Name: a chromatin immunoprecipitation assay to identify novel nfat2 target genes in chronic lymphocytic leukemia
Uploaded: 2018-12-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von der DFG unterstützt MU 3340/1-1 und der Deutschen Krebshilfe gewähren 111134 (beide an M.R.M. vergeben) zu gewähren. Wir danken Elke Malenke für hervorragende technische Unterstützung).

Alle Experimente mit menschlichem Material wurden von der Ethikkommission der Universität Tübingen genehmigt und schriftliche Einwilligung wurde von allen Patienten, die Proben zu dieser Studie beigetragen haben.
1. Isolierung und Stimulation der Jurkat-Zellen
Hinweis: Um das Protokoll zu optimieren, verwenden Sie die Jurkat-Zell-Linie bekannt ist, das hohe Niveau der NFAT2 zum Ausdruck bringen. Alle Schritte werden unter einem Laminar-Flow-Haube ausgeführt.
<o...

Die entscheidenden Schritte zur Durchführung einer erfolgreichen ChIP Tests sind die Auswahl eines geeigneten Antikörpers und die Optimierung des Chromatins Scheren Prozess25. Die Auswahl der αNFAT2 Antikörper erwies sich als besondere Herausforderung bei der Entwicklung dieses Protokolls. Zwar gibt es mehrere αNFAT2 Antikörper im Handel erhältlich und der Großteil dieser funktioniert gut für das westliche Beflecken und andere Anwendungen, war Klon 7A6 der einzige Antikörper, welcher fü...

Chronischer lymphatischer Leukämie (CLL) ist die häufigste Leukämie bei Erwachsenen in den westlichen Ländern, präsentiert unterschiedliche Ansammlung von CD19, CD23 und CD51Zellen Reifen B zum Ausdruck zu bringen. Die meisten Patienten zeigen eine träge Krankheitsverlauf, die keine spezifische Behandlung für viele Jahre erforderlich macht. Im Gegensatz dazu zeigen einige Patienten schnelle Progression erfordern sofortige therapeutische Interventionen mit Immun-Chemotherapie oder andere gezielte Therapien2,3. Nuklearer Faktor der aktivierten T-Zellen (NFAT) ist eine Familie von Transkriptionsfaktoren, die Kontrolle der verschiedenen Entwicklungs- und Aktivierung Prozesse in vielen Zelle Arten4,5,6. Wir bewiesen kürzlich Überexpression und konstitutionelle Aktivierung des NFAT2 in CLL-Zellen von Patienten mit indolenten Krankheit7. Es regelt hier einen nicht interaktiver Status B-Zell-Rezeptor Stimulation Anergie7genannt. Um zu zeigen, dass NFAT2 an den Lymphozyten-spezifische Protein Tyrosin-Kinase (LCK) Veranstalter bindet und LCK Ausdruck in menschlichen CLL-Zellen, eine spezifische Chromatin Immunopräzipitation Assay regelt (ChIP) entwickelt und eingesetzt.
ChIP ist einer der mehrere Techniken, um die Rolle der Transkriptionsfaktoren in gen Ausdruck8zu untersuchen. Genexpression wird fest auf sehr komplexe Weise durch mehrere Regler mit Transkriptionsfaktoren, die unter eine unersetzliche Rolle in diesem Prozess9,10,11,12inszeniert. Transkriptionsfaktoren, die Regulierung der Genexpression in einem räumlichen und zeitlichen Kontext sind in zahlreichen Arten (z. B. für die Entwicklung und Differenzierung)13,14,15identifiziert worden, 16,17,18. Fehler in der komplizierten Kontrollmechanismen mit Transkriptionsfaktoren führen zu einer Vielzahl von pathologischen Prozessen einschließlich Krebs19,20. Identifizierung von Transkriptionsfaktoren und ihre jeweiligen Ziele könnte daher neue therapeutische Wege21,22bieten. Um dieses faszinierende Gebiet zu untersuchen sind mehrere Methoden verfügbar wie ChIP, elektrophoretische Mobilität Verschiebung Assay (EMSA), verschiedene DNA-Pulldown-Assays und Reporter-Assays8,11,12, 23 , 24.
Um zu zeigen, dass ein bestimmte Transkriptionsfaktor mit bestimmten Regionen des Genoms Interaktion ist in vivo ChIP eine ideale Technik25. Zu diesem Zweck sind DNA und damit verbundenen Proteine in lebenden Zellen vernetzt mit UV-Bestrahlung oder Formaldehyd (vernetzte ChIP, XChIP). Dieser Schritt entfällt, bessere DNA- und Protein-Erholung in der so genannten native ChIP (NChIP)26zu erhalten. Die DNA-Protein-komplexe werden anschließend durch Ultraschallbehandlung in Fragmente von ca. 200-500 Basenpaaren (bp) und Immunoprecipitated aus der Zellenrückstand mit einem spezifischen Antikörper gegen den Transkriptionsfaktor von Interesse geschoren. Die damit verbundenen DNA-Fragmente werden dann gereinigt und zeichnet sich durch PCR, molekulare Klonierung und Sequenzierung. Alternative Techniken mittels die Immunoprecipitated DNA analysieren Microarrays (ChIP-on-Chip) oder der Next Generation Sequencing (ChIP-Seq).
ChIP wurde erstmals von Gilmour und Lis 1984 wenn sie UV benutzt Licht auf kovalent Querverbindung DNA und Proteine in lebenden gebunden Bakterien27. Nach lyse der Zelle und Immunopräzipitation der bakteriellen RNA-Polymerase wurden spezifische Sonden bekannten Gene verwendet, um die in-Vivo -Verteilung und Dichte der RNA-Polymerase zuzuordnen. Die Methode wurde anschließend durch die gleichen Untersucher verwendet, um die Verteilung der eukaryotischen RNA-Polymerase II auf Hitze Schock Protein Gene in Drosophila28zu analysieren. XChIP-Assay wurde weiter verfeinert, Varshavsky und Kollegen, die Formaldehyd Vernetzung um die Vereinigung von Histon H4 mit Heat Shock Protein Gene29,30studieren zum ersten Mal verwendet. Der NChIP Ansatz, welcher den Vorteil einer besseren DNA- und Protein Erholung wegen natürlich intakt Epitope trägt und daher größere Antikörperbesonderheit wurde erstmals von Hebbes und Kollegen in 198831beschrieben.
Der Vorteil des Chips im Vergleich zu anderen Techniken, um DNA-Protein Interaktionen zu analysieren ist in der Tat, dass die tatsächliche Interaktion einen Transkriptionsfaktor untersuchten in Vivo und keine Sonden oder künstliche Bedingungen erstellt von Puffer oder Gele sind 8,11,12eingesetzt. Durch die Kombination von ChIP mit Next Generation Sequencing, können mehrere Ziele gleichzeitig identifiziert werden.
Wesentliche Einschränkungen dieser Technik sind seine begrenzte Anwendbarkeit auf groß angelegte Assays in intakter Organismen25. Die Analyse der differentiellen gen Expressionsmuster kann auch anspruchsvolle Techniken ChIP, wenn die jeweiligen Proteine nur in geringen Mengen oder bei engen Zeitfenstern ausgedrückt werden. Ein weiterer potentiell limitierende Faktor ist die Verfügbarkeit eines geeigneten Antikörpers für ChIP11geeignet.
Die hier vorgestellten ChIP-Protokoll kann für die in Vivo -Identifizierung der Zielgene von Transkriptionsfaktor durch quantitative Echtzeit-PCR (qRT-PCR) eingesetzt werden. Insbesondere war das Ziel, neuartige Zielgene von NFAT2 in CLL zu identifizieren. ChIP wurde wegen seines Potentials, die Bindung von NFAT2 an den Projektträger Regionen unterschiedliche Zielgene unter natürlichen Bedingungen in den menschlichen Patienten CLL-Zellen direkt unter Beweis stellen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 X PBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube shaker Themomixer comfort</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5355 000.011</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Bolt Sample Reducing Agent</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X Bolt MES SDS Running Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 % Formaldehyde p.a., ACS</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4979.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4X Bolt LDS Sample Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NFAT2 antibody</td>
			<td>Alexis</td>
			<td>1008505</td>
			<td>Clone 7A6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NFAT2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>8032S</td>
			<td>Clone D15F1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NFAT2 antibody ChIP Grade</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab2796</td>
			<td>Clone 7A6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>big Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804R</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19-FITC mouse Anti-human</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555412</td>
			<td>Clone &#160;HIB19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD5-PE mouse Anti-human CD5&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555353</td>
			<td>Clone &#160;UCHT2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient medium Biocoll&#160; (Density 1,077 g/ml)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>L 6115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tube 1.5 mL</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS superior</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S0615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSCalibur</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>78440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Gel Transfer Device</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IB21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Transfer Stacks, nitrocellulose, regular size</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IB23001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iDeal ChIp-seq kit for Histones</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin calcium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I3909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 680LT Donkey anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5 mg</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>926-68023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Goat anti-Mouse IgG (H + L), 0.1 mg</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>925-32210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LI-COR Odyssey Infrared Imaging System</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>B446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729692001</td>
			<td>Can be substituted with other plates in different real-time PCR instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Solution&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; OptiLyse B</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>IM1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M220 AFA-grade water</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M220 Focused-ultrasonicator</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>500295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic rack, DynaMag-15 Magnet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12301D</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Axiovert 25</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>451200</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer improved counting chamber</td>
			<td>Karl Hecht GmbH &#38;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Co KG</td>
			<td>40442012</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4 Heparin Monovette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>02.1064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey&#174; Blocking Buffer (TBS) 500 mL</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>927-50000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 100X</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A2213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerfeCTa SYBR Green FastMix</td>
			<td>Quanta Bio</td>
			<td>95072-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer CD40L promotor region forward</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-ACTCGGTGTTAGCCAGG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer CD40L promotor region reverse</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer IL-2 promotor region forward</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer IL-2 promotor region reverse</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer LCK promotor region forward</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer LCK promotor region reverse</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit mAb IgG XP Isotype Control</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td># 3900S</td>
			<td>Clone DA1E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time PCR instrument</td>
			<td>Roche</td>
			<td>LightCycler 480</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller mixers</td>
			<td>Phoenix Instrument</td>
			<td>RS-TR 5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>61870010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety-Multifly-needle 21G</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>851638235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>LC5925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker Duomax 1030</td>
			<td>Heidolph Instruments</td>
			<td>543-32205-00</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Heraeus Fresco 17</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#223;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Buffered Saline (TBS-10X)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#12498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>93595-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a chromatin immunoprecipitation assay to identify novel nfat2 target genes in chronic lymphocytic leukemia

Chronische lymphatischer Leukämie (CLL) zeichnet sich durch den Ausbau des malignen B-Zell-Klone und stellt die häufigste Leukämie in den westlichen Ländern. Die Mehrheit der CLL-Patienten zeigen eine indolenten Verlauf der Krankheit sowie eines Hauttestes Phänotyp ihrer Leukämie-Zellen unter Bezugnahme auf einen B-Zell-Rezeptor reagiert nicht auf externe Stimulation. Wir haben vor kurzem gezeigt, dass der Transkriptionsfaktor NFAT2 ein entscheidender Regulator der Anergie im CLL. Eine große Herausforderung in der Analyse der Rolle des Transkriptionsfaktors bei verschiedenen Krankheiten ist die Identifikation ihrer spezifischen Zielgene. Dies ist von großer Bedeutung für die Aufklärung der pathogenetische Mechanismen und mögliche therapeutische Interventionen. Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) ist eine klassische Technik um Protein-DNA-Wechselwirkungen zu demonstrieren und kann daher verwendet werden, um direkte Zielgene von Transkriptionsfaktoren in Säugetierzellen zu identifizieren. Hier wurde ChIP zur LCK als ein direktes Zielgen des NFAT2 in den menschlichen CLL-Zellen zu identifizieren. DNA und damit verbundenen Proteine sind vernetzt mit Formaldehyd und anschließend durch Ultraschallbehandlung in DNA-Fragmente von ca. 200-500 Basenpaaren (bp) geschoren. Vernetzte DNA-Fragmente, die mit NFAT2 verbunden sind dann selektiv Immunoprecipitated aus Zellenrückstand mit einem αNFAT2 Antikörper. Nach der Reinigung sind damit verbundenen DNA-Fragmente über quantitative Echtzeit-PCR (qRT-PCR) erkannt. DNA-Sequenzen mit offensichtlich Bereicherung darstellen Regionen des Genoms, die NFAT2 in Vivoausgerichtet sind. Geeigneten Scheren der DNA und die Auswahl der benötigten Antikörper sind besonders wichtig für die erfolgreiche Anwendung dieser Methode. Dieses Protokoll eignet sich für die Demonstration der direkten Wechselwirkung von NFAT2 mit Zielgene. Seine große Einschränkung ist die Schwierigkeit, ChIP in umfangreichen Tests, die Analyse der Zielgene von mehreren Transkriptionsfaktoren in intakter Organismen zu beschäftigen.

Abbildung 1 zeigt eine vorbildlich Flow-Zytometrie-Analyse eines CLL-Patienten nach der Färbung mit CD19-FITC und CD5-PE Antikörper durchgeführt. Abbildung 1a zeigt die Anspritzung von Lymphozyten, vertritt die Mehrheit der Zellen im Blut von Patienten mit CLL. Abbildung 1 b zeigt den Anteil der CD19+/CD5+ CLL-Zellen, die 89.03 % der Lymphozyten in diesem Beispiel darstellen....

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A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

Chronische lymphatischer Leukämie (CLL) ist die häufigste Leukämie in der westlichen Welt. NFAT Transkriptionsfaktoren sind wichtige Regulatoren von Entwicklung und Aktivierung in zahlreichen Zelltypen. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Verwendung von Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) in menschlichen CLL-Zellen, neuartige Zielgene des NFAT2 zu identifizieren.

Ein Chromatin Immunopräzipitation Assay, neuartige NFAT2 Zielgene in chronischer lymphatischer Leukämie zu identifizieren

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Informationen auf dem Gebiet der Onkologie bereitzustellen, wie die Identifizierung von vermeintlichen Zielgenen und pathogenen Mechanismen, um potenzielle therapeutische Interventionen zu entwickeln. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass man die Wechselwirkung von NFAT2 und anderen Transkriptionsfaktoren mit bekannten und neuartigen Zielgenen erkennen kann. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, weil optimale Fixierungs- und Scherbedingungen schwer zu etablieren sind.Zu beginnen, füllen Sie eine 1,5-Milliliter-Röhre mit einem Milliliter 37%Formaldehyd. Dann füllen Sie eine weitere 1,5-Milliliter-Röhre mit einem Milliliter 1,25 Molarenglycin in einem Fünf-Milliliter-Rohr mit vier Milliliter PBS. Nach der Stimulation der Zellen drehen die Zellen nach dem Textprotokoll, und setzen die Zellen in 500 Mikroliter PBS wieder auf und legen die Röhre in eine eisgefüllte Box.13,5 Mikroliter 37%Formaldehyd zu den Zellen geben und durch Pipettieren nach oben und unten mischen. Dann die Suspension bei Raumtemperatur inkubieren. Danach 57 Mikroliter 1,25 Molarglycin hinzufügen, um die Fixierung zu stoppen.Und lassen Sie die Suspension bei Raumtemperatur für fünf Minuten inkubieren. Unmittelbar nach der Inkubationszeit die Zellen auf Eis legen und die Zellen bei 500 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius zentrieren. Dann den Überstand ansaugen.Als nächstes waschen Sie die Zellen zweimal mit einem Milliliter eiskaltem PBS bei 200 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius und entfernen Sie den Überstand. Setzen Sie das Zellpellet in fünf Milliliter Lyse puffern sie durch Pipettieren nach oben und unten. Dann legen Sie die Proben auf Eis und bebrüten sie mit Schütteln für 10 Minuten.Danach zentrieren Sie die Rohre bei 500 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Verwenden Sie dann eine Pipette, um den Überstand vorsichtig zu entfernen. Homogenisieren Sie die Zellen in fünf Milliliter Lyse Puffer zwei und Pipette nach oben und unten zu mischen.Dann inkubieren Sie die Zellen auf Eis für 10 Minuten mit Schütteln. Zentrifugieren Sie die Rohre nach der Inkubationszeit fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 500 mal G, und entfernen Sie vorsichtig den Überstand. Als nächstes setzen Sie das Zellpellet in Scherpuffer eins mit 1X Protease-Hemmer wieder auf.Dann die Zellsuspension auf Eis für 10 Minuten inkubieren. Übertragen Sie 140 Mikroliter der Zellsuspension auf Beschallungsrohre, die darauf achten, luftblasen zu vermeiden. Die Rohre bei sieben Grad Celsius in einen fokussierten Ultraschallgerät geben und 10 bis sieben und eineinhalb Minuten scheren.Übertragen Sie die Zellsuspension in 1,5-Milliliter-Röhren. Zentrifugieren Sie die Proben bei 15, 700 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius, und sammeln Sie den Überstand in einem neuen Rohr. Bereiten Sie zunächst 20 Mikroliter Protein A-beschichtete Perlen für jeden Niederschlag in einem 1,5-Milliliter-Rohr vor.Lassen Sie die Perlen für eine Minute auf einem magnetischen Rack absetzen und entfernen Sie den Überstand. Dann waschen Sie die Perlen mit 40 Mikroliter 1X Chip Puffer eins für jeden 20 Mikroliter Protein A-beschichtete Perlen durch Pipettieren nach oben und unten. Lassen Sie die Perlen für eine Minute auf einem magnetischen Rack absetzen und entfernen Sie den Überstand.Wiederholen Sie diesen Waschvorgang noch dreimal, bevor Sie die Perlen in ihrem ursprünglichen Volumen von 1X chIP-Puffer eins wieder aufhängen. Fügen Sie BSA-Protease-Inhibitor, 5X chIP-Puffer und ChIP-seq-Wasser zu den Perlen hinzu. Als nächstes fügen Sie das geergelten Chromatin hinzu.Verwenden Sie 10 Mikrogramm Anti-NFAT2-Antikörper, um NFAT2 zu erfassen, und 2,5 Mikrogramm IgG-Antikörper als Kontrolle. Inkubieren Sie die Mischungen über Nacht bei vier Grad Celsius auf einem Rad, das sich bei sechs Umdrehungen pro Minute dreht. Am nächsten Tag drehen Sie die Rohre für fünf Sekunden bei 7.000 Mal G und inkubieren sie auf dem magnetischen Rack für eine Minute.Dann den Überstand ansaugen und die Perlen einmal mit den Waschpuffern eins, zwei, drei und vier hintereinander waschen. Drehen Sie die Rohre für fünf Sekunden bei 7000 mal G, bevor Sie die Rohre auf dem magnetischen Rack für eine Minute inkubieren. Entfernen Sie danach den Überstand und fügen Sie den nächsten Waschpuffer hinzu.Nach der letzten Wäsche, drehen Sie die Rohre für fünf Sekunden bei 7000 mal G.Inkubieren Sie die Rohre auf dem magnetischen Rack für eine Minute. Entfernen Sie den Überstand und nehmen Sie die Perlen in 100 Mikroliter Elutionspuffer ein. Dann die Rohre auf dem rotierenden Rad für 30 Minuten inkubieren.Als nächstes drehen Sie die Rohre kurz und legen Sie sie für eine Minute auf ein magnetisches Rack. Übertragen Sie den Überstand auf ein neues 1,5-Milliliter-Rohr und fügen Sie vier Mikroliter Elutionspuffer zwei hinzu. Um die Eingangssteuerung zu erzeugen, mischen Sie einen Mikroliter des erhabenen Chromatins mit 99 MikroliterN Elutionspuffer ein und vier Mikroliter Elutionspuffer zwei.Dann die Proben für vier Stunden bei 65 Grad Celsius mit Schütteln bebrüten. Danach 100 Mikroliter 100%Isopropanol in die Röhrchen geben. Wirbel und drehen Sie die Proben für fünf Sekunden bei 7000 mal G.Dann fügen Sie 10 Mikroliter Magnetperlen zu jeder Probe.Wirbel und inkubieren Sie die Proben auf einem rotierenden Rad bei Raumtemperatur für eine Stunde. Als nächstes drehen Sie die Rohre kurz und legen Sie sie für eine Minute auf ein magnetisches Rack. Den Überstand ansaugen und die Perlen in 100 Mikroliter Waschpuffer eins wieder aufhängen.Invertieren Sie die Rohre, um sie fünf Minuten lang auf einem rotierenden Rad bei Raumtemperatur zu mischen und zu inkubieren. Als nächstes zentrieren Sie die Rohre kurz. Legen Sie sie für eine Minute in ein magnetisches Rack und verwenden Sie eine Pipette, um den Überstand zu entfernen.Dann 100 Mikroliter Waschpuffer zwei hinzufügen. Invertieren Sie die Rohre, um sie fünf Minuten lang auf einem rotierenden Rad bei Raumtemperatur zu mischen und zu inkubieren. Danach die Rohre kurz zentrifugieren und eine Minute lang in ein Magnetgestell legen.Entfernen Sie den Waschpuffer zwei über Aspiration und setzen Sie die Perlen in 55 Mikroliter Elutionspuffer wieder auf. Um die gefällte DNA zu entblühen, inkubieren die Proben in einem rotierenden Rad bei Raumtemperatur für 15 Minuten. Danach drehen Sie die Rohre kurz und legen Sie sie für eine Minute in ein magnetisches Rack.Schließlich übertragen Sie den Überstand auf neue 1,5-Milliliter-Röhren. Dieses Protokoll wurde zuerst mit Jurkat-Zellen durchgeführt, die LCK als potenzielles NFAT2-Ziel analysieren. Wie hier gezeigt, wurden optimale Ergebnisse durch signifikante Anreicherung der IL-2-Positivkontrolle und LCK-DNA dokumentiert.SuboptimaleScherung oder fehlende Fixierung kann zu schlechter DNA-Qualität führen. Schließlich wurde dieses Protokoll mit primären menschlichen CLL-Zellen mit CD40L als Positivkontrolle und LCK als experimentelles Ziel durchgeführt. Wie die starke Anreicherung der LCK-DNA zeigt, ist LCK ein direktes NFAT2-Ziel in primären menschlichen CLL-Zellen.Unzureichendes Scheren, was zu schlechter DNA-Qualität führt, kann suboptimale Ergebnisse liefern. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Fixations- und Beschallungsschritte entscheidend für den Erfolg dieser Methode sind und möglicherweise an die analysierten Zellen angepasst werden müssen.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Functional Genomics Screening Verwendung zur Identifizierung möglicher neuer Wirkstoff-Targets in Cancer Cell Sphäroid-Kulturen

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Forschung

Krebsforschung

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Umfassendes Protokoll zur Probe und Prozess des Knochenmarks zur Messung von messbaren Resterkrankung und leukämischen Stammzellen in der akuten myeloischen Leukämie

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Flow Cytometry um Leukämie-Stammzellen in primäre akute myeloische Leukämie und Patienten-abgeleitet-Xenotransplantate bei Diagnose und folgen bis zu schätzen

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Native Chromatin Immunoprecipitation Using Murine Brain Tumor Neurospheres

Native Chromatin Immunopräzipitation mit Murine Gehirn Tumor Neurosphären

Epigenetic modifications may be involved in the development and progression of glioma. Changes in methylation and acetylation of promoters and regulatory ...

Immunoglobulin Gene Sequence Analysis In Chronic Lymphocytic Leukemia: From Patient Material To Sequence Interpretation

Immunglobulin-gen-Sequenzanalyse In chronischer lymphatischer Leukämie: Aus Patientenmaterial Sequenz Interpretation

During B cell maturation, the complex process of immunoglobulin (IG) gene V(D)J recombination coupled with somatic hypermutation (SHM) gives rise to a ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

Bewertung des metabolischen Profils der primäre Leukämie-Zellen

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

In Vitro-Assay zur Untersuchung der Tumor-Makrophage-Interaktion

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

A Data Integration Workflow to Identify Drug Combinations Targeting Synthetic Lethal Interactions

Ein Datenintegrations-Workflow zur Identifizierung von Arzneimittelkombinationen, die auf synthetische tödliche Wechselwirkungen abzielen

A synthetic lethal interaction between two genes is given when knock-out of either one of the two genes does not affect cell viability but knock-out of ...

Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking

Subzelluläre Fraktionierung der primären chronischen lymphatischen Leukämiezellen zur Überwachung des nuklearen/zytoplasmatischen Proteinhandels

Nuclear export of macromolecules is often deregulated in cancer cells. Tumor suppressor proteins, such as p53, can be rendered inactive due to aberrant ...

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

Analyse der Tumor- und Gewebeverteilung von Zielantigen-spezifischen therapeutischen Antikörpern

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...