Name: a chromatin immunoprecipitation assay to identify novel nfat2 target genes in chronic lymphocytic leukemia
Uploaded: 2018-12-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door de DFG verlenen MU 3340/1-1 en de Deutsche Krebshilfe verlenen 111134 (beide toegekend aan M.R.M.). Wij danken Elke Malenke voor uitstekende technische bijstand).

Alle experimenten met menselijk materiaal werden goedgekeurd door de ethische commissie van de Universiteit van Tübingen en geïnformeerde toestemming is verkregen van alle patiënten die hebben bijgedragen aan deze studie monsters.
1. isolatie en stimulatie van de Jurkat cellen
Opmerking: Voor het optimaliseren van het protocol, gebruikt u de Jurkat cel waarvan bekend is dat de hoge niveaus van NFAT2 express. Alle stappen worden uitgevoerd onder de motorkap van een ...

De kritische stappen voor het uitvoeren van een succesvolle ChIP test zijn de selectie van een geschikte antilichaam en de optimalisatie van de chromatine proces25schuintrekken. De selectie van het antilichaam αNFAT2 bleek bijzonder uitdagende tijdens de ontwikkeling van dit protocol. Hoewel er verschillende αNFAT2 antilichamen verkrijgbare en de meerderheid van deze werkt prima voor het westelijke bevlekken en andere toepassingen, was kloon 7A6 de enige antilichaam dat met succes kan worden geb...

Chronische lymfatische leukemie (CLL) vertegenwoordigt de meest voorkomende leukemie bij volwassenen in de westerse landen, vertonen verschillende accumulatie van CD19, CD23 en CD5 uitdrukken van de rijpe B cellen1. De meeste patiënten vertonen een cursus vadsig ziekte, die geen specifieke behandeling voor vele jaren geïmplementeerde vergt. Sommige patiënten Toon daarentegen snelle progressie vereisen onmiddellijke therapeutische interventies met immuun-chemotherapie of andere gerichte therapieën2,3. Nucleaire factor van geactiveerde T-cellen (NFAT) is een familie van transcriptiefactoren beheersing van verschillende ontwikkelings- en activering processen in talrijke cel typen4,5,6. We toonden onlangs overexpressie en constitutionele activering van NFAT2 in CLL cellen van patiënten met vadsig ziekte7. Hier, regelt het een niet-reagerende staat aan B-cel receptor stimulatie anergie7genoemd. Om aan te tonen dat NFAT2 aan de organisator van lymfocyt-specifieke proteïne tyrosine kinase (LCK bindt) en LCK expressie in menselijke CLL cellen, een specifieke chromatine immunoprecipitation assay regelt werd (ChIP) ontwikkeld en ingezet.
ChIP is een van de verschillende technieken voor het onderzoeken van de rol van transcriptiefactoren in gen expressie8. Genexpressie is strak georkestreerd in een zeer complexe wijze door verschillende regelgevers met transcriptiefactoren een onvervangbaar deel te nemen aan dit proces9,10,11,12. Transcriptiefactoren regulering van de expressie van genen in een ruimtelijke en temporele context geconstateerd in talrijke soorten (bijvoorbeeld voor ontwikkeling en differentiatie)13,14,15, 16,17,18. Fouten in de ingewikkelde controlemechanismen waarbij transcriptiefactoren kunnen leiden tot een verscheidenheid van pathologische processen waaronder kanker19,20. Vandaar, identificatie van transcriptiefactoren en hun respectieve doelstellingen kan bieden nieuwe therapeutische mogelijkheden21,22. Om te onderzoeken van dit intrigerende veld zijn verschillende methoden beschikbaar, zoals de ChIP, elektroforetische mobiliteit shift assay (EMSA), verschillende DNA pull-down testen en verslaggever-assays8,11,12, 23 , 24.
Om aan te tonen dat een bepaalde transcriptiefactor met specifieke regio's van het genoom interageert is in vivo ChIP een ideale techniek25. Voor dit doel, DNA en geassocieerde eiwitten in levende cellen worden kruiselings gekoppelde met behulp van UV-bestraling of formaldehyde (kruislings gekoppelde ChIP, XChIP). Deze stap wordt weggelaten om betere DNA en eiwit herstel in de zogenaamde native ChIP (NChIP)26te verkrijgen. De DNA-eiwitcomplexen worden vervolgens geschoren met het ultrasoonapparaat in stukjes van ongeveer 200-500 basenparen (bp) en immunoprecipitated uit het puin van de cel met behulp van een specifiek antilichaam tegen de transcriptiefactor van belang. De bijbehorende DNA-fragmenten zijn vervolgens gezuiverd en gekenmerkt door PCR, moleculaire klonen en rangschikken. Alternatieve technieken microarrays (ChIP-on-Chip) of de volgorde van de volgende generatie (ChIP-Seq) gebruiken voor het analyseren van de immunoprecipitated van DNA.
ChIP voor het eerst werd geïntroduceerd door Gilmour en Lis in 1984 toen ze UV gebruikt licht aan covalent kruislings gekoppelde DNA en eiwitten gebonden in levende bacteriën27. Lysis van de cel en immunoprecipitation van bacteriële RNA polymerase, werden specifieke sondes van bekende genen gebruikt om de in vivo distributie en de dichtheid van RNA polymerase kaart. De methode werd later gebruikt door de dezelfde onderzoekers voor het analyseren van de verdeling van eukaryotische RNA polymerase II op warmte schok eiwit genen bij Drosophila28. De bepaling van de XChIP werd verder verfijnd door Varshavsky en collega's die voor het eerst gebruikt formaldehyde dwarsbinding om te bestuderen van de vereniging van Histon H4 met warmte schok eiwit genen29,30. De NChIP benadering, die het voordeel van een betere DNA en eiwit herstel als gevolg van natuurlijk intact epitopes draagt en dus meer antilichamenspecificiteit, voor het eerst werd beschreven door Hebbes en collega's in 198831.
Het voordeel van ChIP in vergelijking met andere technieken voor het analyseren van DNA-eiwit interactie is in feite dat de werkelijke interactie van een transcriptiefactor onderzocht in vivo en geen sondes worden kan of kunstmatige omstandigheden gemaakt door buffers of gels 8,11,12in dienst. Door het combineren van ChIP met next-generation sequencing, kunnen meerdere doelen tegelijk worden geïdentificeerd.
Belangrijke beperkingen van deze techniek zijn de beperkte toepasbaarheid voor grootschalige testen in intact organismen25. De analyse van differentiële gen-expressiepatronen kunnen ook uitdagende met behulp van de ChIP technieken als de respectieve eiwitten worden uitgedrukt, alleen op een laag niveau of tijdens smalle tijd windows. Een ander potentieel beperkende factor is de beschikbaarheid van een passende antilichaam geschikt voor ChIP11.
Het protocol van de ChIP hier gepresenteerd kan worden gebruikt voor de identificatie in vivo van doelgenen van een transcriptiefactor door kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR). Specifiek, was het doel om het identificeren van de roman doelgenen van NFAT2 in CLL. ChIP werd gekozen omwille van zijn potentieel te tonen direct de binding van NFAT2 aan de promotor regio's van verschillende doelgenen onder natuurlijke omstandigheden in menselijke CLL patiënt cellen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 X PBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube shaker Themomixer comfort</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5355 000.011</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Bolt Sample Reducing Agent</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X Bolt MES SDS Running Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 % Formaldehyde p.a., ACS</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4979.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4X Bolt LDS Sample Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NFAT2 antibody</td>
			<td>Alexis</td>
			<td>1008505</td>
			<td>Clone 7A6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NFAT2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>8032S</td>
			<td>Clone D15F1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NFAT2 antibody ChIP Grade</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab2796</td>
			<td>Clone 7A6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>big Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804R</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19-FITC mouse Anti-human</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555412</td>
			<td>Clone &#160;HIB19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD5-PE mouse Anti-human CD5&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555353</td>
			<td>Clone &#160;UCHT2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient medium Biocoll&#160; (Density 1,077 g/ml)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>L 6115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tube 1.5 mL</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS superior</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S0615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSCalibur</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>78440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Gel Transfer Device</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IB21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Transfer Stacks, nitrocellulose, regular size</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IB23001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iDeal ChIp-seq kit for Histones</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin calcium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I3909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 680LT Donkey anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5 mg</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>926-68023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Goat anti-Mouse IgG (H + L), 0.1 mg</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>925-32210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LI-COR Odyssey Infrared Imaging System</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>B446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729692001</td>
			<td>Can be substituted with other plates in different real-time PCR instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Solution&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; OptiLyse B</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>IM1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M220 AFA-grade water</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M220 Focused-ultrasonicator</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>500295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic rack, DynaMag-15 Magnet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12301D</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Axiovert 25</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>451200</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer improved counting chamber</td>
			<td>Karl Hecht GmbH &#38;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Co KG</td>
			<td>40442012</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4 Heparin Monovette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>02.1064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey&#174; Blocking Buffer (TBS) 500 mL</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>927-50000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 100X</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A2213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerfeCTa SYBR Green FastMix</td>
			<td>Quanta Bio</td>
			<td>95072-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer CD40L promotor region forward</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-ACTCGGTGTTAGCCAGG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer CD40L promotor region reverse</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer IL-2 promotor region forward</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer IL-2 promotor region reverse</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer LCK promotor region forward</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer LCK promotor region reverse</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit mAb IgG XP Isotype Control</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td># 3900S</td>
			<td>Clone DA1E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time PCR instrument</td>
			<td>Roche</td>
			<td>LightCycler 480</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller mixers</td>
			<td>Phoenix Instrument</td>
			<td>RS-TR 5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>61870010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety-Multifly-needle 21G</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>851638235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>LC5925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker Duomax 1030</td>
			<td>Heidolph Instruments</td>
			<td>543-32205-00</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Heraeus Fresco 17</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#223;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Buffered Saline (TBS-10X)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#12498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>93595-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a chromatin immunoprecipitation assay to identify novel nfat2 target genes in chronic lymphocytic leukemia

Chronische lymfatische leukemie (CLL) wordt gekenmerkt door de groei van kwaadaardige B-cell klonen en vertegenwoordigt de meest voorkomende leukemie in westerse landen. De meerderheid van CLL patiënten tonen een vadsig verloop van de ziekte en het fenotype van een anergic van hun leukemie cellen, verwijzend naar een B-cel receptor niet reageert op externe stimulatie. We hebben onlangs aangetoond dat de transcriptiefactor NFAT2 een belangrijke regulator van de anergie in CLL is. Een grote uitdaging in de analyse van de rol van een transcriptiefactor in verschillende ziekten is de identificatie van haar specifieke doelgenen. Dit is van groot belang voor de opheldering van pathogenetische mechanismen en potentiële therapeutische interventies. Chromatine immunoprecipitation (ChIP) is een klassieke techniek om aan te tonen van eiwit-DNA interacties en kan daarom worden gebruikt om te identificeren directe doelgenen van transcriptiefactoren in zoogdiercellen. Hier, was ChIP gewend LCK identificeren als een directe doel-gen van NFAT2 in menselijke cellen van CLL. DNA en geassocieerde eiwitten zijn kruisverwijzende met formaldehyde en vervolgens geschoren met het ultrasoonapparaat in DNA-fragmenten van ongeveer 200-500 basenparen (bp). Kruislings gekoppelde DNA-fragmenten die zijn gekoppeld aan de NFAT2 zijn dan selectief immunoprecipitated uit het puin van de cel met behulp van een antilichaam αNFAT2. Na zuivering, worden de bijbehorende DNA-fragmenten gedetecteerd via kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR). DNA-sequenties met duidelijk verrijking vertegenwoordigen regio's van het genoom die het doelwit van NFAT2 in vivo. Passende afknippen van het DNA en de selectie van het vereiste antilichaam zijn van bijzonder groot belang voor de succesvolle toepassing van deze methode. Dit protocol is ideaal voor de demonstratie van directe interacties van NFAT2 met doelgenen. De belangrijkste beperking is de moeilijkheid om de ChIP in grootschalige testen analyseren van de doelgenen van meerdere transcriptiefactoren in intact organismen in dienst.

Figuur 1 toont een voorbeeldige stroom cytometry analyse van een patiënt van de CLL na kleuring met CD19-FITC en CD5-PE antilichamen uitgevoerd. Figuur 1a blijkt de gating van de lymfocyten, de meerderheid van de cellen in het bloed van CLL patiënten vertegenwoordigt. Figuur 1b toont het aandeel van de CD19+/CD5+ CLL cellen die procent van de 89.03 van lymfocyten in het volgen...

Watch this Scientific Journal Video about A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia at JoVE.com

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

Chronische lymfatische leukemie (CLL) is de meest voorkomende leukemie in de westerse wereld. NFAT transcriptiefactoren zijn belangrijk regulatoren van ontwikkeling en activering in vele celtypes. Hier presenteren we een protocol voor het gebruik van chromatine immunoprecipitation (ChIP) in menselijke CLL cellen te identificeren roman doelgenen van NFAT2.

Een chromatine Immunoprecipitation Assay te identificeren van roman NFAT2 doelgenen in chronische lymfatische leukemie

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

Deze methode kan helpen om belangrijke informatie op het gebied van oncologie te verstrekken, zoals de identificatie van vermeende doelgenen en pathogene mechanismen om potentiële therapeutische interventies te ontwikkelen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat men de interactie van NFAT2 en andere transcriptiefactoren met bekende en nieuwe doelgenen kan detecteren. Over het algemeen individuen nieuw op deze methode zal worstelen, omdat optimale fixatie en scheren voorwaarden zijn moeilijk vast te stellen.Om te beginnen vullen een 1,5-milliliter buis met een milliliter van 37%formaldehyde. Vul vervolgens nog eens een buis van 1,5 milliliter met een milliliter glycine van 1,25 molaire glycine in een buis van vijf milliliter met vier milliliter PBS. Vervolgens, na de stimulatie van de cellen draaien de cellen volgens het tekstprotocol, en opnieuw opschorten van de cellen in 500 microliter van PBS en plaats de buis in een met ijs gevulde doos.Voeg 13,5 microliter van 37% formaldehyde toe aan de cellen en meng door op en neer te pipetten. Vervolgens de vering bij kamertemperatuur uitbroeden. Voeg hierna 57 microliter van 1,25 molaire glycine toe om de fixatie te stoppen.En laat de vering vijf minuten op kamertemperatuur uitbroeden. Onmiddellijk na de incubatietijd plaats de cellen op ijs en centrifugeren de cellen op 500 keer G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Dan aspirate de supernatant.Vervolgens was de cellen twee maal met een milliliter ijskoude PBS op 200 keer G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius en verwijder de supernatant. Resuspend de cel pellet in vijf milliliter lysis buffer een door pipetting op en neer. Zet vervolgens de monsters op ijs en broed ze met schudden voor 10 minuten.Daarna, centrifugeren de buizen op 500 keer G gedurende vijf minuten op vier graden Celsius. Gebruik vervolgens een pipet om de supernatant voorzichtig te verwijderen. Homogenize de cellen in vijf milliliter lyse buffer twee en pipet op en neer te mengen.Dan incubeer de cellen op ijs gedurende 10 minuten met schudden. Na de incubatietijd centrifugeren de buizen op 500 keer G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius, en verwijder voorzichtig de supernatant. Vervolgens resuspend de cel pellet in scheren buffer een met 1X protease remmer.Dan incubeer de cel suspensie op ijs voor 10 minuten. Breng 140 microliter van de celsuspensie over naar sonicatorbuizen die ervoor zorgen dat luchtbellen niet worden gevormd. Plaats de buizen in een gerichte ultrasoonmaker op zeven graden Celsius en schuif gedurende 10 tot 7 en 1/2 minuten.Breng de celsuspensie over in buizen van 1,5 milliliter. Centrifugeren de monsters op 15, 700 keer G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius, en het verzamelen van de supernatant in een nieuwe buis. Bereid eerst 20 microliter eiwitvormige kralen voor elke neerslag in één buis van 1,5 milliliter.Laat de kralen zich een minuut op een magnetisch rek nestelen en verwijder de supernatant. Was vervolgens de kralen met 40 microliters van 1x chip buffer een voor elke 20 microliter eiwit A-gecoate kralen door pipet op en neer. Laat de kralen zich een minuut op een magnetisch rek nestelen en verwijder de supernatant.Herhaal dit wasproces nog drie keer voordat u de kralen opnieuw opschors in hun oorspronkelijke volume van 1X chIP buffer één. Voeg BSA protease inhibitor, 5X chIP buffer, en ChIP-seq grade water aan de kralen. Voeg vervolgens de afschuifde chromatine toe.Gebruik 10 microgram anti-NFAT2-antilichaam om NFAT2 en 2,5 microgram IgG-antilichaam als controle af te vangen. Incubeer de mengsels 's nachts op vier graden Celsius op een wiel draaien op zes RPM. De volgende dag draai de buizen gedurende vijf seconden op 7,000 keer G en broed ze een minuut lang uit op het magnetische rek.Spoel dan de supernatant aan en was de kralen een keer met wasbuffers één, twee, drie en vier achtereenvolgens. Draai de buizen vijf seconden op 7000 keer G voordat u de buizen op het magnetische rek gedurende één minuut uitbroedt. Verwijder hierna de supernatant en voeg de volgende wasbuffer toe.Na de laatste wasbeurt, draai de buizen gedurende vijf seconden op 7000 keer G.Incubate de buizen op het magnetische rek voor een minuut. Verwijder de supernatant en neem de kralen in 100 microliters van elutie buffer een. Vervolgens broeden de buizen op het roterende wiel gedurende 30 minuten.Draai vervolgens kort de buizen en leg ze een minuut op een magnetisch rek. Breng de supernatant naar een nieuwe 1,5-milliliter buis en voeg vier microliters van elution buffer twee. Om de input control mix een microliter van de afschuifde chromatine met 99 microliters van elution buffer een en vier microliters van elutie buffer twee.Dan incubeer de monsters voor vier uur op 65 graden Celsius met schudden. Voeg hierna 100 microliter van 100% isopropanol toe aan de buizen. Vortex en draai de monsters gedurende vijf seconden op 7000 keer G.Voeg vervolgens 10 microliter magnetische kralen toe aan elk monster.Vortex en incubeer de monsters op een roterend wiel bij kamertemperatuur gedurende een uur. Draai vervolgens de buizen kort en leg ze een minuut op een magnetisch rek. Aspirate de supernatant en resuspend de kralen in 100 microliters van wasbuffer een.Keer de buizen om te mengen en uit te broeden gedurende vijf minuten op een roterend wiel bij kamertemperatuur. Vervolgens kort centrifugeren de buizen. Plaats ze in een magnetisch rek voor een minuut, en gebruik een pipet om de supernatant te verwijderen.Voeg vervolgens 100 microliter wasbuffer twee toe. Keer de buizen om te mengen en uit te broeden gedurende vijf minuten op een roterend wiel bij kamertemperatuur. Daarna, kort centrifugeren de buizen en leg ze in een magnetisch rek voor een minuut.Verwijder de wasbuffer twee via aspiratie en zet de kralen opnieuw op in 55 microliter elutiebuffers. Om het neergeslagen DNA te ontvogen, worden de monsters gedurende 15 minuten in een roterend wiel bij kamertemperatuur geïncuneerd. Draai de buizen daarna kort en leg ze een minuut in een magnetisch rek.Tot slot, breng de supernatant naar nieuwe 1,5-milliliter buizen. Dit protocol werd voor het eerst uitgevoerd met Jurkat cellen analyseren LCK als een potentiële NFAT2 doel. Zoals hier getoond, werden de optimale resultaten gedocumenteerd door significante verrijking van de IL-2 positieve controle en LCK DNA.Suboptimale afschuif of ontbrekende fixatie kan leiden tot dna van slechte kwaliteit. Ten slotte werd dit protocol uitgevoerd met primaire menselijke CLL-cellen met CD40L die als positieve controle en LCK als experimenteel doelwit dienen. Zoals blijkt uit de sterke verrijking van LCK DNA, LCK is een direct NFAT2 doel in primaire menselijke CLL cellen.Onvoldoende scheren wat resulteert in slechte kwaliteit DNA kan suboptimale resultaten terug te geven. Tijdens een poging tot deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de fixatie en sonicatie stappen zijn cruciaal voor het succes van deze methode en kan moeten worden aangepast aan de cellen worden geanalyseerd.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Gebruik makend van Functional Genomics Screening om potentieel nieuwe drug targets in Cancer Cell Sferoïde Cultures Identificeer

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Uitgebreide Protocol bij monster en proces beenmerg voor het meten van meetbare residuele ziekte en leukemische cellen van de stam in Acute myeloïde leukemie

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Stroom Cytometry om te schatten leukemie cellen van de stam in primaire Acute myeloïde leukemie en patiënt-afgeleid-xenografts, bij diagnose en Follow Up

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Native Chromatin Immunoprecipitation Using Murine Brain Tumor Neurospheres

Native chromatine Immunoprecipitation met behulp van lymfkliertest Brain Tumor Neurospheres

Epigenetic modifications may be involved in the development and progression of glioma. Changes in methylation and acetylation of promoters and regulatory ...

Immunoglobulin Gene Sequence Analysis In Chronic Lymphocytic Leukemia: From Patient Material To Sequence Interpretation

Immunoglobuline Gene sequentieanalyse In chronische lymfatische leukemie: Van patiënt materiaal reeks interpretatie

During B cell maturation, the complex process of immunoglobulin (IG) gene V(D)J recombination coupled with somatic hypermutation (SHM) gives rise to a ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

Beoordeling van de metabole Profiel van primaire leukemie cellen

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

In vitro assay om tumor-macrofaag interactie te bestuderen

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

A Data Integration Workflow to Identify Drug Combinations Targeting Synthetic Lethal Interactions

Een workflow voor gegevensintegratie om medicijncombinaties te identificeren die gericht zijn op synthetische dodelijke interacties

A synthetic lethal interaction between two genes is given when knock-out of either one of the two genes does not affect cell viability but knock-out of ...

Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking

Subcellulaire fractionering van primaire chronische lymfatische leukemie cellen om te controleren van nucleaire/cytoplasmatische eiwit handel

Nuclear export of macromolecules is often deregulated in cancer cells. Tumor suppressor proteins, such as p53, can be rendered inactive due to aberrant ...

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

Analyse van tumor- en weefselverdeling van doelantigeen-specifiek therapeutisch antilichaam

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...