Name: a chromatin immunoprecipitation assay to identify novel nfat2 target genes in chronic lymphocytic leukemia
Uploaded: 2018-12-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia at JoVE.com

यह काम DFG ग्रांट म्यू 3340/1-1 और ड्यूश Krebshilfe ग्रांट ११११३४ (दोनों M.R.M. को संमानित किया) द्वारा समर्थित किया गया था । उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए हम एलके Malenke को धन्यवाद देते हैं) ।

मानव सामग्री के साथ किए गए सभी प्रयोगों को यूनिवर्सिटी ऑफ Tübingen की एथिक्स कमेटी द्वारा अनुमोदित किया गया और लिखित सूचित सहमति उन सभी रोगियों से प्राप्त की गई जिन्होंने इस अध्ययन के लिए नमूनों का योगदान ?...

एक सफल चिप परख प्रदर्शन के महत्वपूर्ण कदम एक उपयुक्त एंटीबॉडी और क्रोमेटिन बाल काटना प्रक्रिया25के अनुकूलन का चयन कर रहे हैं । αNFAT2 एंटीबॉडी का चयन इस प्रोटोकॉल के विकास के दौरान विशेष रूप से चु?...

क्रोनिक लिम्फोसाईटिक ल्यूकेमिया (CLL) पश्चिमी देशों में वयस्कों में सबसे आम ल्यूकेमिया का प्रतिनिधित्व करता है, CD19, CD23 के विशिष्ट संचय का प्रदर्शन, और CD5 परिपक्व बी कोशिकाओं1व्यक्त. अधिकांश रोगियों को एक indolent रोग पाठ्यक्रम है, जो कई वर्षों के लिए विशिष्ट उपचार जरूरत नहीं है प्रदर्शन । इसके विपरीत, कुछ रोगियों तेजी से प्रतिरक्षा के साथ तत्काल चिकित्सीय हस्तक्षेप की आवश्यकता होती है प्रगति दिखाने के कीमोथेरेपी या अंय लक्षित उपचार2,3। सक्रिय टी कोशिकाओं के नाभिकीय कारक (NFAT) कई कोशिका प्रकार में विभिन्न विकासात्मक और सक्रियण प्रक्रियाओं को नियंत्रित करने वाले प्रतिलेखन कारकों में से एक परिवार है4,5,6. हम हाल ही में indolent रोग7के साथ रोगियों से CLL कोशिकाओं में NFAT2 के व्यक्त और संवैधानिक सक्रियण का प्रदर्शन किया । यहां, यह बी सेल रिसेप्टर anergy7बुलाया उत्तेजना के लिए एक अप्रतिसादी राज्य को नियंत्रित करता है । यह प्रदर्शित करने के लिए कि NFAT2 बाँध को लिम्फोसाइट-विशिष्ट प्रोटीन tyrosine कळेनासे (LCK) प्रवर्तक और मानव LCK कोशिकाओं में CLL अभिव्यक्ति को विनियमित करता है, एक विशिष्ट क्रोमेटिन immunoprecipitation परख (चिप) विकसित और कार्यरत था.
चिप कई तकनीकों में से एक है जीन अभिव्यक्ति8में प्रतिलेखन कारकों की भूमिका की जांच । जीन अभिव्यक्ति कसकर इस प्रक्रिया9,10,11,12में एक अपूरणीय भाग लेने के प्रतिलेखन कारकों के साथ कई नियामकों द्वारा एक बहुत ही जटिल तरीके से किया जाता है । प्रतिलेखन एक स्थानिक और लौकिक संदर्भ में जीन अभिव्यक्ति विनियमन कारकों कई प्रजातियों में पहचान की गई है (विकास और भेदभाव के लिएजैसे, )13,14,15, 16,17,18. प्रतिलेखन कारकों को शामिल जटिल नियंत्रण तंत्र में त्रुटियाँ कैंसर19,20सहित रोग प्रक्रियाओं की एक किस्म के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. इसलिए, प्रतिलेखन कारकों की पहचान और उनके संबंधित लक्ष्य उपंयास चिकित्सकीय रास्ते21,22की पेशकश हो सकती है । इस पेचीदा क्षेत्र की जांच करने के लिए कई तरीकों चिप की तरह उपलब्ध हैं, electrophoretic गतिशीलता पारी परख (EMSA), विभिंन डीएनए पुल नीचे परख और रिपोर्टर-परख8,11,12, 23 , 24.
प्रदर्शित करने के लिए कि एक निश्चित प्रतिलेखन कारक vivo में जीनोम के विशिष्ट क्षेत्रों के साथ सूचना का आदान प्रदान, चिप एक आदर्श तकनीक25है । इस प्रयोजन के लिए, डीएनए और जीवित कोशिकाओं में जुड़े प्रोटीन यूवी विकिरण या formaldehyde (पार से जुड़ा हुआ चिप, XChIP) का उपयोग कर पार कर रहे हैं । यह कदम तथाकथित देशी चिप (NChIP)26में बेहतर डीएनए और प्रोटीन रिकवरी प्राप्त करने के लिए छोड़ा जाता है । डीएनए-प्रोटीन परिसरों बाद sonication द्वारा लगभग 200-500 आधार जोड़े (बीपी) के टुकड़ों में कतरनी और सेल मलबे से immunoprecipitated ब्याज की प्रतिलेखन कारक के खिलाफ एक विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग कर रहे हैं । जुड़े डीएनए टुकड़े तो शुद्ध और पीसीआर, आणविक क्लोनिंग, और अनुक्रमण द्वारा विशेषता है । वैकल्पिक तकनीक का उपयोग करें microarrays (चिप पर चिप) या अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (चिप-Seq) immunoprecipitated डीएनए का विश्लेषण करने के लिए ।
चिप पहले १९८४ में Gilmour और फूल द्वारा शुरू की गई थी जब वे covalently पार से लिंक डीएनए और जीवित जीवाणु27में प्रोटीन बंधे के लिए यूवी प्रकाश का इस्तेमाल किया । कोशिका lysis और बैक्टीरियल आरएनए पोलीमरेज़ के immunoprecipitation पर, ज्ञात जीन की विशिष्ट जांच में vivo वितरण और आरएनए पोलीमरेज़ के घनत्व को मैप करने के लिए उपयोग किया गया । विधि बाद में एक ही जांचकर्ताओं द्वारा इस्तेमाल किया गया था Drosophila28में गर्मी सदमे प्रोटीन जीन पर eukaryotic आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय के वितरण का विश्लेषण । XChIP परख और Varshavsky और सहकर्मियों जो पहले formaldehyde पार इस्तेमाल से परिष्कृत किया गया गर्मी सदमे प्रोटीन के साथ हिस्टोन H4 के संघ का अध्ययन जोड़ने के29,30जीन । NChIP दृष्टिकोण है, जो एक बेहतर डीएनए और प्रोटीन की वजह से स्वाभाविक रूप से बरकरार epitopes की वसूली का लाभ वहन करती है और, इसलिए, अधिक से अधिक एंटीबॉडी विशिष्टता, पहले Hebbes और १९८८31में सहयोगियों द्वारा वर्णित किया गया था ।
अंय तकनीकों की तुलना में चिप का लाभ डीएनए का विश्लेषण करने के लिए प्रोटीन बातचीत वास्तव में है, कि एक प्रतिलेखन कारक की वास्तविक बातचीत vivo में जांच की जा सकती है और कोई जांच या कृत्रिम शर्तों buffers या जैल द्वारा बनाई गई है कार्यरत८,११,१२. अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के साथ चिप के संयोजन से, कई लक्ष्यों को एक साथ पहचाना जा सकता है ।
इस तकनीक की प्रमुख सीमाएं हैं25बरकरार जीवों में बड़े पैमाने पर परख करने के लिए सीमित प्रयोज्यता । अंतर जीन अभिव्यक्ति पैटर्न के विश्लेषण भी चिप तकनीक का उपयोग कर चुनौतीपूर्ण हो सकता है अगर संबंधित प्रोटीन केवल कम स्तर पर या संकीर्ण समय खिड़कियों के दौरान व्यक्त कर रहे हैं । एक और संभावित सीमित कारक एक उचित एंटीबॉडी की उपलब्धता है चिप11के लिए उपयुक्त ।
चिप प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (qRT-पीसीआर) द्वारा एक प्रतिलेखन कारक के लक्ष्य जीन की पहचान में vivo के लिए नियोजित किया जा सकता है । विशेष रूप से, लक्ष्य के लिए CLL में NFAT2 के उपंयास लक्ष्य जीन की पहचान थी । चिप क्योंकि अपनी क्षमता के लिए चुना गया था सीधे मानव CLL रोगी कोशिकाओं में प्राकृतिक परिस्थितियों में अलग लक्ष्य जीन के प्रवर्तक क्षेत्रों के लिए NFAT2 के बंधन का प्रदर्शन ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 X PBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube shaker Themomixer comfort</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5355 000.011</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Bolt Sample Reducing Agent</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X Bolt MES SDS Running Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 % Formaldehyde p.a., ACS</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4979.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4X Bolt LDS Sample Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NFAT2 antibody</td>
			<td>Alexis</td>
			<td>1008505</td>
			<td>Clone 7A6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NFAT2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>8032S</td>
			<td>Clone D15F1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NFAT2 antibody ChIP Grade</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab2796</td>
			<td>Clone 7A6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>big Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804R</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19-FITC mouse Anti-human</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555412</td>
			<td>Clone &#160;HIB19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD5-PE mouse Anti-human CD5&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555353</td>
			<td>Clone &#160;UCHT2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient medium Biocoll&#160; (Density 1,077 g/ml)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>L 6115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tube 1.5 mL</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS superior</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S0615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSCalibur</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>78440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Gel Transfer Device</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IB21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Transfer Stacks, nitrocellulose, regular size</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IB23001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iDeal ChIp-seq kit for Histones</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin calcium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I3909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 680LT Donkey anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5 mg</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>926-68023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Goat anti-Mouse IgG (H + L), 0.1 mg</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>925-32210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LI-COR Odyssey Infrared Imaging System</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>B446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729692001</td>
			<td>Can be substituted with other plates in different real-time PCR instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Solution&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; OptiLyse B</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>IM1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M220 AFA-grade water</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M220 Focused-ultrasonicator</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>500295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic rack, DynaMag-15 Magnet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12301D</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Axiovert 25</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>451200</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer improved counting chamber</td>
			<td>Karl Hecht GmbH &#38;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Co KG</td>
			<td>40442012</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4 Heparin Monovette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>02.1064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey&#174; Blocking Buffer (TBS) 500 mL</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>927-50000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 100X</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A2213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerfeCTa SYBR Green FastMix</td>
			<td>Quanta Bio</td>
			<td>95072-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer CD40L promotor region forward</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-ACTCGGTGTTAGCCAGG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer CD40L promotor region reverse</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer IL-2 promotor region forward</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer IL-2 promotor region reverse</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer LCK promotor region forward</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer LCK promotor region reverse</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit mAb IgG XP Isotype Control</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td># 3900S</td>
			<td>Clone DA1E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time PCR instrument</td>
			<td>Roche</td>
			<td>LightCycler 480</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller mixers</td>
			<td>Phoenix Instrument</td>
			<td>RS-TR 5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>61870010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety-Multifly-needle 21G</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>851638235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>LC5925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker Duomax 1030</td>
			<td>Heidolph Instruments</td>
			<td>543-32205-00</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Heraeus Fresco 17</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#223;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Buffered Saline (TBS-10X)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#12498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>93595-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a chromatin immunoprecipitation assay to identify novel nfat2 target genes in chronic lymphocytic leukemia

क्रोनिक लिम्फोसाईटिक ल्यूकेमिया (CLL) घातक बी सेल क्लोन के विस्तार की विशेषता है और पश्चिमी देशों में सबसे आम ल्यूकेमिया का प्रतिनिधित्व करता है । CLL रोगियों के बहुमत रोग के एक indolent पाठ्यक्रम के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अपने ल्यूकेमिया कोशिकाओं के एक anergic phenotype, एक बी सेल बाहरी उत्तेजना के लिए अप्रतिसादी रिसेप्टर की चर्चा करते हुए दिखाते हैं । हमें हाल ही में पता चला है कि प्रतिलेखन फैक्टर NFAT2 CLL में anergy का एक महत्वपूर्ण नियामक है । विभिंन रोगों में एक प्रतिलेखन कारक की भूमिका के विश्लेषण में एक प्रमुख चुनौती अपने विशिष्ट लक्ष्य जीन की पहचान है । यह विकारी तंत्र और संभावित चिकित्सीय हस्तक्षेप के elucidation के लिए बहुत महत्व का है । क्रोमेटिन immunoprecipitation (चिप) एक क्लासिक के लिए प्रोटीन डीएनए बातचीत और, इसलिए, स्तनधारी कोशिकाओं में प्रतिलेखन कारकों के प्रत्यक्ष लक्ष्य जीन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता प्रदर्शन तकनीक है । यहां, चिप मानव CLL कोशिकाओं में NFAT2 का सीधा लक्ष्य जीन के रूप में LCK की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । डीएनए और जुड़े प्रोटीन crosslinked formaldehyde का उपयोग कर रहे है और बाद में sonication द्वारा लगभग 200-500 आधार जोड़े (बीपी) के डीएनए टुकड़ों में बाल काटना । पार से जुड़े डीएनए NFAT2 के साथ जुड़े टुकड़े तो चुनिंदा एक αNFAT2 एंटीबॉडी का उपयोग कर सेल मलबे से immunoprecipitated हैं । शुद्धि के बाद, जुड़े डीएनए टुकड़े मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (qRT-पीसीआर) के माध्यम से पता चला रहे हैं । स्पष्ट संवर्धन के साथ डीएनए अनुक्रम NFAT2 द्वारा vivo मेंलक्षित कर रहे हैं, जो जीनोम के क्षेत्रों का प्रतिनिधित्व करते हैं । डीएनए की उचित कतरन और आवश्यक एंटीबॉडी के चयन इस विधि के सफल आवेदन के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैं । इस प्रोटोकॉल लक्ष्य जीन के साथ NFAT2 के प्रत्यक्ष बातचीत के प्रदर्शन के लिए आदर्श है । इसकी प्रमुख सीमा कठिनाई बड़े पैमाने पर बरकरार जीवों में एकाधिक प्रतिलेखन कारकों के लक्ष्य जीन का विश्लेषण परख में चिप को रोजगार है ।

चित्रा 1 एक CLL रोगी के एक अनुकरणीय प्रवाह cytometry विश्लेषण से पता चलता है CD19-FITC और CD5-पीई एंटीबॉडी के साथ दाग के बाद प्रदर्शन किया । चित्रा 1a लिम्फोसाइटों के गेटिंग दिखाता है, CLL ...

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A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

क्रोनिक लिम्फोसाईटिक ल्यूकेमिया (CLL) पश्चिमी दुनिया में सबसे आम ल्यूकेमिया है । NFAT प्रतिलेखन कारकों विकास और कई प्रकार के सेल में सक्रियण के महत्वपूर्ण नियामकों हैं । यहां, हम NFAT2 के उपंयास लक्ष्य जीन की पहचान करने के लिए मानव CLL कोशिकाओं में क्रोमेटिन immunoprecipitation (चिप) के उपयोग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ।

एक क्रोमेटिन Immunoprecipitation परख पुरानी लिम्फोसाईटिक ल्यूकेमिया में उपंयास NFAT2 लक्ष्य जीन की पहचान करने के लिए

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

यह विधि ऑन्कोलॉजी के क्षेत्र में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करने में मदद कर सकती है जैसे संभावित चिकित्सीय हस्तक्षेप विकसित करने के लिए ख्यात लक्ष्य जीन और रोगजनक तंत्र की पहचान। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि कोई भी ज्ञात और उपन्यास लक्ष्य जीन के साथ NFAT2 और अन्य प्रतिलेखन कारकों की बातचीत का पता लगा सकता है। आम तौर पर इस विधि के लिए नए व्यक्ति संघर्ष करेंगे क्योंकि इष्टतम निर्धारण और कतरन की स्थिति स्थापित करना मुश्किल है।37% फॉर्मलडिहाइड के एक मिलीलीटर के साथ 1.5 मिलीलीटर ट्यूब भरना शुरू करना। फिर पीबीएस के चार मिलीलीटर के साथ पांच मिलीलीटर ट्यूब में 1.25 मोलर ग्लाइसिन के एक मिलीलीटर के साथ एक और 1.5 मिलीलीटर ट्यूब भरें। इसके बाद, कोशिकाओं की उत्तेजना के बाद पाठ प्रोटोकॉल के अनुसार कोशिकाओं स्पिन, और फिर से PBS के ५०० माइक्रोलीटर में कोशिकाओं को निलंबित और एक बर्फ से भरे बॉक्स में ट्यूब जगह है ।कोशिकाओं में 37% फॉर्मलडिहाइड के 13.5 माइक्रोलीटर जोड़ें और ऊपर और नीचे पाइपिंग करके मिलाएं। फिर कमरे के तापमान पर निलंबन को इनक्यूबेट करें। इसके बाद फिक्सेशन रोकने के लिए सवा मोलर ग्लाइसिन के 57 माइक्रोलीटर डालें।और निलंबन को पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करने की अनुमति दें। इनक्यूबेशन अवधि के तुरंत बाद कोशिकाओं को बर्फ पर रखें और कोशिकाओं को चार डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए ५०० बार जी पर अपकेंद्रित्र करें । फिर सुपरनेट को एस्पिरेट करें।इसके बाद, कोशिकाओं को चार डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए २०० बार जी पर बर्फ-ठंडे पीबीएस के एक मिलीलीटर के साथ दो बार धोएं और सुपरनैट्ट को हटा दें । सेल पेलेट को पांच मिलीलीटर लाइसिस बफर एक में ऊपर और नीचे पाइपिंग करके फिर से खर्च करें। फिर नमूनों को बर्फ पर रखें और उन्हें 10 मिनट तक मिलाते हुए इनक्यूबेट करें।इसके बाद, ट्यूबों को चार डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए 500 बार जी पर अपकेंद्रित्र करें। फिर सुपरनेट को ध्यान से हटाने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें। लाइसिस बफर दो के पांच मिलीलीटर में कोशिकाओं को समरूप करें और मिश्रण करने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट करें।फिर मिलाते हुए 10 मिनट के लिए बर्फ पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन अवधि के बाद चार डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए ५०० बार जी पर ट्यूबों अपकेंद्रित्र, और ध्यान से सुपरनैंट को हटा दें । इसके बाद, 1X प्रोटीज अवरोधक के साथ बफर एक कतरन में सेल गोली को फिर से खर्च करें।फिर 10 मिनट के लिए बर्फ पर सेल निलंबन इनक्यूबेट। कोशिका निलंबन के 140 माइक्रोलीटर को सोनिकेटर ट्यूबों में स्थानांतरित करें जो हवा के बुलबुले बनाने से बचने के लिए ध्यान रखते हैं। ट्यूबों को सात डिग्री सेल्सियस पर एक केंद्रित-अल्ट्रासोनिकेटर में रखें और 10 से सात और डेढ़ मिनट के लिए कतरनी रखें।सेल निलंबन को 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें। चार डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 15, ७०० बार जी पर नमूनों को अपकेंद्रित्र, और एक नई ट्यूब में सुपरनैंट इकट्ठा । सबसे पहले, एक १.५-मिलीलीटर ट्यूब में प्रत्येक वर्षा के लिए प्रोटीन ए-लेपित मोतियों के 20 माइक्रोलीटर तैयार करें ।मोतियों को एक मिनट के लिए चुंबकीय रैक पर व्यवस्थित करने की अनुमति दें, और सुपरनैंट को हटा दें। फिर ऊपर और नीचे पाइपिंग करके प्रोटीन ए-लेपित मोतियों के प्रत्येक 20 माइक्रोलीटर के लिए 1X चिप बफर एक के ४० माइक्रोलीटर के साथ मोतियों को धोएं । मोतियों को एक मिनट के लिए चुंबकीय रैक पर व्यवस्थित करने और सुपरनैंट को हटाने की अनुमति दें।1X chIP बफर एक के अपने मूल मात्रा में मोतियों को फिर से निलंबित करने से पहले इस धोने की प्रक्रिया को तीन बार दोहराएं। मोतियों में बीएसए प्रोटीज अवरोधक, 5X चूरमे बफर, और सीआईपी-सेक्यू ग्रेड पानी जोड़ें। इसके बाद, कतरनी क्रोमेटिन जोड़ें।NFAT2 एंटीबॉडी पर कब्जा करने के लिए एंटी-NFAT2 एंटीबॉडी के 10 माइक्रोग्राम का उपयोग करें, और एक नियंत्रण के रूप में आईजीजी एंटीबॉडी के २.५ माइक्रोग्राम । छह आरपीएम पर घूर्णन एक पहिया पर चार डिग्री सेल्सियस पर रात भर मिश्रण इनक्यूबेट । अगले दिन ट्यूबों को 7, 000 बार जी पर पांच सेकंड के लिए स्पिन करें और उन्हें एक मिनट के लिए चुंबकीय रैक पर इनक्यूबेट करें।फिर सुपरनेट को एस्पिरेट करें और एक बार मोतियों को धोने के साथ एक, दो, तीन और लगातार चार धोएं। एक मिनट के लिए चुंबकीय रैक पर ट्यूबों इनक्यूबेटिंग से पहले ७००० बार जी पर पांच सेकंड के लिए ट्यूबों स्पिन । इसके बाद, सुपरनेट निकालें और अगला वॉश बफर जोड़ें।अंतिम धोने के बाद, ट्यूबों को 7000 बार में पांच सेकंड के लिए स्पिन करें जी एक मिनट के लिए चुंबकीय रैक पर ट्यूबों को इनक्यूबेट करें। सुपरनेट निकालें और एल्यूशन बफर वन के 100 माइक्रोलीटर में मोतियों को लें। इसके बाद रोटेटिंग व्हील पर ट्यूबों को 30 मिनट तक इनक्यूबेट करें।इसके बाद, संक्षेप में ट्यूबों को स्पिन करें और उन्हें एक मिनट के लिए चुंबकीय रैक पर रखें। सुपरनेटेंट को एक नई 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें और एल्यूशन बफर दो के चार माइक्रोलीटर जोड़ें। इनपुट कंट्रोल मिक्स बनाने के लिए कतरनी क्रोमेटिन का एक माइक्रोलीटर मिलाएं जिसमें एल्यूशन बफर वन के 99 माइक्रोलीटर और एल्यूशन बफर टू के चार माइक्रोलीटर हैं।फिर चार घंटे तक नमूनों को मिलाते हुए 65 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। इसके बाद, ट्यूबों में 100% आइसोप्रोपेनॉल के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें। भंवर और ७० बार जी पर पांच सेकंड के लिए नमूनों स्पिन तो प्रत्येक नमूने के लिए चुंबकीय मोती के 10 माइक्रोलीटर जोड़ें ।भंवर और एक घंटे के लिए कमरे के तापमान पर एक घूर्णन पहिया पर नमूनों को इनक्यूबेट। इसके बाद, ट्यूबों को संक्षेप में स्पिन करें और उन्हें एक मिनट के लिए चुंबकीय रैक पर रखें। सुपरनेट को एस्पिरेट करें और वॉश बफर वन के 100 माइक्रोलीटर में मोतियों को फिर से खर्च करें।ट्यूबों को कमरे के तापमान पर घूर्णन पहिया पर पांच मिनट के लिए मिलाने और इनक्यूबेट करने के लिए उलटा करें। इसके बाद, ट्यूबों को संक्षेप में अपकेंद्रित्र करें। उन्हें एक मिनट के लिए एक चुंबकीय रैक में रखें, और सुपरनेट को हटाने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें।इसके बाद वॉश बफर टू के 100 माइक्रोलीटर डालें। ट्यूबों को कमरे के तापमान पर घूर्णन पहिया पर पांच मिनट के लिए मिलाने और इनक्यूबेट करने के लिए उलटा करें। इसके बाद, संक्षेप में ट्यूबों को अपकेंद्री करें और उन्हें एक मिनट के लिए चुंबकीय रैक में रखें।आकांक्षा के माध्यम से वॉश बफर टू को हटाएं और एल्यूशन बफर के 55 माइक्रोलीटर में मोतियों को फिर से खर्च करें। उपजी डीएनए को 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर घूर्णन पहिया में नमूनों को इनक्यूबेट करने के लिए । इसके बाद, ट्यूबों को संक्षेप में स्पिन करें और उन्हें एक मिनट के लिए चुंबकीय रैक में रखें।अंत में, सुपरनेट को नई 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों में स्थानांतरित करें। यह प्रोटोकॉल पहले एक संभावित NFAT2 लक्ष्य के रूप में एलसीके का विश्लेषण करने वाले जुर्कट कोशिकाओं के साथ किया गया था। जैसा कि यहां दिखाया गया है, इष्टतम परिणाम आईएल-2 सकारात्मक नियंत्रण और एलसीके डीएनए के महत्वपूर्ण संवर्धन द्वारा प्रलेखित किए गए थे।सबऑप्टिमल कतरनी या गायब फिक्सेशन से खराब गुणवत्ता वाले डीएनए हो सकते हैं। अंत में, इस प्रोटोकॉल को प्राथमिक मानव सीएलएल कोशिकाओं के साथ किया गया था जिसमें सीडी 40एल को सकारात्मक नियंत्रण और एलसीके के रूप में प्रयोगात्मक लक्ष्य के रूप में कार्य करना था। जैसा कि एलसीके डीएनए के मजबूत संवर्धन द्वारा प्रदर्शित किया गया है, एलकेके प्राथमिक मानव सीएलएल कोशिकाओं में एक प्रत्यक्ष NFAT2 लक्ष्य है।अपर्याप्त कतरन जिसके परिणामस्वरूप खराब गुणवत्ता वाले डीएनए उप-क्षातिमल परिणाम वापस कर सकते हैं। इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय यह याद रखना महत्वपूर्ण है कि निर्धारण और सोनीशन कदम इस विधि की सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं और इसका विश्लेषण किए जा रहे कोशिकाओं में समायोजित किया जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

उपयोग कार्यात्मक जीनोमिक्स स्क्रीनिंग कैंसर सेल उपगोल संस्कृतियों में संभावित उपन्यास ड्रग लक्ष्यों की पहचान करने के लिए

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

नमूना और प्रक्रिया के लिए व्यापक प्रोटोकॉल मापने योग्य अवशिष्ट रोग और ल्यूकेमिया से प्रभावित के लिए अस्थि मज्जा तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया में स्टेम सेल

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

प्राथमिक तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया में और रोगी-व्युत्पंन-xenografts में ल्यूकेमिया स्टेम कोशिकाओं का अनुमान करने के लिए प्रवाह Cytometry, निदान पर और अनुवर्ती

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Native Chromatin Immunoprecipitation Using Murine Brain Tumor Neurospheres

देशी क्रोमेटिन Immunoprecipitation प्रयोग Murine ब्रेन ट्यूमर Neurospheres

Epigenetic modifications may be involved in the development and progression of glioma. Changes in methylation and acetylation of promoters and regulatory ...

Immunoglobulin Gene Sequence Analysis In Chronic Lymphocytic Leukemia: From Patient Material To Sequence Interpretation

जीर्ण लिम्फोसाईटिक ल्यूकेमिया में Immunoglobulin जीन अनुक्रम विश्लेषण: रोगी सामग्री से अनुक्रम व्याख्या करने के लिए

During B cell maturation, the complex process of immunoglobulin (IG) gene V(D)J recombination coupled with somatic hypermutation (SHM) gives rise to a ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

प्राथमिक ल्यूकेमिया कोशिकाओं के चयापचय प्रोफ़ाइल का आकलन

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

इन विट्रो परख से अध्ययन ट्यूमर-मैक्रोफेज इंटरेक्शन

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

A Data Integration Workflow to Identify Drug Combinations Targeting Synthetic Lethal Interactions

सिंथेटिक घातक इंटरैक्शन को लक्षित करने वाले ड्रग कॉम्बिनेशन की पहचान करने के लिए एक डेटा इंटीग्रेशन वर्कफ़्लो

A synthetic lethal interaction between two genes is given when knock-out of either one of the two genes does not affect cell viability but knock-out of ...

Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking

परमाणु/

Nuclear export of macromolecules is often deregulated in cancer cells. Tumor suppressor proteins, such as p53, can be rendered inactive due to aberrant ...

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

लक्ष्य एंटीजन विशिष्ट चिकित्सीय एंटीबॉडी के ट्यूमर और ऊतक वितरण का विश्लेषण

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...