Name: a chromatin immunoprecipitation assay to identify novel nfat2 target genes in chronic lymphocytic leukemia
Uploaded: 2018-12-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af DFG give MU 3340/1-1 og Deutsche Krebshilfe give 111134 (begge tildeles M.R.M.). Vi takker Elke Malenke for fremragende teknisk bistand).

Alle eksperimenter udført med humant materiale blev godkendt af den etiske komité i universitetet i Tübingen og skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter, der har bidraget prøver til denne undersøgelse.
1. isolering og Stimulation af Jurkat celler
Bemærk: For at optimere protokollen, bruge linjen Jurkat celle, som er kendt for at udtrykke de høje niveauer af NFAT2. Alle trin er udført under en laminar flow hætte.
<ol><li>Forberede 50 ...

De kritiske trin for at udføre en vellykket ChIP assay er udvælgelsen af en passende antistof og optimering af kromatin klipning proces25. Udvælgelsen af αNFAT2 antistof viste sig for at være særligt udfordrende under udviklingen af denne protokol. Mens der er flere αNFAT2 antistoffer kommercielt tilgængelige, og fleste af disse virker fint for western blotting og andre programmer, var klon 7A6 den eneste antistof, som med held kan anvendes til ChIP7. Selv angivelig...

Kronisk lymfatisk leukæmi (CLL) repræsenterer den mest almindelige leukæmi hos voksne i de vestlige lande, udstiller forskellige ophobning af CD19, CD23 og CD5 at udtrykke modne B-celler1. De fleste patienter udviser en indolent sygdomsforløb, som ikke kræver særlig behandling i mange år. Derimod viser nogle patienter hurtig progression kræver øjeblikkelig terapeutiske indgreb med immun-kemoterapi eller andre målrettede behandlinger2,3. Nukleare faktor af aktiverede T-celler (NFAT) er en familie af transskriptionsfaktorer kontrollerende forskellige udviklingsmæssige og aktivering processer i talrige celle typer4,5,6. Vi har for nylig vist overekspression og konstitutionelle aktivering af NFAT2 i CLL celler fra patienter med indolent sygdom7. Her, regulerer det en tilstand til B-celle receptoren stimulation kaldet anergy7. For at vise, at NFAT2 binder sig til lymfocyt-specifikke protein tyrosin kinase (LCK) promotor og regulerer LCK udtryk i menneskets CLL celler, en specifik kromatin immunoprecipitation assay blev (ChIP) udviklet og ansat.
Chippen er en af de flere teknikker til at undersøge rollen af transkriptionsfaktorer i gen expression8. Genekspression er stramt orkestreret i en meget kompliceret måde af flere tilsynsmyndigheder med transskriptionsfaktorer at tage en uerstattelig rolle i denne proces9,10,11,12. Transkriptionsfaktorer regulering genekspression i rumlige og tidsmæssige sammenhæng er blevet påvist i talrige arter (f.eks. til udvikling og differentiering)13,14,15, 16,17,18. Fejl i de indviklede kontrolmekanismer, der involverer transskriptionsfaktorer kan føre til en række forskellige patologiske processer, herunder kræft19,20. Derfor, identifikation af transkriptionsfaktorer og deres respektive mål kunne tilbyde nye terapeutiske muligheder21,22. For at undersøge dette spændende felt fås flere metoder som ChIP, elektroforese mobilitet Skift assay (EMSA), forskellige DNA pull-down assays og reporter-assays8,11,12, 23 , 24.
For at demonstrere, at en bestemt transkriptionsfaktor interagerer med specifikke områder af genomet er in vivo ChIP en ideel teknik25. Til dette formål, er DNA og tilknyttede proteiner i levende celler krydskÃ¦det, ved hjælp af UV-bestråling eller formaldehyd (krydsbundet ChIP, XChIP). Dette trin er udeladt at opnå bedre DNA og protein opsving i den såkaldte native ChIP (NChIP)26. DNA-protein komplekser er efterfølgende forskydes ved hjælp af sonikering i fragmenter af cirka 200-500 basepar (bp) og immunoprecipitated fra celle debris ved hjælp af et specifikt antistof mod transkriptionsfaktor af interesse. De tilknyttede DNA fragmenter er derefter renset og karakteriseret ved PCR, kloning af molekylære og sekventering. Alternative teknikker bruge microarrays (ChIP-on-Chip) eller næste generation sequencing (ChIP-Seq) til at analysere immunoprecipitated DNA.
ChIP blev først indført af Gilmour og Lis i 1984, hvornår de brugte UV lys til kovalent cross-link DNA og bundet proteiner i levende bakterier27. På celle lysis og immunoprecipitation af bakterielle RNA polymerase, blev specifikke sonder i kendte gener brugt til at tilknytte i vivo fordelingen og tæthed af RNA-polymerase. Metoden blev efterfølgende brugt af samme efterforskerne for at analysere fordelingen af eukaryote RNA polymerase II på heat shock protein gener i Drosophila28. XChIP analysen blev yderligere raffineres af Varshavsky og kolleger, der først bruges formaldehyd cross-linking for at studere sammenslutningen af Histon H4 med heat shock protein gener29,30. Den NChIP tilgang, der bærer fordelen ved en bedre DNA og protein opsving på grund af naturligt intakt epitoper og derfor større antistof specificitet, blev første gang beskrevet af Hebbes og kolleger i 198831.
Fordel af ChIP i forhold til andre teknikker til at analysere DNA-protein interaktioner er faktisk, at den faktiske samspil af en transkriptionsfaktor kan være undersøgte i vivo og ingen sonder eller kunstige betingelser skabt af buffere eller geler er ansat8,11,12. Ved at kombinere ChIP med næste generation sequencing, kan blive identificeret flere mål samtidig.
Store begrænsninger af denne teknik er den begrænsede anvendelighed for storstilet assays i intakt organismer25. Analyse af differential gen expression mønstre kan også være udfordrende ved hjælp af ChIP teknikker, hvis de respektive proteiner udtrykkes kun på lavt niveau eller under smalle tidsvinduer. En anden potentielt begrænsende faktor er tilgængeligheden af en passende antistof velegnet til ChIP11.
ChIP protokollen præsenteres her kan være ansat i vivo identifikation af target gener af en transkriptionsfaktor ved kvantitative real-time PCR (qRT-PCR). Specifikt, var målet at identificere nye mål gener af NFAT2 i CLL. ChIP blev valgt på grund af dets potentiale til at direkte vise bindingen af NFAT2 til regionerne promotor af forskellige mål gener under naturlige forhold i CLL patienten menneskeceller.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 X PBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube shaker Themomixer comfort</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5355 000.011</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Bolt Sample Reducing Agent</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X Bolt MES SDS Running Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 % Formaldehyde p.a., ACS</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4979.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4X Bolt LDS Sample Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NFAT2 antibody</td>
			<td>Alexis</td>
			<td>1008505</td>
			<td>Clone 7A6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NFAT2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>8032S</td>
			<td>Clone D15F1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NFAT2 antibody ChIP Grade</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab2796</td>
			<td>Clone 7A6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>big Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804R</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19-FITC mouse Anti-human</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555412</td>
			<td>Clone &#160;HIB19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD5-PE mouse Anti-human CD5&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555353</td>
			<td>Clone &#160;UCHT2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient medium Biocoll&#160; (Density 1,077 g/ml)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>L 6115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tube 1.5 mL</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS superior</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S0615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSCalibur</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>78440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Gel Transfer Device</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IB21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Transfer Stacks, nitrocellulose, regular size</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IB23001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iDeal ChIp-seq kit for Histones</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin calcium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I3909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 680LT Donkey anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5 mg</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>926-68023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Goat anti-Mouse IgG (H + L), 0.1 mg</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>925-32210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LI-COR Odyssey Infrared Imaging System</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>B446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729692001</td>
			<td>Can be substituted with other plates in different real-time PCR instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Solution&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; OptiLyse B</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>IM1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M220 AFA-grade water</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M220 Focused-ultrasonicator</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>500295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic rack, DynaMag-15 Magnet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12301D</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Axiovert 25</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>451200</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer improved counting chamber</td>
			<td>Karl Hecht GmbH &#38;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Co KG</td>
			<td>40442012</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4 Heparin Monovette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>02.1064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey&#174; Blocking Buffer (TBS) 500 mL</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>927-50000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 100X</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A2213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerfeCTa SYBR Green FastMix</td>
			<td>Quanta Bio</td>
			<td>95072-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer CD40L promotor region forward</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-ACTCGGTGTTAGCCAGG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer CD40L promotor region reverse</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer IL-2 promotor region forward</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer IL-2 promotor region reverse</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer LCK promotor region forward</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer LCK promotor region reverse</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit mAb IgG XP Isotype Control</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td># 3900S</td>
			<td>Clone DA1E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time PCR instrument</td>
			<td>Roche</td>
			<td>LightCycler 480</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller mixers</td>
			<td>Phoenix Instrument</td>
			<td>RS-TR 5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>61870010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety-Multifly-needle 21G</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>851638235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>LC5925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker Duomax 1030</td>
			<td>Heidolph Instruments</td>
			<td>543-32205-00</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Heraeus Fresco 17</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#223;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Buffered Saline (TBS-10X)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#12498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>93595-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a chromatin immunoprecipitation assay to identify novel nfat2 target genes in chronic lymphocytic leukemia

Kronisk lymfatisk leukæmi (CLL) er karakteriseret ved udvidelse af maligne B celle kloner og repræsenterer den mest almindelige leukæmi i de vestlige lande. Fleste CLL patienter vise en indolent løbet af sygdommen samt en anergic Fænotypen af deres leukæmiceller, henviser til en B-celle receptoren ikke reagerer på eksterne stimulation. Vi har for nylig vist, at transkriptionsfaktor NFAT2 er en afgørende regulator af anergy i CLL. En stor udfordring i analysen af rollen, som en transkriptionsfaktor i forskellige sygdomme er identifikation af dets særlige mål gener. Dette er af stor betydning for belysning af patogenetisk mekanismer og potentielle terapeutiske indgreb. Kromatin immunoprecipitation (ChIP) er en klassisk teknik til at påvise protein-DNA interaktioner og kan derfor anvendes til at identificere direkte mål gener af transkriptionsfaktorer i pattedyrsceller. Her, blev ChIP brugt til at identificere LCK som et direkte mål gen af NFAT2 i CLL menneskeceller. DNA og tilknyttede proteiner er crosslinked ved hjælp af formaldehyd og efterfølgende forskydes ved hjælp af sonikering i DNA fragmenter af cirka 200-500 basepar (bp). Tværbundet DNA fragmenter forbundet med NFAT2 er derefter selektivt immunoprecipitated fra celle debris ved hjælp af en αNFAT2 antistof. Efter rensning, er tilknyttede DNA fragmenter fundet via kvantitative real-time PCR (qRT-PCR). DNA-sekvenser med tydelig berigelse repræsenterer områder af genomet, som er ramt af NFAT2 i vivo. Passende klipning af DNA og udvælgelsen af de påkrævede antistof er særligt afgørende for vellykket anvendelse af denne metode. Denne protokol er ideel til demonstration af direkte samspillet mellem NFAT2 med target gener. Dens store begrænsning er svært at ansætte ChIP i storstilet assays analysere target gener af flere transkriptionsfaktorer i intakt organismer.

Figur 1 viser en eksemplarisk flow flowcytometri analyse af en CLL patienten udført efter farvning med FITC CD19 og CD5-PE antistoffer. Figur 1a viser gating af lymfocytter, der repræsenterer størstedelen af celler i blodet hos CLL patienter. Figur 1b viser andelen af CD19+/CD5+ CLL celler, der udgør 89.03% af lymfocytter i dette eksempel. Andelen af CD19+/CD5<sup...

Watch this Scientific Journal Video about A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia at JoVE.com

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

Kronisk lymfatisk leukæmi (CLL) er den mest almindelige leukæmi i den vestlige verden. NFAT transkriptionsfaktorer er vigtige regulatorer af udvikling og aktivering i talrige celletyper. Vi præsenterer her, en protokol til brug af kromatin immunoprecipitation (ChIP) i humane CLL celler til at identificere nye mål gener af NFAT2.

En kromatin Immunoprecipitation analyse til at identificere nye NFAT2 Target gener i kronisk lymfatisk leukæmi

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

Denne metode kan bidrage til at tilvejebringe vigtige oplysninger inden for onkologi, såsom identifikation af formodede målgener og patogene mekanismer til udvikling af potentielle terapeutiske indgreb. Den største fordel ved denne teknik er, at man kan opdage samspillet mellem NFAT2 og andre transskription faktorer med kendte og nye mål gener. Generelt enkeltpersoner nye til denne metode vil kæmpe, fordi optimal fiksering og klipning betingelser er vanskelige at etablere.Til at begynde at fylde en 1,5-milliliter rør med en milliliter 37% formaldehyd. Fyld derefter et andet 1,5 milliliterrør med en milliliter 1,25 molarglycin i et fem milliliterrør med fire milliliter PBS. Dernæst efter stimulering af cellerne spin cellerne i henhold til tekstprotokollen, og re-suspendere cellerne i 500 mikroliter af PBS og placere røret i en isfyldt kasse.Tilsæt 13,5 mikroliter på 37% formaldehyd til cellerne og bland ved pipettering op og ned. Derefter inkuberes suspensionen ved stuetemperatur. Derefter tilsættes 57 mikroliter på 1,25 molarglycin for at stoppe fikseringen.Og lad suspensionen inkubere ved stuetemperatur i fem minutter. Umiddelbart efter inkubationstiden placere cellerne på is og centrifuge cellerne på 500 gange G i fem minutter ved fire grader Celsius. Derefter aspirere supernatant.Dernæst vaskes cellerne to gange med en milliliter iskold PBS ved 200 gange G i fem minutter ved fire grader Celsius, og supernatanten fjernes. Opslæmning af cellepillerne i fem milliliter lysisbuffer en ved at pipettere op og ned. Derefter sætte prøverne på is og inkubere dem med omrystning i 10 minutter.Efter dette, centrifuge rørene ved 500 gange G i fem minutter ved fire grader Celsius. Brug derefter en pipette til forsigtigt at fjerne supernatanten. Homogeniser cellerne i fem milliliter lysis buffer to og pipette op og ned for at blande.Derefter inkuberes cellerne på is i 10 minutter med omrystning. Efter inkubationstiden centrifugerørene ved 500 gange G i fem minutter ved fire grader Celsius, og forsigtigt fjerne supernatant. Dernæst resuspend cell pellet i klipning buffer en med 1X protease hæmmer.Derefter inkuberes cellesuspensionen på is i 10 minutter. Overfør 140 mikroliter af cellesuspensionen til sonikatorrør, der skal sikres for at undgå at danne luftbobler. Placer rørene i en fokuseret ultralydsmaskine ved syv grader Celsius og forskydning i 10 til syv og 1/2 minut.Cellesuspensionen overføres til 1,5 milliliterrør. Centrifuge prøverne ved 15, 700 gange G i 10 minutter ved fire grader Celsius, og indsamle supernatant i et nyt rør. Først forberede 20 mikroliter protein A-belagt perler for hver nedbør i en 1,5-milliliter rør.Lad perlerne sætte sig på en magnetisk rack i et minut, og fjern supernatanten. Vask derefter perlerne med 40 mikroliter af 1X chip buffer en for hver 20 mikroliter af protein A-belagte perler ved pipettering op og ned. Lad perlerne sætte sig på en magnetisk rack i et minut og fjern supernatanten.Gentag denne vaskeproces tre gange mere, før du igen suspenderer perlerne i deres oprindelige volumen på 1X chIP buffer en. Tilføj BSA proteasehæmmer, 5X chIP buffer, og ChIP-seq grade vand til perlerne. Dernæst tilsættes den skåret kromatin.Brug 10 mikrogram anti-NFAT2 antistof til at fange NFAT2 og 2,5 mikrogram IgG-antistof som kontrol. Inkuber blandingerne natten over ved fire grader Celsius på et hjul, der roterer ved seks omdrejningstal. Den næste dag spin rørene i fem sekunder ved 7, 000 gange G og inkubere dem på den magnetiske rack i et minut.Derefter aspirere supernatant og vask perlerne en gang med vask buffere en, to, tre og fire på hinanden følgende. Drej rørene i fem sekunder ved 7000 gange G, før rørene inkuberes på den magnetiske rist i et minut. Derefter skal du fjerne supernatanten og tilføje den næste vaskebuffer.Efter den sidste vask drejes rørene i fem sekunder ved 7000 gange G.Inkuber rørene på den magnetiske rist i et minut. Fjern supernatant og tage op perlerne i 100 mikroliter af elution buffer en. Derefter inkuberes rørene på det roterende hjul i 30 minutter.Dernæst kort dreje rørene og læg dem på en magnetisk rack i et minut. Overfør supernatanten til et nyt 1,5 milliliterrør, og tilsæt fire mikroliter af elution buffer to. For at oprette input kontrol mix en mikroliter af den skåret kromatin med 99 mikroliter af elution buffer en og fire mikroliter af elution buffer to.Derefter inkuberes prøverne i fire timer ved 65 grader Celsius med omrystning. Efter dette, tilsæt 100 mikroliter af 100% isopropanol til rørene. Vortex og drej prøverne i fem sekunder ved 7000 gange G.Derefter tilsættes 10 mikroliter magnetiske perler til hver prøve.Vortex og inkuber prøverne på et roterende hjul ved stuetemperatur i en time. Drej derefter rørene kortvarigt og læg dem på et magnetisk rack i et minut. Inspirer supernatanten og resuspend perlerne i 100 mikroliter af vask buffer en.Inverter rørene til at blande og inkubere dem i fem minutter på et roterende hjul ved stuetemperatur. Dernæst kortvarigt centrifuge rørene. Placer dem i en magnetisk rack i et minut, og bruge en pipette til at fjerne supernatant.Derefter tilsættes 100 mikroliter af vask buffer to. Inverter rørene til at blande og inkubere dem i fem minutter på et roterende hjul ved stuetemperatur. Derefter centrifugeres rørene kortvarigt, og de anbringes i et magnetisk stativ i et minut.Fjern vaskebuffer to via aspiration og resuspend perlerne i 55 mikroliter af elution buffer. For at fremkalde de udfældede DNA-inkubere prøverne i et roterende hjul ved stuetemperatur i 15 minutter. Derefter drejer rørene kortvarigt og læg dem i et magnetisk stativ i et minut.Endelig overføre supernatant til nye 1,5-milliliter rør. Denne protokol blev først udført med Jurkat celler analysere LCK som en potentiel NFAT2 mål. Som vist her blev optimale resultater dokumenteret ved betydelig berigelse af IL-2 positiv kontrol og LCK DNA.Suboptimal klipning eller manglende fiksering kan føre til dårlig kvalitet DNA. Endelig blev denne protokol udført med primære humane CLL-celler med CD40L, der fungerede som den positive kontrol og LCK som forsøgsmål. Som det fremgår af den stærke berigelse af LCK DNA, er LCK et direkte NFAT2-mål i primære humane CLL-celler.Utilstrækkelig klipning resulterer i dårlig kvalitet DNA kan returnere suboptimale resultater. Mens du forsøger denne procedure er det vigtigt at huske, at fiksering og sonikering skridt er afgørende for succes af denne metode og måske skal justeres til de celler, der analyseres.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Ved hjælp af Functional Genomics Screening at identificere potentielt nyt lægemiddel mod cancer Cell sfæroide Cultures

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Omfattende protokol til prøven og proces knoglemarven til at måle målbare Residual sygdom og Leukemic stamceller i akut Myeloid leukæmi

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Flow flowcytometri for at vurdere leukæmi stamceller i primære akut Myeloid leukæmi og Patient-afledt-xenografts, på diagnose og følg op

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Native Chromatin Immunoprecipitation Using Murine Brain Tumor Neurospheres

Native kromatin Immunoprecipitation ved hjælp af Murine hjerne Tumor Neurospheres

Epigenetic modifications may be involved in the development and progression of glioma. Changes in methylation and acetylation of promoters and regulatory ...

Immunoglobulin Gene Sequence Analysis In Chronic Lymphocytic Leukemia: From Patient Material To Sequence Interpretation

Immunglobulin-gen Sekvensanalyse i kronisk lymfatisk leukæmi: Fra Patient materiale til sekvens fortolkning

During B cell maturation, the complex process of immunoglobulin (IG) gene V(D)J recombination coupled with somatic hypermutation (SHM) gives rise to a ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

Vurdering af primære leukæmiceller metaboliske profil

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

In vitro-analyse for at studere tumor-makrofag interaktion

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

A Data Integration Workflow to Identify Drug Combinations Targeting Synthetic Lethal Interactions

En dataintegrationsarbejdsgang til identifikation af lægemiddelkombinationer, der er målrettet mod syntetiske dødelige interaktioner

A synthetic lethal interaction between two genes is given when knock-out of either one of the two genes does not affect cell viability but knock-out of ...

Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking

Subcellulære fraktionering af primære kroniske Lymfocytiske leukæmiceller til at overvåge nuklear/cytoplasmisk protein handel

Nuclear export of macromolecules is often deregulated in cancer cells. Tumor suppressor proteins, such as p53, can be rendered inactive due to aberrant ...

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

Analyse af tumor og væv distribution af Target Antigen specifikke terapeutiske antistof

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...