Name: a chromatin immunoprecipitation assay to identify novel nfat2 target genes in chronic lymphocytic leukemia
Uploaded: 2018-12-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia at JoVE.com

هذا العمل كان يدعمها DFG منح مو 3340/1-1 وكريبشيلفي الألمانية منح 111134 (سواء منحت إلى M.R.M.). ونحن نشكر ملنك الكه للمساعدة التقنية الممتازة).

جميع التجارب التي أجريت مع المواد البشرية أقرتها "لجنة الأخلاقيات" التابعة لجامعة توبنغن، وتم الحصول على الموافقة الخطية من جميع المرضى الذين ساهموا بعينات لهذه الدراسة.
1-العزلة والتحفيز جوركات الخلايا
ملاحظة: لتحسين البروتوكول، استخدام خط الخلية جوركات ال?...

الخطوات الحاسمة القيام مقايسة رقاقة ناجحة هي اختيار جسم المناسبة والاستفادة المثلى من الكروماتين القص عملية25. اختيار جسم αNFAT2 ثبت أن يشكل تحديا كبيرا أثناء وضع هذا البروتوكول. بينما توجد العديد من الأجسام المضادة αNFAT2 المتاحة تجارياً وغالبية هذه يعمل بشكل جيد النشاف الغربية ...

سرطان الدم الليمفاوي المزمن (CLL) يمثل سرطان الدم الأكثر شيوعاً في البالغين في البلدان الغربية، نستعرض تراكم متميزة CD19 و CD23 CD5 معربا عن ب نضجاً الخلايا1. معظم المرضى يحمل بالطبع مرض كسول، الذي ليس بالضرورة معاملة محددة لسنوات عديدة. وفي المقابل، تظهر بعض المرضى التقدم السريع التي تتطلب التدخلات العلاجية الفورية مع العلاج الكيميائي المناعي أو غيرها العلاجات المستهدفة2،3. العامل النووي لتنشيط خلايا تي (نفات) عائلة من عوامل النسخ التحكم المختلفة الإنمائية وعمليات التنشيط في الخلية العديد أنواع4،،من56. مؤخرا أثبتنا overexpression وتفعيل NFAT2 في خلايا CLL الدستورية من المرضى الذين يعانون من المرض كسول7. هنا، وهو ينظم إقامة دولة لا تستجيب لتحفيز مستقبلات الخلية بتسمي استعطال7. لإثبات أن NFAT2 بربط البروتين الخاصة بالخلايا اللمفاوية تيروزين كيناز (لك) المروج وينظم لك التعبير في CLL الخلايا البشرية، الإنزيم إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين محددة (شريحة) والعاملين.
رقاقة واحد من عدة تقنيات للتحقيق في دور عوامل النسخ في التعبير الجيني8. أحكام مدبرة التعبير الجيني بطريقة معقدة جداً من المنظمين عدة مع عوامل النسخ أخذ جزءا لا يمكن الاستغناء عنه في هذه العملية9،10،،من1112. وتم تحديد عوامل النسخ تنظيم التعبير الجيني في إطار المكانية والزمانية في عديدة الأنواع (مثل التنمية والتمايز)13،،من1415، 17،،من 1618. الأخطاء في آليات التحكم المعقدة التي تنطوي على عوامل النسخ يمكن أن يؤدي إلى مجموعة متنوعة من العمليات باثولوجي بما في ذلك السرطان19،20. ومن ثم، تحديد عوامل النسخ وأهدافها الخاصة بكل منها قد توفر السبل العلاجية رواية21،22. تتوفر طرق عدة للتحقيق في هذا المجال مثيرة للاهتمام مثل رقاقة والتنقل الغرواني الكهربي التحول المقايسة (أمسا) ومختلف فحوصات الحمض النووي المنسدلة وفحوصات مراسل8،،من1112، 23 , 24.
لإثبات أن عامل نسخ يتفاعل مع مناطق محددة من الجينوم هو المجراة، رقاقة أسلوب مثالي25. لهذا الغرض، تصميمهما الحمض النووي والبروتينات المرتبطة بها في الخلايا الحية هي استخدام الإشعاعات فوق البنفسجية أو فورمالدهايد (رقاقة cross-linked، شكيب). تم حذف هذه الخطوة للحصول على أفضل الحمض النووي والبروتين الانتعاش في رقاقة (نكيب) أصلي ما يسمى26. هي المنفصمة مجمعات البروتين الحمض النووي في وقت لاحق من سونيكيشن إلى شظايا من حوالي 200-500 زوج قاعدي (bp) وإيمونوبريسيبيتاتيد من بين الأنقاض الخلية استخدام جسم معين ضد عامل النسخ للفائدة. أجزاء الحمض النووي المرتبطة بها ثم تنقيته وتتميز ببكر والاستنساخ الجزيئي وتسلسلها. استخدام تقنيات بديلة [ميكروارس] (رقاقة على رقاقة) أو تسلسل الجيل القادم (الرقائق-Seq) لتحليل إيمونوبريسيبيتاتيد الحمض النووي.
رقاقة قدم لأول مرة قبل جيلمور و Lis عام 1984 عندما كانت تستخدم الأشعة فوق البنفسجية ضوء تساهمي قياس الحمض النووي والالتزام البروتينات في المعيشة البكتيريا27. تحلل الخلايا وإيمونوبريسيبيتيشن من البكتيريا الحمض النووي الريبي بوليميراز، استخدمت تحقيقات محددة من الجينات المعروفة لخريطة توزيع في فيفو وكثافة من الحمض النووي الريبي بوليميراز. بعد ذلك استخدمت الأسلوب المحققون نفس لتحليل توزيع التوكسينات رنا بوليميراز الثاني على جينات بروتين الصدمة الحرارة في المورفولوجية28. وقد صقل المقايسة شكيب فارشافسكي وزملاء العمل الذين أول من استخدم فورمالدهايد العابرة للربط إلى دراسة رابطة هيستون H4 مع الحرارة صدمة البروتين الجينات29،30. النهج نكيب، الذي يحمل في الاستفادة من انتعاش الحمض النووي والبروتين أفضل نتيجة سليمة وبطبيعة الحال [ابيتوبس]، وذلك، أولاً وصف أكبر جسم خصوصية، حبيس والزملاء في عام 198831.
ميزة رقاقة بالمقارنة مع التقنيات الأخرى لتحليل التفاعلات البروتين الحمض النووي هو في الواقع، أن التفاعل الفعلي لعامل النسخ يمكن التحقيق في فيفو وعدم إجراء تحقيقات أو ظروف صناعية تم إنشاؤها بواسطة المخازن المؤقتة أو المواد الهلامية ويعمل11،،من812. عن طريق الجمع بين شرائح مع تسلسل الجيل القادم، يمكن تحديد أهداف متعددة في وقت واحد.
القيود الرئيسية لهذا الأسلوب يتم تطبيقه محدودا لفحوصات على نطاق واسع في الكائنات الحية سليمة25. كما يمكن تحليل أنماط التعبير الجيني التفاضلي الصعبة باستخدام تقنيات الرقائق إذا كان يعبر عن البروتينات منها فقط عند مستويات منخفضة أو خلال الإطارات الزمنية الضيقة. عامل يحتمل أن تحد آخر هو توافر جسم مناسبة ملائمة لرقاقة11.
البروتوكول رقاقة المعروضة هنا يمكن أن تستخدمها لتحديد الجينات المستهدفة عامل النسخ في فيفو الكمي PCR الوقت الحقيقي (قرة-PCR). على وجه التحديد، كان الهدف لتحديد الجينات المستهدفة رواية من NFAT2 في CLL. رقاقة اختير بسبب قدرتها على إظهار ربط NFAT2 إلى مناطق المروج الجينات المستهدفة المختلفة تحت الظروف الطبيعية في خلايا المريض CLL الإنسان مباشرة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 X PBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube shaker Themomixer comfort</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5355 000.011</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Bolt Sample Reducing Agent</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X Bolt MES SDS Running Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 % Formaldehyde p.a., ACS</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4979.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4X Bolt LDS Sample Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NFAT2 antibody</td>
			<td>Alexis</td>
			<td>1008505</td>
			<td>Clone 7A6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NFAT2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>8032S</td>
			<td>Clone D15F1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NFAT2 antibody ChIP Grade</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab2796</td>
			<td>Clone 7A6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>big Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804R</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19-FITC mouse Anti-human</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555412</td>
			<td>Clone &#160;HIB19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD5-PE mouse Anti-human CD5&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555353</td>
			<td>Clone &#160;UCHT2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient medium Biocoll&#160; (Density 1,077 g/ml)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>L 6115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tube 1.5 mL</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS superior</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S0615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSCalibur</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>78440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Gel Transfer Device</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IB21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Transfer Stacks, nitrocellulose, regular size</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IB23001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iDeal ChIp-seq kit for Histones</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin calcium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I3909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 680LT Donkey anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5 mg</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>926-68023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Goat anti-Mouse IgG (H + L), 0.1 mg</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>925-32210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LI-COR Odyssey Infrared Imaging System</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>B446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729692001</td>
			<td>Can be substituted with other plates in different real-time PCR instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Solution&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; OptiLyse B</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>IM1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M220 AFA-grade water</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M220 Focused-ultrasonicator</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>500295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic rack, DynaMag-15 Magnet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12301D</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Axiovert 25</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>451200</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer improved counting chamber</td>
			<td>Karl Hecht GmbH &#38;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Co KG</td>
			<td>40442012</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4 Heparin Monovette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>02.1064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey&#174; Blocking Buffer (TBS) 500 mL</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>927-50000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 100X</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A2213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerfeCTa SYBR Green FastMix</td>
			<td>Quanta Bio</td>
			<td>95072-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer CD40L promotor region forward</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-ACTCGGTGTTAGCCAGG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer CD40L promotor region reverse</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer IL-2 promotor region forward</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer IL-2 promotor region reverse</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer LCK promotor region forward</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer LCK promotor region reverse</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit mAb IgG XP Isotype Control</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td># 3900S</td>
			<td>Clone DA1E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time PCR instrument</td>
			<td>Roche</td>
			<td>LightCycler 480</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller mixers</td>
			<td>Phoenix Instrument</td>
			<td>RS-TR 5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>61870010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety-Multifly-needle 21G</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>851638235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>LC5925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker Duomax 1030</td>
			<td>Heidolph Instruments</td>
			<td>543-32205-00</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Heraeus Fresco 17</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#223;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Buffered Saline (TBS-10X)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#12498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>93595-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a chromatin immunoprecipitation assay to identify novel nfat2 target genes in chronic lymphocytic leukemia

سرطان الدم الليمفاوي المزمن (CLL) تتسم بالتوسع في استنساخ الخبيثة بالخليه، ويمثل سرطان الدم الأكثر شيوعاً في البلدان الغربية. وتظهر غالبية المرضى CLL مساراً كسول للمرض وكذلك النمط الظاهري أنيرجيك على خلايا سرطان الدم، مشيراً إلى مستقبلات خلية بلا تستجيب للمؤثر الخارجي. وقد أظهرنا مؤخرا أن عامل النسخ NFAT2 منظم حاسمة من استعطال في CLL. تحديا كبيرا في تحليل دور عامل النسخ في أمراض مختلفة هي تحديد الجينات المستهدفة المحددة لها. وهذا له أهمية كبيرة لتوضيح آليات pathogenetic والتدخلات العلاجية المحتملة. إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين (شريحة) هو أسلوب كلاسيكي لإظهار تفاعلات البروتين-الحمض النووي ويمكن، لذلك، تحديد الجينات هدفا مباشرا لعوامل النسخ في خلايا الثدييات. هنا، استخدمت شريحة لتحديد لك كجينات مستهدفة مباشرة من NFAT2 في الخلايا CLL البشرية. الحمض النووي والبروتينات المرتبطة كروسلينكيد استخدام فورمالدهايد والمنفصمة فيما بعد من سونيكيشن إلى شظايا من الحمض النووي من حوالي 200-500 قاعدة أزواج (bp). Cross-linked شظايا من الحمض النووي المرتبطة NFAT2، ثم بشكل انتقائي إيمونوبريسيبيتاتيد من الحطام الخلية باستخدام جسم مضاد αNFAT2. بعد تنقية، يتم الكشف عن شظايا من الحمض النووي المرتبطة بها عن طريق PCR الكمي في الوقت الحقيقي (قرة-PCR). تسلسل الحمض النووي بتخصيب واضحا تمثل مناطق الجينوم التي تستهدفها NFAT2 في فيفو. القص المناسب للحمض النووي، واختيار جسم المطلوبة أهمية حاسمة لنجاح تطبيق هذا الأسلوب. هذا البروتوكول مثالي لمظاهرة التفاعلات المباشرة من NFAT2 مع الجينات المستهدفة. قصره الرئيسي هو صعوبة توظيف الرقائق في فحوصات واسعة النطاق تحليل الجينات المستهدفة لعدة عوامل النسخ في الكائنات الحية سليمة.

ويبين الشكل 1 تحليل الخلوي تدفق مثالي للمريض CLL المنجزة بعد تلطيخ مع الأجسام المضادة CD19 فيتك و CD5-PE. ويبين الشكل 1a النابضة الخلايا الليمفاوية، يمثلون غالبية الخلايا في الدم لدى المرضى CLL. ويبين الشكل 1 باء نسبة CD19+/CD5+ ...

Watch this Scientific Journal Video about A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia at JoVE.com

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

سرطان الدم الليمفاوي المزمن (CLL) هو سرطان الدم الأكثر شيوعاً في العالم الغربي. هي عوامل النسخ نفات المنظمين هامة للتنمية والتنشيط في العديد من أنواع الخلايا. نقدم هنا، بروتوكول لاستخدام لونين إيمونوبريسيبيتيشن (رقاقة) في الخلايا البشرية CLL لتحديد الجينات المستهدفة رواية من NFAT2.

الإنزيم إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين لتحديد الجينات المستهدفة NFAT2 الرواية في سرطان الدم الليمفاوي المزمن

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في توفير معلومات أساسية في مجال الأورام مثل تحديد الجينات المستهدفة المفترضة والآليات المسببة للأمراض لتطوير التدخلات العلاجية المحتملة. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن للمرء أن يكتشف تفاعل NFAT2 وعوامل النسخ الأخرى مع الجينات المستهدفة المعروفة والرواية. عموما الأفراد الجدد لهذه الطريقة سوف النضال لأن التثبيت الأمثل وظروف القص من الصعب إنشاء.لبدء ملء أنبوب 1.5 ملليلتر مع ملليلتر واحد من 37٪ الفورمالديهايد. ثم ملء أنبوب آخر 1.5 ملليلتر مع ملليلتر واحد من 1.25 الجلايسين المولر في أنبوب خمسة ملليلتر مع أربعة ملليلتر من برنامج تلفزيوني. بعد ذلك ، بعد تحفيز الخلايا تدور الخلايا وفقًا لبروتوكول النص ، وإعادة تعليق الخلايا في 500 ميكرولترات من PBS ووضع الأنبوب في صندوق مملوء بالجليد.إضافة 13.5 ميكرولترات من 37٪ الفورمالديهايد إلى الخلايا ومزيج عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. ثم احتضان التعليق في درجة حرارة الغرفة. بعد هذا، إضافة 57 ميكرولترات من 1.25 جليسين المولر لوقف التثبيت.والسماح للتعليق لاحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. مباشرة بعد فترة الحضانة وضع الخلايا على الجليد والطرد المركزي الخلايا في 500 مرة G لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية. ثم تعرق المُندفع.بعد ذلك ، اغسل الخلايا مرتين بميليلتر واحد من PBS البارد في 200 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية وإزالة المابير. Resuspend بيليه الخلية في خمسة ملليلتر من عازلة تحلل واحد عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. ثم وضع العينات على الجليد واحتضان لهم مع اهتزاز لمدة 10 دقائق.بعد ذلك، الطرد المركزي الأنابيب في 500 مرة G لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية. ثم استخدام ماصة لإزالة بعناية فائقة. التجانس الخلايا في خمسة ملليلتر من العازلة تحلل اثنين وماصة صعودا وهبوطا لخلط.ثم احتضان الخلايا على الجليد لمدة 10 دقائق مع اهتزاز. بعد فترة الحضانة الطرد المركزي الأنابيب في 500 مرة G لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية، وإزالة بعناية فائقة. المقبل, resuspend بيليه الخلية في القص العازلة واحدة مع مثبطات بروتياس 1X.ثم احتضان تعليق الخلية على الجليد لمدة 10 دقائق. نقل 140 microliters من تعليق الخلية إلى أنابيب sonicator مع الحرص على تجنب تشكيل فقاعات الهواء. ضع الأنابيب في أوفوق الصوتيات المركزة عند سبع درجات مئوية ومق وإلى 10 إلى 7 دقائق و1/2 دقيقة.نقل تعليق الخلية إلى أنابيب 1.5 ملليلتر. الطرد المركزي العينات في 15، 700 مرات G لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية، وجمع الماطن في أنبوب جديد. أولاً، إعداد 20 ميكروليترات من الخرز المغلف بالبروتين لكل هطول للأمطار في أنبوب واحد 1.5 ملليلتر.السماح للخرز لتسوية على رف المغناطيسي لمدة دقيقة واحدة، وإزالة supernatant. ثم غسل الخرز مع 40 ميكروليترس من 1X رقاقة العازلة واحد لكل 20 ميكرولترات من البروتين A المغلفة الخرز عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. السماح للخرز لتسوية على رف المغناطيسي لمدة دقيقة واحدة وإزالة supernatant.كرر عملية الغسيل هذه ثلاث مرات أخرى قبل إعادة تعليق الخرز في حجمها الأصلي من 1X chIP العازلة واحدة. إضافة مثبطات البروتياز BSA، 5X chIP العازلة، وChIP-seq الصف المياه إلى الخرز. بعد ذلك، إضافة الكروماتين المُقطّر.استخدم 10 ميكروجرامات من الأجسام المضادة NFAT2 لالتقاط NFAT2، و2.5 ميكروغرام من الأجسام المضادة IgG كتحكم. احتضان المخاليط بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية على عجلة الدورية في ستة دورة في الدقيقة. في اليوم التالي تدور الأنابيب لمدة خمس ثوان في 7،000 مرات G واحتضان لهم على الرف المغناطيسي لمدة دقيقة واحدة.ثم الطامح ونافر غسل الخرز مرة واحدة مع مخازن غسل واحد، اثنين، ثلاثة، وأربعة على التوالي. تدور الأنابيب لمدة خمس ثوان في 7000 مرات G قبل احتضان الأنابيب على الرف المغناطيسي لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك، قم بإزالة المابير الزائد وإضافة المخزن المؤقت التالي للغسيل.بعد الغسيل الأخير، تدور الأنابيب لمدة خمس ثوان في 7000 مرة G.ااحتضان الأنابيب على الرف المغناطيسي لمدة دقيقة واحدة. إزالة supernatant و اتخاذ الخرز في 100 ميكرولترات من عازلة elution واحد. ثم احتضان الأنابيب على عجلة دوارة لمدة 30 دقيقة.بعد ذلك، تدور لفترة وجيزة الأنابيب ووضعها على رف المغناطيسي لمدة دقيقة واحدة. نقل supernatant إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر وإضافة أربعة microliters من عازلة elution اثنين. لإنشاء مزيج التحكم في المدخلات ميكرولتر واحد من كروماتين القص مع 99 ميكرولترات من عازلة elution واحد وأربعة ميكرولترات من عازلة elution اثنين.ثم احتضان العينات لمدة أربع ساعات في 65 درجة مئوية مع اهتزاز. بعد هذا، إضافة 100 ميكرولترات من 100٪ isopropanol إلى الأنابيب. دوامة وتدور العينات لمدة خمس ثوان في 7000 مرة G.Then إضافة 10 ميكرولترات من الخرز المغناطيسي لكل عينة.دوامة واحتضان العينات على عجلة دوارة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة. بعد ذلك، تدور الأنابيب لفترة وجيزة ووضعها على رف المغناطيسي لمدة دقيقة واحدة. التعرق وssuspend الخرز في 100 ميكرولترات من غسل العازلة واحد.عكس الأنابيب لخلط واحتضان لهم لمدة خمس دقائق على عجلة دوارة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، لفترة وجيزة الطرد المركزي الأنابيب. وضعها في رف المغناطيسي لمدة دقيقة واحدة، واستخدام ماصة لإزالة افر.ثم إضافة 100 ميكروليتر من العازلة غسل اثنين. عكس الأنابيب لخلط واحتضان لهم لمدة خمس دقائق على عجلة دوارة في درجة حرارة الغرفة. بعد هذا، لفترة وجيزة الطرد المركزي الأنابيب ووضعها في رف المغناطيسي لمدة دقيقة واحدة.إزالة العازلة غسل اثنين عن طريق الطموح وإعادة ربط الخرز في 55 ميكرولتررس من عازلة elution. ل elute الزّناء المُعجّل يحضن العينات في عجلة دوارة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك، تدور الأنابيب لفترة وجيزة ووضعها في رف المغناطيسي لمدة دقيقة واحدة.وأخيرا، نقل عظمى إلى أنابيب جديدة 1.5 ملليلتر. تم تنفيذ هذا البروتوكول لأول مرة مع خلايا جوركات تحليل LCK كهدف NFAT2 المحتملة. وكما هو مبين هنا، فقد تم توثيق النتائج المثلى من خلال إثراء كبير للضوابط الإيجابية IL-2 والحمض النووي LCK.قد يؤدي القص دون الأمثل أو التثبيت المفقود إلى ضعف جودة الحمض النووي. وأخيراً، تم تنفيذ هذا البروتوكول مع خلايا CLL الإنسان الأولية مع CD40L بمثابة التحكم الإيجابي وLCK كهدف تجريبي. كما يتضح من الإثراء القوي للحمض النووي LCK ، LCK هو هدف مباشر NFAT2 في الخلايا CLL البشرية الأولية.يمكن أن يؤدي القص غير الكافي إلى وجودة الحمض النووي الرديئة النتائج دون المستوى الأمثل. في حين تحاول هذا الإجراء من المهم أن نتذكر أن التثبيت وخطوات سونيكيشن حاسمة لنجاح هذه الطريقة، وربما يجب تعديلها إلى الخلايا التي يجري تحليلها.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

الاستفادة من علم الجينوم وظيفية الفرز لتحديد أهداف المخدرات رواية يحتمل في الثقافات كروي الخلية السرطانية

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

بروتوكول شامل للعينة ونخاع العظام عملية قياس الأمراض المتبقية قابلة للقياس والخلايا الجذعية ليوكيميك في سرطان الدم النقوي الحاد

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

التدفق الخلوي لتقدير لوكيميا الخلايا الجذعية في الابتدائي سرطان الدم النقوي الحاد والمريض-المشتقة-تكثيفها، في التشخيص والمتابعة حتى

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Native Chromatin Immunoprecipitation Using Murine Brain Tumor Neurospheres

إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين الأصلية باستخدام نيوروسفيريس ورم الدماغ مورين

Epigenetic modifications may be involved in the development and progression of glioma. Changes in methylation and acetylation of promoters and regulatory ...

Immunoglobulin Gene Sequence Analysis In Chronic Lymphocytic Leukemia: From Patient Material To Sequence Interpretation

غلوبيولين مناعي تحليل تسلسل الجين في اللوكيميا اللمفاوية المزمنة: من المواد المريض إلى تفسير التسلسل

During B cell maturation, the complex process of immunoglobulin (IG) gene V(D)J recombination coupled with somatic hypermutation (SHM) gives rise to a ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

تقييم الأيضية للخلايا اللوكيميا الرئيسية

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

في المختبر الاختبار لدراسة التفاعل الورم الضامة

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

A Data Integration Workflow to Identify Drug Combinations Targeting Synthetic Lethal Interactions

سير عمل تكامل البيانات لتحديد مجموعات الأدوية التي تستهدف التفاعلات القاتلة الاصطناعية

A synthetic lethal interaction between two genes is given when knock-out of either one of the two genes does not affect cell viability but knock-out of ...

Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking

تجزئه خلايا سرطان الدم اللمفاوية المزمنة الاوليه لرصد الاتجار بالبروتين النووي/الخلوي

Nuclear export of macromolecules is often deregulated in cancer cells. Tumor suppressor proteins, such as p53, can be rendered inactive due to aberrant ...

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

تحليل الورم وتوزيع الأنسجة من مستضد الهدف الأجسام المضادة العلاجية محددة

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...