Name: a chromatin immunoprecipitation assay to identify novel nfat2 target genes in chronic lymphocytic leukemia
Uploaded: 2018-12-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי DFG הענק מו 3340/1-1 ו- Krebshilfe דויטשה את הענק 111134 (שניהם הוענק M.R.M.). אנו מודים אלקה Malenke לסיוע טכני מעולה).

כל הניסויים שנערכו עם חומר אנושי אושרו על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת טיבינגן, ממנו כל המטופלים אשר תרמו דגימות מחקר זה הושג בכתב הסכמה מדעת.
1. בידוד ותאי גירוי של Jurkat
הערה: כדי למטב את הפרוטוקול, השתמש בשורת תא Jurkat אשר ידוע לבטא רמות גבוהות של NFAT2. כל הצעדים מב...

השלבים הקריטיים של ביצוע וזמינותו שבב מוצלחת של הבחירה של נוגדן המתאים הינם אופטימיזציה של כרומטין הטיית תהליך25. הבחירה של הנוגדן αNFAT2 הוכיחה להיות מאתגרת במיוחד במהלך הפיתוח של פרוטוקול זה. אמנם ישנם מספר נוגדנים αNFAT2 זמינים מסחרית, רוב העבודות האלה בסדר גמור עבור סופג המערב...

לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL) מייצג הלוקמיה הנפוץ ביותר אצל מבוגרים במדינות המערב, מפגין ברורים הצטברות CD19 CD23, CD5 לבטא בוגרת B תאים1. רוב המטופלים התערוכה קורס מחלת indolent, אשר לא מחייבים טיפול מיוחד במשך שנים רבות. לעומת זאת, חלק מהחולים מראים התקדמות מהירה המחייבים התערבויות טיפוליות מיידית עם החיסון-כימותרפיה או טיפולים ממוקדים אחרים,2,3. גרעיני גורם של תאי T מופעל (NFAT) היא משפחה של גורמי שעתוק השליטה התפתחותיים שונים ותהליכים הפעלה5,4,סוגי תאים רבים6. אנחנו לאחרונה הפגינו ביטוי והפעלה החוקתי של NFAT2 בתאי CLL מחולים עם מחלת indolent7. . כאן, זה מסדיר מצב לא להגיב כדי גירוי קולטן תא B נקרא anergy7. כדי להדגים NFAT2 נקשר חלבון ספציפי לימפוציט טירוזין קינאז (מזל) האמרגן ומסדיר LCK ביטוי בתאי CLL אדם, וזמינותו immunoprecipitation כרומטין ספציפי (ChIP) פיתח, המועסקים.
השבב הוא אחד מספר טכניקות כדי לחקור את התפקיד של גורמי שעתוק גנים ביטוי8. ביטוי גנים הוא הדוק בניצוחו בצורה מאוד מורכב הרגולטורים מספר עם גורמי שעתוק לוקח תפקיד מיוחד במינו זה תהליך9,10,11,12. זוהו גורמי שעתוק ויסות בביטוי הגן בהקשר יכולות רבות מינים (למשל, עבור פיתוח ובידול)13,14,15, 16,17,18. שגיאות במנגנוני הבקרה מורכבים המערבים גורמי שעתוק יכול להוביל מגוון תהליכים פיפטות כולל סרטן19,20. לפיכך, זיהוי גורמי שעתוק, המטרות המתאימות שלהם עשויים להציע הרומן השדרות טיפולית21,22. כדי לחקור את שדה מסקרן זה מספר שיטות זמינים כמו שבב, ניידות electrophoretic assay shift (EMSA), מבחני נפתחים דנ א שונים כתב-מבחני8,11,12, 23 , 24.
כדי להדגים כי גורם שעתוק מסוימים אינטראקציה עם אזורים ספציפיים בגנום ויוו, השבב הוא טכניקה אידיאלית25. למטרה זו, ה-DNA, חלבונים הקשורים בתאים חיים הם קישורים צולבים באמצעות הקרנת UV או פורמלין (שבב צולבים, XChIP). שלב זה מושמט להשיג DNA יותר ושחזור חלבון כביכול יליד שבב (NChIP)26. מתחמי ה-DNA-חלבון מוטים לאחר מכן על ידי sonication לחלקים של 200-500 בסיסים (bp) immunoprecipitated תא הלבלב באמצעות של נוגדנים ספציפיים נגד גורם שעתוק עניין. שברי DNA המשויך מכן מטוהרים, המאופיינת PCR שיבוט מולקולרי, רצף. טכניקות חלופיות להשתמש מיקרו-מערכים (שבב על שבב) או רצף הדור הבא (צ'יפ-Seq) כדי לנתח את immunoprecipitated ה-DNA.
שבב הוצג לראשונה על ידי גילמור, ליס ב-1984 כאשר הם בשימוש UV אור כדי covalently קישור DNA וכרוך בכריכת חלבונים חיים חיידקים27. בעת פירוק התא, immunoprecipitation של חיידקי RNA פולימראז, הגששים ספציפי של גנים ידועים שימשו כדי למפות את התפלגות ויוו ואת צפיפות של RNA פולימראז. השיטה שימש לאחר מכן על ידי החוקרים אותו כדי לנתח את חלוקת האיקריוטים RNA פולימראז II על חום הלם חלבון גנים דרוזופילה28. וזמינותו XChIP היה מעודן יותר מאת ורשבסקי ועמיתים הנפוץ פורמלדהיד cross-linking ללמוד השיוך של היסטון H4 חום הלם חלבון גנים29,30. הגישה NChIP, אשר נושאת את היתרון של החלמה טובה יותר DNA וחלבון עקב epitopes באופן טבעי ללא פגע, לכן, להגדיר נוגדן, תוארה לראשונה על ידי Hebbes ועמיתיו בשנת 198831.
היתרון של שבב לעומת טכניקות אחרות לניתוח אינטראקציות חלבון-דנ א היא, למעשה, האינטראקציה בפועל של פקטור שעתוק ניתן ובדוקים ויוו טראקיס או מלאכותי שנוצר על-ידי אנשים רגילים או ג'לים התנאים מועסק8,11,12. על ידי שילוב שבב עם הדור הבא רצפי, מטרות מרובות ניתן לזהות בו זמנית.
מגבלות הגדולות של טכניקה זו הם שלה תחולה מוגבלת כדי מבחני בקנה מידה גדול אורגניזמים שלמים25. ניתוח דפוסי ביטוי גנים דיפרנציאלי יכול להיות גם מאתגר באמצעות טכניקות צ'יפ אם החלבונים בהתאמה באים לידי ביטוי רק ברמות נמוכות או תוך זמן קצר של windows. עוד פוטנציאל מגביל הוא הזמינות של נוגדן המתאים עבור השבב11.
פרוטוקול שבב המובאת כאן יכול להיות מועסק לצורך זיהוי ויוו של היעד גנים של פקטור שעתוק מאת PCR כמותי בזמן אמת (לרביעיית-PCR). באופן ספציפי, המטרה היא לזהות היעד הרומן גנים של NFAT2 ב CLL. שבב נבחר בגלל הפוטנציאל להדגים ישירות את הכריכה של NFAT2 אל מחוזות מקדם מטרה שונים גנים בתנאים טבעיים בתאי החולה CLL אדם.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 X PBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube shaker Themomixer comfort</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5355 000.011</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Bolt Sample Reducing Agent</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X Bolt MES SDS Running Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 % Formaldehyde p.a., ACS</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4979.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4X Bolt LDS Sample Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NFAT2 antibody</td>
			<td>Alexis</td>
			<td>1008505</td>
			<td>Clone 7A6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NFAT2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>8032S</td>
			<td>Clone D15F1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NFAT2 antibody ChIP Grade</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab2796</td>
			<td>Clone 7A6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>big Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804R</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19-FITC mouse Anti-human</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555412</td>
			<td>Clone &#160;HIB19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD5-PE mouse Anti-human CD5&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555353</td>
			<td>Clone &#160;UCHT2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient medium Biocoll&#160; (Density 1,077 g/ml)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>L 6115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tube 1.5 mL</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS superior</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S0615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSCalibur</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>78440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Gel Transfer Device</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IB21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Transfer Stacks, nitrocellulose, regular size</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IB23001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iDeal ChIp-seq kit for Histones</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin calcium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I3909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 680LT Donkey anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5 mg</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>926-68023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Goat anti-Mouse IgG (H + L), 0.1 mg</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>925-32210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LI-COR Odyssey Infrared Imaging System</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>B446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729692001</td>
			<td>Can be substituted with other plates in different real-time PCR instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Solution&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; OptiLyse B</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>IM1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M220 AFA-grade water</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M220 Focused-ultrasonicator</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>500295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic rack, DynaMag-15 Magnet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12301D</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Axiovert 25</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>451200</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer improved counting chamber</td>
			<td>Karl Hecht GmbH &#38;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Co KG</td>
			<td>40442012</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4 Heparin Monovette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>02.1064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey&#174; Blocking Buffer (TBS) 500 mL</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>927-50000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 100X</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A2213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerfeCTa SYBR Green FastMix</td>
			<td>Quanta Bio</td>
			<td>95072-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer CD40L promotor region forward</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-ACTCGGTGTTAGCCAGG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer CD40L promotor region reverse</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer IL-2 promotor region forward</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer IL-2 promotor region reverse</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer LCK promotor region forward</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer LCK promotor region reverse</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit mAb IgG XP Isotype Control</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td># 3900S</td>
			<td>Clone DA1E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time PCR instrument</td>
			<td>Roche</td>
			<td>LightCycler 480</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller mixers</td>
			<td>Phoenix Instrument</td>
			<td>RS-TR 5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>61870010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety-Multifly-needle 21G</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>851638235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>LC5925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker Duomax 1030</td>
			<td>Heidolph Instruments</td>
			<td>543-32205-00</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Heraeus Fresco 17</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#223;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Buffered Saline (TBS-10X)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#12498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>93595-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a chromatin immunoprecipitation assay to identify novel nfat2 target genes in chronic lymphocytic leukemia

לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL) מאופיין על-ידי ההרחבה של תא B ממאיר שיבוטים ומייצג הלוקמיה הנפוץ במדינות המערב. רוב החולים CLL הצג מסלול indolent של המחלה, כמו גם של פנוטיפ anergic של תאים לוקמיה שלהם, בהתייחסו קולטן תא B להגיב גירויים חיצוניים. אנחנו לאחרונה הראו כי הגורם שעתוק NFAT2 מווסת מכריע של anergy ב- CLL. האתגר העיקרי בניתוח של התפקיד של פקטור שעתוק במחלות שונות הוא הזיהוי של הגנים שלו ביעד מסוים. זה משמעות רבה עבור הבהרה של מנגנונים pathogenetic והתערבויות טיפוליות אפשריות. כרומטין immunoprecipitation (ChIP) היא טכניקה קלאסית להפגין אינטראקציות חלבון-DNA ו, לכן, ניתן להשתמש לזיהוי גנים היעד הישיר של גורמי שעתוק בתאי יונקים. כאן, שבב שימש כדי לזהות LCK גן היעד הישיר של NFAT2 בתאי CLL אדם. ה-DNA, חלבונים הקשורים תפור באמצעות פורמלין, לאחר מכן לכסנתם על ידי sonication לחלקים הדנ א של 200-500 בסיסי זוגות (bp). שברי DNA צולבים המשויך NFAT2 נארזים בצורה סלקטיבית immunoprecipitated של שאריות תאים באמצעות נוגדן αNFAT2. לאחר טיהור, שברי DNA המשויך מזוהים באמצעות PCR כמותי בזמן אמת (לרביעיית-PCR). רצפי DNA עם העשרה ניכר מייצגים אזורים בגנום אשר מיועדים על-ידי NFAT2 ויוו. ההטיה המתאימה של ה-DNA, הבחירה של הנוגדן נדרש מכריעים במיוחד עבור היישום המוצלח של שיטה זו. פרוטוקול זה הינו אידיאלי עבור ההדגמה של אינטראקציות ישיר של NFAT2 עם גנים היעד. הגבלה העיקרי שלה הוא הקושי להעסיק. את השבב של מבחני בקנה מידה גדול לנתח את הגנים היעד של מספר גורמי שעתוק אורגניזמים שלמים.

איור 1 מציג ניתוח cytometry זרימה למופת של המטופל CLL לאחר צביעת עם נוגדנים CD19-FITC ו- CD5-PE. איור 1a מציג את דרך השער של לימפוציטים, המייצג את רוב תאי הדם של חולי CLL. איור 1b מציגה את הפרופורציה של CD19+/CD5+ CLL התאים, אשר מייצגים 89.0...

Watch this Scientific Journal Video about A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia at JoVE.com

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL) הוא הלוקמיה הנפוץ ביותר בעולם המערבי. גורמי שעתוק NFAT הן הרגולטורים חשוב של פיתוח והפעלה סוגי תאים רבים. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול לשימוש של כרומטין immunoprecipitation (ChIP) בתאי CLL אדם לזיהוי גנים היעד הרומן של NFAT2.

כרומטין Immunoprecipitation Assay לזיהוי NFAT2 הרומן גנים היעד בלוקמיה לימפוציטית כרונית

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

שיטה זו יכולה לסייע לספק מידע מרכזי בתחום האונקולוגיה כגון זיהוי גנים של מטרות פתוגניים ומנגנונים פתוגניים לפיתוח התערבויות טיפוליות פוטנציאליות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לזהות את האינטראקציה של NFAT2 וגורמי שעתוק אחרים עם גנים יעד ידועים ורומן. בדרך כלל אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו כי קיבעון אופטימלי ותנאי גיהה קשה לקבוע.כדי להתחיל למלא צינור 1.5 מיליליטר עם מיליליטר אחד של 37% פורמלדהיד. ואז למלא עוד צינור 1.5 מיליליטר עם מיליליטר אחד של 1.25 גליצין טוחן בצינור חמישה מיליליטר עם ארבעה מיליליטר של PBS. לאחר מכן, לאחר גירוי התאים לסובב את התאים על פי פרוטוקול הטקסט, ולהשעות מחדש את התאים ב 500 microliters של PBS ולמקם את הצינור בתיבה מלאה בקרח.הוסיפו 13.5 מיקרוליטרים של 37% פורמלדהיד לתאים וערבבו על ידי צינור למעלה ולמטה. ואז לה הדגירה ההשעיה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, להוסיף 57 microliters של 1.25 גליצין טוחן כדי לעצור את הקיבעון.ולאפשר להשעיה דגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. מיד לאחר תקופת הדגירה מניחים את התאים על קרח וצנטריפוגה התאים ב 500 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. אז שאף את העל-טבעי.לאחר מכן, לשטוף את התאים פעמיים עם מיליליטר אחד של PBS קר כקרח ב 200 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס ולהסיר את על טבעי. תן מחדש את גלולת התא בחמישה מיליליטר של חיץ תזה אחד על ידי צינור למעלה ולמטה. ואז לשים את הדגימות על קרח דגירה אותם עם רועד במשך 10 דקות.לאחר מכן, צנטריפוגה הצינורות ב 500 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן השתמש פיפטה כדי להסיר בזהירות את על טבעי. הומוגניזציה של התאים בחמישה מיליליטר של מאגר תמוגה 2 ו pipette למעלה ולמטה לערבב.ואז להחגירה את התאים על קרח במשך 10 דקות עם רעידות. לאחר תקופת הדגירה צנטריפוגה הצינורות ב 500 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס, בזהירות להסיר את העל טבעי. לאחר מכן, לחץ מחדש את גלולת התא במאגר גיזום אחד עם מעכב פרוטאז 1X.ואז להחגירה את ההשעיה התא על קרח במשך 10 דקות. להעביר 140 microliters של ההשעיה התא צינורות sonicator דואג להימנע יצירת בועות אוויר. מניחים את הצינורות באולטרסאונד ממוקד בשבע מעלות צלזיוס ומצרפים במשך 10 עד 7 ו 1/2 דקות.העבר את ההשעיה התא לתוך צינורות 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה הדגימות ב 15, 700 פעמים G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס, ולאסוף את supernatant בצינור חדש. ראשית, להכין 20 microliters של חלבון מצופה חרוזים עבור כל משקעים בצינור אחד 1.5 מיליליטר.אפשרו לחטרוזים להתיישב על מתלה מגנטי למשך דקה אחת, ולהסיר את העל-טבעי. לאחר מכן לשטוף את חרוזים עם 40 microliters של חיץ שבב 1X אחד עבור כל 20 microliters של חלבון מצופה חרוזים על ידי צינור למעלה ולמטה. אפשרו לחטרוזים להתיישב על מתלה מגנטי למשך דקה אחת ולהסיר את העל-טבעי.חזור על תהליך כביסה זה שלוש פעמים נוספות לפני השעייתם מחדש של חרוזים באמצעי האחסון המקורי שלהם של מאגר 1X chIP אחד. הוסף מעכב פרוטאז BSA, חיץ chIP 5X, ומים כיתה ChIP-seq ל חרוזים. לאחר מכן, מוסיפים את הכרומטין המוגזם.השתמש 10 מיקרוגרם של נוגדן נגד NFAT2 כדי ללכוד NFAT2, ו 2.5 מיקרוגרם של נוגדן IgG כבקרה. הדגירה את תערובות לילה בארבע מעלות צלזיוס על גלגל מסתובב בשש סל"ד. למחרת לסובב את הצינורות במשך חמש שניות ב 7, 000 פעמים G ולהדק אותם על המדף המגנטי במשך דקה אחת.ואז לשאפת את supernatant ולשטוף את חרוזים פעם אחת עם מאגרי לשטוף אחד, שתיים, שלוש, וארבע ברציפות. לסובב את הצינורות במשך חמש שניות ב 7000 פעמים G לפני דגירה הצינורות על המדף המגנטי במשך דקה אחת. לאחר מכן, הסר את העל-טבעי והוסף את מאגר הכביסה הבא.לאחר הכביסה האחרונה, לסובב את הצינורות במשך חמש שניות ב 7000 פעמים G.Incubate הצינורות על המדף המגנטי במשך דקה אחת. הסר את supernatant ולקחת את חרוזים ב 100 microliters של מאגר אלוטיון אחד. ואז לה הדגירה את הצינורות על הגלגל המסתובב במשך 30 דקות.לאחר מכן, סובבו לזמן קצר את הצינורות וה מניחים אותם על מתלה מגנטי למשך דקה אחת. מעבירים את העל-טבעי לצינור חדש של 1.5 מיליליטר ומוסיפים ארבעה מיקרוליטרים של מאגר אלוטיון 2. כדי ליצור את בקרת הקלט מערבבים מיקרוליטר אחד של הכרומטין המוטה עם 99 מיקרוליטרים של מאגר אלוטיון אחד וארבעה מיקרוליטרים של מאגר אלוטיון 2.ואז להדגר את הדגימות במשך ארבע שעות ב 65 מעלות צלזיוס עם רעידות. לאחר מכן, להוסיף 100 microliters של 100% isopropanol לצינורות. Vortex ולסובב את הדגימות במשך חמש שניות ב 7000 פעמים G.Then להוסיף 10 microliters של חרוזים מגנטיים לכל מדגם.מערבולת ולהדגור את הדגימות על גלגל מסתובב בטמפרטורת החדר במשך שעה. לאחר מכן, לסובב את הצינורות לזמן קצר ולה מניח אותם על מתלה מגנטי במשך דקה אחת. שאפו את העל-טבעי והשקיעו מחדש את חרוזיו ב-100 מיקרוליטרים של חיץ שטיפה אחד.להפוך את הצינורות לערבב ולהדרגר אותם במשך חמש דקות על גלגל מסתובב בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לזמן קצר צנטריפוגה הצינורות. מניחים אותם בארון מגנטי למשך דקה אחת, ולהשתמש פיפטה כדי להסיר את supernatant.לאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטרים של חיץ שטיפה 2. להפוך את הצינורות לערבב ולהדרגר אותם במשך חמש דקות על גלגל מסתובב בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לזמן קצר צנטריפוגה הצינורות למקם אותם במתלה מגנטי במשך דקה אחת.הסר את חיץ הכביסה 2 באמצעות שאיפה ולחץ מחדש את חרוזים ב 55 microliters של חיץ אלוטיון. כדי לשאוב את הדנ"א המזרז דגירה את הדגימות בגלגל מסתובב בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. לאחר מכן, לסובב את הצינורות בקצרה ולה למקם אותם במתלה מגנטי במשך דקה אחת.לבסוף, להעביר את supernatant לצינורות חדשים 1.5 מיליליטר. פרוטוקול זה בוצע לראשונה עם תאי Jurkat המנתחים את LCK כיעד NFAT2 פוטנציאלי. כפי שמוצג כאן, תוצאות אופטימליות תועדו על ידי העשרה משמעותית של השליטה החיובית IL-2 ו- LCK DNA.גיהום תת אופטימלי או קיבעון חסר עלול להוביל לדנ"א באיכות ירודה. לבסוף, פרוטוקול זה בוצע עם תאי CLL אנושיים ראשוניים עם CD40L המשמשים כבקרה חיובית ו- LCK כיעד ניסיוני. כפי שהוכח על ידי העשרה חזקה של ה-DNA LCK, LCK הוא יעד NFAT2 ישיר בתאי CLL אנושיים ראשוניים.גיה לא מספקת וכתוצאה מכך דנ"א באיכות ירודה יכול להחזיר תוצאות תת-אופטימליות. בעת ניסיון הליך זה חשוב לזכור כי שלבי הקיבעון וההסוניקציה חיוניים להצלחת שיטה זו וייתכן שיהיה צריך להתאים אותם לתאים המנותחים.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

ניצול הקרנת Genomics פונקציונלית כדי לזהות מטרות תרופה חדשנית פוטנציאלי תרבויות אליפטית תא סרטני

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

פרוטוקולים מקיפה לדוגמה, מח עצם תהליך למדידת מחלה שיורית מדיד, לוקמיה בתאי גזע לוקמיה מיאלואידית חריפה

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Flow Cytometry להעריך לוקמיה תאי גזע ראשי לוקמיה מיאלואידית חריפה, החולה-נגזר-xenografts, אבחון, מעקב.

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Native Chromatin Immunoprecipitation Using Murine Brain Tumor Neurospheres

כרומטין יליד Immunoprecipitation באמצעות המוח מאתר הגידול Neurospheres

Epigenetic modifications may be involved in the development and progression of glioma. Changes in methylation and acetylation of promoters and regulatory ...

Immunoglobulin Gene Sequence Analysis In Chronic Lymphocytic Leukemia: From Patient Material To Sequence Interpretation

ניתוח רצף גנטי בנוגדנים בלוקמיה לימפוציטית כרונית: מחומר החולה לפרשנות רצף

During B cell maturation, the complex process of immunoglobulin (IG) gene V(D)J recombination coupled with somatic hypermutation (SHM) gives rise to a ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

הערכה של פרופיל מטבולי של תאי סרטן ראשוני

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

בתוך שיטת חוץ גופית כדי ללמוד גידול-מקרופאג אינטראקציה

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

A Data Integration Workflow to Identify Drug Combinations Targeting Synthetic Lethal Interactions

זרימת עבודה של שילוב נתונים לזיהוי שילובי תרופות המכוונים לאינטראקציות קטלניות סינתטיות

A synthetic lethal interaction between two genes is given when knock-out of either one of the two genes does not affect cell viability but knock-out of ...

Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking

שבירה משנית של תאים לוקמיה לימפוציטית כרונית ראשונית לניטור גרעיני/Cytoplasmic סחר בחלבונים

Nuclear export of macromolecules is often deregulated in cancer cells. Tumor suppressor proteins, such as p53, can be rendered inactive due to aberrant ...

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

ניתוח גידול ורקמות התפלגות של נוגדן טיפולי ספציפי אנטיגן היעד

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...