Name: a chromatin immunoprecipitation assay to identify novel nfat2 target genes in chronic lymphocytic leukemia
Uploaded: 2018-12-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par la DFG accorder MU 3340/1-1 et la Deutsche Krebshilfe accordent 111134 (tous deux attribués à M.R.M.). Nous remercions Elke Malenke excellente assistance technique).

Toutes les expériences menées avec le matériel humain ont été approuvées par le Comité d’éthique de l’Université de Tübingen et consentement éclairé a été obtenu de tous les patients qui ont contribué à cette étude, les échantillons.
1. isolement et Stimulation de Jurkat cellules
Remarque : Pour optimiser le protocole, utilisez la lignée Jurkat dont on sait qu’expriment des niveaux élevés de NFAT2. Toutes les mesures sont effectuées sous u...

Les étapes cruciales d’effectuer une analyse réussie de la puce sont la sélection d’un anticorps approprié et l’optimisation de la chromatine processus25de cisaillement. La sélection de l’anticorps αNFAT2 s’est avérée particulièrement difficile lors de l’élaboration du présent protocole. Bien qu’il existe plusieurs anticorps αNFAT2 disponibles dans le commerce et la majorité de ces oeuvres fines pour éponger occidental et d’autres applications, clone 7 a 6 a été le ...

Leucémie lymphoïde chronique (LLC) représente la leucémie plus courante chez les adultes dans les pays occidentaux, présentant une accumulation distincte de CD19, CD5 et CD23 exprimant B mature cellules1. La plupart des patients présentent une évolution de la maladie indolente, qui ne nécessite pas de traitement spécifique pendant de nombreuses années. En revanche, certains patients montrent une progression rapide nécessitant des interventions thérapeutiques immédiates avec immunitaire-chimiothérapie ou autres thérapies ciblées2,3. Facteur nucléaire des lymphocytes T activés (NFAT) est une famille de facteurs de transcription contrôlant divers du développement et processus d’activation de nombreuses cellules types4,5,6. Nous avons démontré récemment surexpression et activation constitutionnelle de NFAT2 dans les cellules CLL de patients atteints de maladie indolente7. Ici, il règle un État ne répondant pas à la stimulation des récepteurs de cellules de B appelé anergie7. Pour démontrer que les NFAT2 se lie au promoteur lymphocytes spécifiques protéine tyrosine kinase (LCK) et régule l’expression LCK dans les cellules humaines du CLL, une analyse d’immunoprécipitation de la chromatine spécifiques (ChIP) a été développée et utilisée.
Puce est une des plusieurs techniques pour enquêter sur le rôle des facteurs de transcription à l' expression de gène8. L’expression des gènes est bien orchestrée de façon très complexe par plusieurs organismes de réglementation présentant des facteurs de transcription, en tenant un rôle irremplaçable dans ce processus9,10,11,12. Facteurs de transcription régulant l’expression de gène dans un contexte spatial et temporel ont été identifiés chez de nombreuses espèces (par exemple, pour le développement et la différenciation)13,14,15, 16,17,18. Erreurs dans les mécanismes de contrôle complexes faisant intervenir des facteurs de transcription peuvent conduire à une variété de processus pathologiques, y compris le cancer19,20. Par conséquent, identification des facteurs de transcription et de leurs cibles respectives peut-être offrir nouvelles avenues thérapeutiques21,22. Afin d’étudier ce domaine fascinant, plusieurs méthodes sont disponibles comme puce, analyse de décalage de mobilité électrophorétique (EMSA), différents dosages d’ADN déroulants et journaliste-essais8,11,12, 23 , 24.
Pour démontrer qu’un certain facteur de transcription interagit avec certaines régions du génome, in vivo, ChIP est une technique idéale de25. À cet effet, ADN et protéines associées dans les cellules vivantes sont réticulées en utilisant l’irradiation UV ou formaldéhyde (puce réticulé, XChIP). Cette étape est omise pour obtenir le meilleur ADN et récupération de protéines dans la dite native de puce (NChIP)26. Par la suite, les complexes de protéines et l’ADN sont cisaillés par sonication en fragments d’environ 200 à 500 paires de bases (PB) et immunoprécipitée des débris cellulaires à l’aide d’un anticorps spécifique contre le facteur de transcription d’intérêt. Les fragments d’ADN associées sont ensuite purifiées et caractérisées par PCR, clonage et séquençage. Techniques alternatives utilisent des puces à ADN (ChIP-on-Chip) ou le séquençage de prochaine génération (ChIP-Seq) pour analyser l’ADN d’immunoprécipitée.
Puce a été introduite par Gilmour et Lis en 1984 quand ils ont utilisé des UV lumière de façon covalente de réticulation ADN et lié des protéines dans la vie des bactéries27. Lors de la lyse cellulaire et immunoprécipitation de la polymérase de l’ARN, des sondes spécifiques de gènes connus ont été utilisés pour cartographier la in vivo la distribution et la densité de l’ARN polymérase. La méthode a été par la suite utilisée par les mêmes chercheurs pour analyser la distribution des eucaryote ARN polymérase II sur les gènes de protéines de choc thermique dans la drosophile28. Le test de XChIP a été affiné par Varshavsky et collègues de travail qui a d’abord été utilisé formaldéhyde de réticulation pour étudier l’association de l’histone H4 avec heat shock protéines gènes29,30. L’approche NChIP, qui comporte l’avantage d’une meilleure récupération de l’ADN et des protéines en raison des épitopes naturellement intactes et, par conséquent, une plus grande spécificité de l’anticorps, a été décrite par Hebbes et collègues 198831.
L’avantage de la puce par rapport à d’autres techniques pour analyser les interactions ADN-protéines est en fait, que l’interaction réelle d’un facteur de transcription peut être étudié in vivo et aucune des sondes ou des conditions artificielles créées par des tampons ou des gels sont employait8,11,12. En combinant puce avec le séquençage de nouvelle génération, plusieurs cibles peuvent être identifiés en même temps.
Les principales limites de cette technique sont son applicabilité limitée aux essais à grande échelle dans les organismes intact25. L’analyse des modèles d’expression différentielle des gènes peut être aussi difficile à l’aide de techniques de puce si les protéines respectifs sont exprimés uniquement à des niveaux bas ou pendant les fenêtres de temps étroit. Un autre facteur potentiellement limitant est la disponibilité d’un anticorps approprié adapté pour puce11.
Le protocole de puce présenté ici peut être employé pour identifier des gènes de cible d’un facteur de transcription in vivo par PCR en temps réel quantitative (qRT-PCR). Plus précisément, l’objectif était d’identifier les gènes de la nouvelle cible de NFAT2 en CLL. Puce a été choisi en raison de son potentiel de démontrer directement la liaison de la NFAT2 pour les régions promotrices des gènes cibles différents dans des conditions naturelles dans des cellules humaines CLL patients.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 X PBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube shaker Themomixer comfort</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5355 000.011</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Bolt Sample Reducing Agent</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X Bolt MES SDS Running Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 % Formaldehyde p.a., ACS</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4979.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4X Bolt LDS Sample Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NFAT2 antibody</td>
			<td>Alexis</td>
			<td>1008505</td>
			<td>Clone 7A6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NFAT2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>8032S</td>
			<td>Clone D15F1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NFAT2 antibody ChIP Grade</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab2796</td>
			<td>Clone 7A6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>big Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804R</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19-FITC mouse Anti-human</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555412</td>
			<td>Clone &#160;HIB19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD5-PE mouse Anti-human CD5&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555353</td>
			<td>Clone &#160;UCHT2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient medium Biocoll&#160; (Density 1,077 g/ml)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>L 6115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tube 1.5 mL</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS superior</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S0615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSCalibur</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>78440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Gel Transfer Device</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IB21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Transfer Stacks, nitrocellulose, regular size</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IB23001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iDeal ChIp-seq kit for Histones</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin calcium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I3909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 680LT Donkey anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5 mg</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>926-68023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Goat anti-Mouse IgG (H + L), 0.1 mg</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>925-32210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LI-COR Odyssey Infrared Imaging System</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>B446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729692001</td>
			<td>Can be substituted with other plates in different real-time PCR instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Solution&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; OptiLyse B</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>IM1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M220 AFA-grade water</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M220 Focused-ultrasonicator</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>500295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic rack, DynaMag-15 Magnet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12301D</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Axiovert 25</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>451200</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer improved counting chamber</td>
			<td>Karl Hecht GmbH &#38;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Co KG</td>
			<td>40442012</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4 Heparin Monovette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>02.1064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey&#174; Blocking Buffer (TBS) 500 mL</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>927-50000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 100X</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A2213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerfeCTa SYBR Green FastMix</td>
			<td>Quanta Bio</td>
			<td>95072-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer CD40L promotor region forward</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-ACTCGGTGTTAGCCAGG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer CD40L promotor region reverse</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer IL-2 promotor region forward</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer IL-2 promotor region reverse</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer LCK promotor region forward</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer LCK promotor region reverse</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit mAb IgG XP Isotype Control</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td># 3900S</td>
			<td>Clone DA1E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time PCR instrument</td>
			<td>Roche</td>
			<td>LightCycler 480</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller mixers</td>
			<td>Phoenix Instrument</td>
			<td>RS-TR 5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>61870010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety-Multifly-needle 21G</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>851638235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>LC5925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker Duomax 1030</td>
			<td>Heidolph Instruments</td>
			<td>543-32205-00</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Heraeus Fresco 17</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#223;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Buffered Saline (TBS-10X)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#12498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>93595-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a chromatin immunoprecipitation assay to identify novel nfat2 target genes in chronic lymphocytic leukemia

Leucémie lymphoïde chronique (LLC) est caractérisée par l’expansion des clones de cellules malignes de B et représente la leucémie la plus courante dans les pays occidentaux. La majorité des patients atteints de LLC montrent une lente évolution de la maladie ainsi qu’un phénotype anergiques de leurs cellules de la leucémie, se référant à un récepteur des cellules B ne répond pas à une stimulation externe. Nous avons récemment démontré que le facteur de transcription NFAT2 est un régulateur crucial d’anergie à CLL. Un défi majeur dans l’analyse du rôle d’un facteur de transcription dans différentes maladies est l’identification de ses gènes cibles spécifiques. Il s’agit d’une grande importance pour l’élucidation des mécanismes pathogéniques et interventions thérapeutiques potentielles. Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) est une technique classique pour démontrer les interactions protéine-ADN et, par conséquent, permet d’identifier les gènes de la cible directe de facteurs de transcription dans des cellules de mammifères. Ici, ChIP a été utilisée pour identifier LCK comme un gène cible directe des NFAT2 dans les cellules humaines de CLL. L’ADN et protéines associées sont réticulés à l’aide de formaldéhyde et cisaillement par la suite par sonication dans des fragments d’ADN d’environ 200 à 500 paires de bases (bp). Des fragments d’ADN réticulés associés à NFAT2 sont ensuite sélectivement immunoprécipitée des débris de cellules à l’aide d’un anticorps αNFAT2. Après purification, les fragments d’ADN associées sont détectés par PCR en temps réel quantitative (qRT-PCR). Des séquences d’ADN avec évident enrichissement représentent des régions du génome qui sont ciblées par les NFAT2 en vivo. Tonte appropriée de l’ADN et la sélection de l’anticorps requis sont particulièrement crucial pour l’application de cette méthode. Ce protocole est idéal pour la démonstration des interactions directes de NFAT2 avec des gènes cibles. Sa principale limitation est la difficulté d’employer la puce lors d’essais à grande échelle, analysant les gènes cibles de plusieurs facteurs de transcription dans les organismes intacts.

La figure 1 montre une analyse en cytométrie en flux exemplaire d’un patient CLL effectué après le marquage avec des anticorps CD19-FITC et CD5-PE. Figure 1 a montre le blocage des lymphocytes, représentant la majorité des cellules dans le sang des patients atteints de LLC. Figure 1 b montre la proportion de CD19+/CD5+ CLL cellules, qui représentent 89.03 % des lymphocyt...

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A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

Leucémie lymphoïde chronique (LLC) est la leucémie la plus courante dans le monde occidental. Facteurs de transcription NFAT sont des régulateurs importants de développement et l’activation de nombreux types de cellules. Nous présentons ici un protocole pour l’utilisation de l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) dans les cellules humaines de CLL pour identifier les gènes de la nouvelle cible de NFAT2.

Une analyse d’immunoprécipitation de la chromatine pour identifier les gènes cibles de nouveaux NFAT2 dans la leucémie lymphoïde chronique

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

Cette méthode peut aider à fournir des informations clés dans le domaine de l’oncologie telles que l’identification des gènes cibles putatifs et des mécanismes pathogènes pour développer des interventions thérapeutiques potentielles. Le principal avantage de cette technique est que l’on peut détecter l’interaction de NFAT2 et d’autres facteurs de transcription avec des gènes cibles connus et nouveaux. En général, les personnes nouvelles à cette méthode auront du mal parce que les conditions optimales de fixation et de cisaillement sont difficiles à établir.Pour commencer à remplir un tube de 1,5 millilitre avec un millilitre de formaldéhyde de 37%. Remplissez ensuite un autre tube de 1,5 millilitre d’un millilitre de 1,25 glycine molaire dans un tube de cinq millilitres avec quatre millilitres de PBS. Ensuite, après la stimulation des cellules tourner les cellules selon le protocole de texte, et re-suspendre les cellules dans 500 microlitres de PBS et placer le tube dans une boîte remplie de glace.Ajouter 13,5 microlitres de formaldéhyde à 37% aux cellules et mélanger en pipetting de haut en bas. Puis incuber la suspension à température ambiante. Après cela, ajouter 57 microlitres de 1,25 glycine molaire pour arrêter la fixation.Et laisser la suspension couver à température ambiante pendant cinq minutes. Immédiatement après la période d’incubation placer les cellules sur la glace et centrifuger les cellules à 500 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Puis aspirer le surnatant.Ensuite, lavez les cellules deux fois avec un millilitre de PBS glacé à 200 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et retirez le supernatant. Resuspendez la pastille cellulaire en cinq millilitres de tampon de lyse un en pipetting de haut en bas. Ensuite, mettez les échantillons sur la glace et incubez-les avec des secousses pendant 10 minutes.Après cela, centrifuger les tubes à 500 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, utilisez une pipette pour enlever soigneusement le surnatant. Homogénéiser les cellules en cinq millilitres de lyse tampon deux et pipette de haut en bas pour mélanger.Puis incuber les cellules sur la glace pendant 10 minutes avec des secousses. Après la période d’incubation centrifugeuse les tubes à 500 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius, et retirer soigneusement le supernatant. Ensuite, resuspendez la pastille cellulaire dans le cisaillement tampon un avec inhibiteur de la protéase 1X.Ensuite, incuber la suspension cellulaire sur la glace pendant 10 minutes. Transférer 140 microlitres de la suspension cellulaire vers des tubes sonicateurs en prenant soin d’éviter de former des bulles d’air. Placez les tubes dans un ultrasonicateur focalisée à sept degrés Celsius et cisaillez pendant 10 à sept et 1/2 minutes.Transférer la suspension cellulaire dans des tubes de 1,5 millilitre. Centrifugez les échantillons à 15 700 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius, et recueillez le supernatant dans un nouveau tube. Tout d’abord, préparez 20 microlitres de perles enrobées de protéines A pour chaque précipitation dans un tube de 1,5 millilitre.Laissez les perles s’installer sur un support magnétique pendant une minute et retirez le surnatant. Ensuite, lavez les perles avec 40 microlitres de tampon à puce 1X pour chaque 20 microlitres de perles enrobées de protéines A en pipetting de haut en bas. Laisser les perles s’installer sur une grille magnétique pendant une minute et retirer le surnatant.Répétez ce processus de lavage trois fois de plus avant de suspendre à nouveau les perles dans leur volume d’origine de 1X chIP tampon un. Ajouter l’inhibiteur de la protéase BSA, le tampon chIP de 5 X et l’eau de qualité ChIP-seq aux perles. Ensuite, ajoutez la chromatine cisaillée.Utilisez 10 microgrammes d’anticorps anti-NFAT2 pour capturer NFAT2, et 2,5 microgrammes d’anticorps IgG comme un contrôle. Incuber les mélanges pendant la nuit à quatre degrés Celsius sur une roue tournant à six vitesses. Le lendemain, faites tourner les tubes pendant cinq secondes à 7000 fois G et incubez-les sur le rack magnétique pendant une minute.Ensuite, aspirez le surnatant et lavez les perles une fois avec des tampons de lavage un, deux, trois et quatre consécutifs. Faites tourner les tubes pendant cinq secondes à 7000 fois G avant d’incuber les tubes sur la grille magnétique pendant une minute. Après cela, retirez le supernatant et ajoutez le tampon de lavage suivant.Après le dernier lavage, faire tourner les tubes pendant cinq secondes à 7000 fois G.Incuber les tubes sur la grille magnétique pendant une minute. Retirer le supernatant et prendre les perles dans 100 microlitres de tampon d’élitution un. Puis incuber les tubes sur la roue rotative pendant 30 minutes.Ensuite, tournez brièvement les tubes et placez-les sur un support magnétique pendant une minute. Transférer le supernatant dans un nouveau tube de 1,5 millilitre et ajouter quatre microlitres de tampon d’élitution deux. Pour créer le mélange de contrôle des entrées, un microlitre de la chromatine cisaillée avec 99 microlitres de tampon d’élitution un et quatre microlitres de tampon d’élitution deux.Puis incuber les échantillons pendant quatre heures à 65 degrés Celsius avec des secousses. Après cela, ajouter 100 microlitres de 100% isopropanol aux tubes. Vortex et faire tourner les échantillons pendant cinq secondes à 7000 fois G.Puis ajouter 10 microlitres de perles magnétiques à chaque échantillon.Vortex et incuber les échantillons sur une roue rotative à température ambiante pendant une heure. Ensuite, tournez brièvement les tubes et placez-les sur un support magnétique pendant une minute. Aspirez le supernatant et réutilisez les perles dans 100 microlitres de tampon de lavage.Inverser les tubes pour les mélanger et les incuber pendant cinq minutes sur une roue rotative à température ambiante. Ensuite, centrifuger brièvement les tubes. Placez-les dans un support magnétique pendant une minute, et utilisez une pipette pour enlever le surnatant.Ajouter ensuite 100 microlitres de tampon de lavage deux. Inverser les tubes pour les mélanger et les incuber pendant cinq minutes sur une roue rotative à température ambiante. Après cela, centrifugez brièvement les tubes et placez-les dans un support magnétique pendant une minute.Retirez le tampon de lavage deux par aspiration et resuspendez les perles dans 55 microlitres de tampon d’élitution. Pour élucider l’ADN précipité, incuber les échantillons dans une roue rotative à température ambiante pendant 15 minutes. Après cela, tournez brièvement les tubes et placez-les dans un rack magnétique pendant une minute.Enfin, transférez le supernatant dans de nouveaux tubes de 1,5 millilitre. Ce protocole a d’abord été exécuté avec des cellules de Jurkat analysant LCK comme cible potentielle de NFAT2. Comme indiqué ici, les résultats optimaux ont été documentés par l’enrichissement significatif du contrôle positif d’IL-2 et de l’ADN de LCK.Le cisaillement sous-optimal ou la fixation manquante peuvent mener à l’ADN de mauvaise qualité. Enfin, ce protocole a été exécuté avec les cellules humaines primaires de CLL avec CD40L servant de contrôle positif et LCK comme cible expérimentale. Comme en témoigne le fort enrichissement de l’ADN de LCK, le LCK est une cible directe de NFAT2 dans les cellules humaines primaires de CLL.Un cisaillement inadéquat entraînant une mauvaise qualité de l’ADN peut rapporter des résultats sous-optimaux. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler que les étapes de fixation et de sonication sont cruciales pour le succès de cette méthode et pourraient devoir être ajustées aux cellules analysées.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Utilisant la génomique fonctionnelle de dépistage pour identifier les cibles de médicaments potentiellement nouveaux dans Cancer Cell Cultures Spheroid

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Recherche

Recherche en cancérologie

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Protocole complet d’échantillon et de la moelle osseuse processus pour mesurer la maladie résiduelle mesurable et des cellules souches leucémiques dans la leucémie myéloïde aiguë

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

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Cytométrie en flux pour estimer la leucémie des cellules souches dans la leucémie myéloïde aiguë primaire et Patient-dérivés-xénogreffes, diagnostic et suivre vers le haut

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

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Nuclear export of macromolecules is often deregulated in cancer cells. Tumor suppressor proteins, such as p53, can be rendered inactive due to aberrant ...

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

Analyse de la distribution des tumeurs et des tissus de l’anticorps thérapeutique spécifique à l’antigène cible

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...