от определенных сайтов связывания транскрипции, таких как UAS для GAL4 и/или LexO для LexA. Эта методология заменяет первый экзон кодирования без разветвленного гена драйвером транскрипции. Метод НА основе CRISPR Cas9 помещает последовательность трансактиваторов LexA под эндогенную регуляции безотверхного гена и, следовательно, облегчает трансактиваторное выражение исключительно в безотекторных специфических spatiotemporal моделях.Начните с выбора двух целевых объектов РНК руководства, которые конкретно нацелены на два конца выбранного района, представляющих интерес. Откройте инструмент дизайна CRISPR по выбору. Fly CRISPR Оптимальный целевой finder используется здесь.Нажмите на Select Genome'insert последовательность интереса, и выберите самые последние загружены Drosophila меланогастер генома аннотации, в настоящее время R подчеркнуть шесть, в выпав меню. Далее нажмите Выберите руководство length'and ввода 20. Выберите все цели CRISPR и нажмите Найти цели CRISPR.Оцените все цели руководства кандидата РНК, установив максимум для строгости и NGG only'for PAM. Для создания вектора экспрессии РНК-руководства тандема сначала ПЦР усиливает фрагмент ДНК, чтобы ввести две последовательности протокомеров в вектор экспрессии РНК pCFD4. Используйте перемотку вперед и обратно, каждый с прото-пространство последовательности, и перекрытия с pCFD4 вектор последовательности в ПЦР с использованием высокой точности полимеразы и pCFD4 шаблон ДНК.Чтобы подготовить pCFD4 для клонирования, переварить плазмиду с ферментом Bbs1. Настройка реакции в соответствующем буфере пищеварения, содержащем от двух до пяти микрограммов плазмиды pCFD4 и одного микролитера фермента Bbs1 и конечного объема 50 микролитров. Смешайте содержимое реакции, нажав на трубку и собирая все рассеянные капли от стенки трубки до дна на короткий спин.Инкубировать смесь реакции при 37 градусах по Цельсию в течение двух часов после запуска продукта ПЦР и переварить плазмид на один процент агарозного геля. Очистить 6,4-килограммовую пару линейной плазмиды и 600 базовых пар pcR-продуктов с помощью стандартных столбцов для очистки геля. Настройка реакции сборки ДНК в соответствии с протоколом производителя.Для геномного стука в gal4 или LexA последовательности, дизайн двухместный HDR донора, содержащего транс-активатор последовательности, в окружении двух гомологии оружия. Чтобы избежать повторной таргетинга направляющих РНК на проектируемый локус, разработать замену донора таким образом, чтобы направляющие рнк-сайты распознавания были нарушены введенной экзогенной последовательностью. Кроме того, чтобы избежать изменения чистоты регуляторных элементов cis, всегда выберите направляющие сайты распознавания РНК в регионе кодирования exon.Для создания замены кассеты спланируйте стратегию сборки ДНК, чтобы объединить четыре сегмента вместе. Пять основных и три основных гомологических оружия, средняя экзогенная трансактиваторная последовательность ДНК и линейный вектор клонирования. ПЦР усиливают GAL4 или кассету выражения LexA из соответствующего вектора, а ПЦР усиливает гомологические руки из геномной ДНК, извлеченной из родительской линии мухи, выбранной для инъекций.Используйте полимеразу высокой точности в каждом ПЦР для создания фрагментов цели. Чтобы настроить реакцию сборки ДНК, смешайте линейный вектор клонирования и целевые фрагменты, генерируемые клонированием ПЦР, с мастермиксом сборки ДНК и окончательным объемом реакции до 20 микролитров в соответствии с инструкциями производителя. Инкубировать смесь реакции в течение одного часа при 50 градусах по Цельсию.Когда эмбрионы Nos-Cas9 ранее вводили как с руководством РНК выражение плазмидной и замены донора, развиваться во взрослых, крест G0 летит индивидуально, чтобы сбалансировать ваши мухи от линии, подходящей для целевого аллеля. Обезболивать потомство F1 с каждого креста G0 на панели двуокиси углерода. Случайно выберите от 10 до 20 самцов под стерео микроскопом.Индивидуально пересекаем каждого выбранного самца к женщине-балансеру от линии, подходящей для целевого аллеля. Когда личинки F2 люк, выбрать F1 отца из каждого креста. Извлекайте геномную ДНК, хлюпая каждую муху в течение 10-15 секунд кончиком пипетки, содержащей 50 микролитров хлюпающих буферов без дозирования буфера.Затем, обойтись оставшийся буфер в трубку и хорошо перемешать. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 20-30 минут. После инкубации поместите трубки в тепловой блок 95 градусов по Цельсию в течение одной-двух минут, чтобы инактивировать протеиназу K.After спиннинг вниз в течение пяти минут на 10000 раз G, хранить препарат на четыре градуса Цельсия для дальнейшего анализа ПЦР.Выполните трехшаговую ПЦР-экраны с помощью грунтовки вперед один и обратно один на экран для существования вставки или замены. Выполните PCR, используя вперед два и обратное две грунтовки для проверки вставки или замены из трех основных области. Выполните PCR с помощью грунтовок M13F и обратного три, чтобы проверить концы-in'HDR.Держите лету линий с подтвержденными ends-out'HDR и установить сбалансированные запасы от F2 поколения. Из-накрест балансер летит снова, чтобы удалить любые непреднамеренные мутации на других хромосомах. Ветвленое, или выражение bnl, показано здесь в красном цвете в третьем диске крыла личинок instar, с приемным дыханием выражая клетки, показанные в зеленом цвете, в растущем баке воздуха primordium.Ячейки без разветвленной экспрессии показаны здесь, в поперечной соединительной ветви TR5 и спинной ветви TR2. Дыхание выражения трахеи клетки показаны здесь в зеленом цвете. Дыхательные экспресс-клетки показаны зеленым цветом, отмечая развивающаяся эмбриональная трахея от 9-го этапа до стадии 14, а ветвятные экспресс-клетки показаны красным цветом.На этом изображении показано безотвечное выражение, индуцированное в местах эктопической ткани в гипоксических условиях, по отношению к контролю. Этот метод был разработан, чтобы сохранить все оригинальные spatiotemporal правила разветвленной транскрипции генов. Поэтому важно было заменить только первый экзон кодирования гена последовательностью трансактиватора LexA.После своего развития, этот новый генетический инструментоильный инструмент проложил путь к изучению новых моделей экспрессии тканей без разветвленного гена. Это также позволило гена неправильной экспрессии и сбил исключительно в без разветвленной экспрессии клеток и помогли в мониторинге линейной миграции и сигнализации взаимодействия клеток.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Эффективное Перенос генов в Чик сетчатки для первичной культуры клеток исследований:<em&gt; Экс-ово</em&gt; Электропорация подход

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

Генома Снимок хроматина регуляторов и государства в<em&gt; Xenopus</em&gt; Эмбрионы по чип-Seq

The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and ...

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

Создание CRISPR / cas9 опосредованного моноаллельной Пропуски для изучения Enhancer Функция в эмбриональных стволовых клетках мышей

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

Identification of Critical Conditions for Immunostaining in the Pea Aphid Embryos: Increasing Tissue Permeability and Decreasing Background Staining

Идентификация критических условий для Иммуноокрашивание в гороховой тли эмбрионов: Повышение проницаемости тканей и уменьшения фонового окрашивания

The pea aphid Acyrthosiphon pisum, with a sequenced genome and abundant phenotypic plasticity, has become an emerging model for genomic and developmental ...

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

Микроинъекция для Трансгенез и редактирования генома в трехиглой колюшками

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Рассечение и пятнать дрозофилы куколки яичников

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Применение РНК-интерференции и тепло шок индуцированной выражение фактор транскрипции для перепрограммирования клетки семенозачатка нейронов в C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Размораживание, культивирования и Cryopreserving дрозофила клеточных линий

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

Гемогенное перепрограммирование фибробластов человека путем принудительного выражения факторов транскрипции

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human ...

In Vitro Culture Strategy for Oocytes from Early Antral Follicle in Cattle

In Vitro Культурная стратегия для Oocytes от раннего антрального фолликула в крупного рогатого скота

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that ...