Name: a chromatin immunoprecipitation assay to identify novel nfat2 target genes in chronic lymphocytic leukemia
Uploaded: 2018-12-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia at JoVE.com

この作品は、DFG によって支えられた MU 3340/1-1 およびドイツ Krebshilfe 付与 111134 (M.R.M. に授与の両方) を付与します。ありがとうエルケ Malenke 優れたテクニカル サポート)。

ひと由来の材料とすべての実験は、テュービンゲン大学の倫理委員会によって承認され、本研究のサンプルを貢献したすべての患者から文書によるインフォームド コンセントを得た。
1. 分離および刺激の Jurkat 細胞
注: プロトコルを最適化して、NFAT2 の高レベル表現に知られている Jurkat 細胞ラインを使用します。すべての手順は、層流フードの下で?...

成功したチップ試金の実行の重要なステップは、適切な抗体の選択とプロセス25をせん断クロマチンの最適化です。ΑNFAT2 抗体の選択は、このプロトコルの開発時に特に難しいことがわかった。市販のいくつかの αNFAT2 抗体と西部にしみが付くことの罰金これらの作品や他のアプリケーションの大半が、クローン 7A6 だったチップ7正常に使用できる唯一の抗...

CD5、CD23、CD19 の明確な蓄積を展示表現成熟 B 細胞1、慢性リンパ性白血病 (CLL) は、欧米の成人の最も一般的な白血病を表します。ほとんどの患者は、長年にわたり特定の治療を必要としない怠惰病コースを展示します。対照的に、何人かの患者は、免疫化学療法または他の目標とされた療法2,3で即時の治療的介入を必要とする急速な進行を示します。活性化 T 細胞 (NFAT) の核因子は様々 な発達を制御する転写因子と多数のセル型4,5,6活性化プロセスの家族です。我々 は最近怠惰病7患者の過剰発現と CLL 細胞における NFAT2 の憲法活性化を示した。ここでは、それはアネルギー7と呼ばれる B 細胞受容体刺激に応答していない状態を調節します。NFAT2 リンパ球特定の蛋白質のチロシンのキナーゼ (LCK) プロモーターに結合しを CLL 細胞特定のクロマチン免疫沈降分析におけるLCKの発現を調節することを示す (チップ) を開発、採用します。
チップは8遺伝子発現における転写因子の役割を調査するいくつかのテクニックのひとつです。遺伝子発現はしっかりと演出した非常に複雑な方法でいくつかの規制当局がこのプロセス9,10、11,12かけがえのない参加転写因子。多数種 (例えばの開発と分化)13,14,15、時空のコンテキストにおける遺伝子発現を調節する転写因子が同定されています。 16,17,18。転写因子が関与する複雑な制御機構でのエラーは、がん19,20を含む病理学的プロセスの様々 な可能性があります。したがって、転写因子とそのそれぞれのターゲットの同定は、新しい治療の道21,22を提供しています。チップ、ゲルシフトアッセイ (EMSA)、様々 な DNA プルダウン ・ アッセイ、レポーターの試金8,11,12,のようないくつかの方法がありますこの興味をそそられる分野を調査するには23,24。
特定の転写因子がゲノムの特定の地域と対話することを実証するには、生体内で、チップは理想的な手法25です。このため、DNA と細胞内タンパク質関連は紫外線照射またはホルムアルデヒド (架橋チップ、XChIP) を使用して架橋します。良い DNA とタンパク質の回収いわゆるネイティブ チップ (NChIP)26を取得するこの手順は省略されます。DNA 蛋白質の複合体はその後 200-500 の塩基対 (bp) および興味の転写調節因子に対する特異抗体を用いた細胞の残骸から沈澱の断片に sonication によって毛を刈る。関連付けられている DNA のフラグメントは精製し、PCR、分子クローニングおよび順序によって特徴付けられます。代替技術は、沈澱の DNA を分析するのに (チップ ・ オン ・ チップ) のマイクロ アレイや次世代シーケンス (チップ Seq) を使用します。
チップ ギルモア初と UV を使用時 1984 年に Lis クロスリンク DNA 共有結合する光し体内蛋白質をバインド細菌27。セル換散、細菌 RNA ポリメラーゼの免疫沈降の時に知られていた遺伝子の特定のプローブは体内分布と RNA ポリメラーゼの密度をマップする使用されました。メソッドは、熱ショック蛋白質遺伝子ショウジョウバエ28の真核生物の RNA ポリメラーゼ II の分布を分析する同じ捜査官によってその後使用されました。XChIP アッセイは、・ バーシャフ スキーと最初熱ショック蛋白質遺伝子29,30とヒストン H4 の関連を研究する架橋ホルムアルデヒドを使用した同僚によってさらに洗練されました。NChIP のアプローチは、自然そのままのエピトープによるより良い DNA および蛋白質の回復の利点を運ぶと、したがってより抗体の特異性は、最初 Hebbes と 1988年31同僚によって記述されていた。
DNA 蛋白質の相互作用を分析する他の技術と比較してチップの利点は、実際には、転写因子の実際の相互作用は調査生体内でないプローブすることができます、バッファーまたはゲルによって作成された人工の条件8、11,12を採用しました。次世代シーケンサーとチップを組み合わせて、複数のターゲットを同時に識別できます。
この技術の主要な制限は、そのまま生物25大規模の試金への限られた適用性です。差動遺伝子発現パターンの解析は、低レベルでのみまたは狭い時間帯にそれぞれの蛋白質を表現する場合、チップの技術を使用してやりがいのあることができます。別の可能性のある要因は、チップ11適して適切な抗体の可用性です。
定量的リアルタイム PCR (qRT PCR) による転写因子の標的遺伝子を生体内で識別するためここで示したチップ プロトコルを使用できます。具体的には、目標は、CLL の NFAT2 の新規標的遺伝子を識別するためにだった。チップは、直接細胞 CLL 患者の自然な条件の下で別のターゲット遺伝子のプロモーター領域の NFAT2 結合を示す潜在性のために選ばれました。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 X PBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube shaker Themomixer comfort</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5355 000.011</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Bolt Sample Reducing Agent</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X Bolt MES SDS Running Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 % Formaldehyde p.a., ACS</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4979.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4X Bolt LDS Sample Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NFAT2 antibody</td>
			<td>Alexis</td>
			<td>1008505</td>
			<td>Clone 7A6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NFAT2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>8032S</td>
			<td>Clone D15F1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NFAT2 antibody ChIP Grade</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab2796</td>
			<td>Clone 7A6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>big Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804R</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19-FITC mouse Anti-human</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555412</td>
			<td>Clone &#160;HIB19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD5-PE mouse Anti-human CD5&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555353</td>
			<td>Clone &#160;UCHT2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient medium Biocoll&#160; (Density 1,077 g/ml)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>L 6115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tube 1.5 mL</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS superior</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S0615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSCalibur</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>78440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Gel Transfer Device</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IB21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Transfer Stacks, nitrocellulose, regular size</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IB23001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iDeal ChIp-seq kit for Histones</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin calcium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I3909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 680LT Donkey anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5 mg</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>926-68023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Goat anti-Mouse IgG (H + L), 0.1 mg</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>925-32210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LI-COR Odyssey Infrared Imaging System</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>B446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729692001</td>
			<td>Can be substituted with other plates in different real-time PCR instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Solution&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; OptiLyse B</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>IM1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M220 AFA-grade water</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M220 Focused-ultrasonicator</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>500295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic rack, DynaMag-15 Magnet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12301D</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Axiovert 25</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>451200</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer improved counting chamber</td>
			<td>Karl Hecht GmbH &#38;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Co KG</td>
			<td>40442012</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4 Heparin Monovette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>02.1064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey&#174; Blocking Buffer (TBS) 500 mL</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>927-50000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 100X</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A2213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerfeCTa SYBR Green FastMix</td>
			<td>Quanta Bio</td>
			<td>95072-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer CD40L promotor region forward</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-ACTCGGTGTTAGCCAGG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer CD40L promotor region reverse</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer IL-2 promotor region forward</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer IL-2 promotor region reverse</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer LCK promotor region forward</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer LCK promotor region reverse</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit mAb IgG XP Isotype Control</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td># 3900S</td>
			<td>Clone DA1E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time PCR instrument</td>
			<td>Roche</td>
			<td>LightCycler 480</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller mixers</td>
			<td>Phoenix Instrument</td>
			<td>RS-TR 5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>61870010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety-Multifly-needle 21G</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>851638235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>LC5925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker Duomax 1030</td>
			<td>Heidolph Instruments</td>
			<td>543-32205-00</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Heraeus Fresco 17</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#223;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Buffered Saline (TBS-10X)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#12498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>93595-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a chromatin immunoprecipitation assay to identify novel nfat2 target genes in chronic lymphocytic leukemia

慢性リンパ性白血病 (CLL) と悪性 B 細胞のクローンの拡張によって特徴付けられる欧米で最も一般的な白血病を表します。CLL の患者の大半は病気の怠惰なコースだけでなく、白血病細胞アネルギーの表現型を表示し、B 細胞受容体の外部刺激に応答を参照します。我々 は最近、CLL のアネルギーの重要な調節因子である転写因子 NFAT2 を示しています。さまざまな病気における転写因子の役割の解析における主要な課題は、その特定のターゲット遺伝子の id です。これは発病メカニズムと潜在的な治療上の介在の解明にとって重要なのです。クロマチン免疫沈降 (チップ) 蛋白質 DNA の相互作用を示すための古典的な手法は、したがって、哺乳類細胞における転写因子の標的遺伝子を識別するために使用できる、.ここでは、チップは、CLL 細胞における NFAT2 の直接の標的遺伝子としてLCKを識別するために使用されました。DNA と関連するタンパク質架橋ホルムアルデヒドを使用して、その後約 200-500 塩基対 (bp) の DNA 断片に超音波処理によるせん断。NFAT2 に関連付けられた架橋の DNA のフラグメントが、選択的に αNFAT2 抗体を用いた細胞の残骸から沈澱。浄化後関連付けられている DNA のフラグメントは量的なリアルタイム PCR (qRT PCR) によって検出されます。明らか濃縮 DNA シーケンスは、生体内でNFAT2 がターゲットにしているゲノムの領域を表しています。DNA と必要な抗体の選択の適切な剪断がこのメソッドの成功のアプリケーションのため特に重要です。このプロトコルは NFAT2 の標的遺伝子との直接相互作用のデモに最適です。その主要な制限は、そのまま生物における複数の転写因子のターゲット遺伝子を分析大規模な試金でチップを採用するが困難です。

図 1は、CD19 FITC と PE CD5 抗体で染色後実行 CLL 患者の模範的な流れフローサイトメトリー解析を示しています。図 1a CLL の患者の血液中の細胞の大半を表す、リンパ球のゲートを示しています。図 1 bは、CD19 の割合を示しています+/CD5+ CLL 細胞は、この例ではリンパ球の 89.03% を表しま?...

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A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

慢性リンパ性白血病 (CLL) は西部の世界で最も一般的な白血病です。NFAT 転写因子は、開発と様々 な細胞タイプにおける活性化の重要なレギュレータです。NFAT2 の新規標的遺伝子を識別するために CLL 細胞のクロマチン免疫沈降 (チップ) の使用のためのプロトコルを紹介します。

慢性リンパ性白血病の新規 NFAT2 ターゲット遺伝子を識別するクロマチン免疫沈降法

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

この方法は、推定標的遺伝子の同定や病原性メカニズムなどの腫瘍学の分野における重要な情報を提供し、潜在的な治療介入を開発するのに役立ちます。この技術の主な利点は、NFAT2および他の転写因子と既知および新規の標的遺伝子との相互作用を検出できることである。一般的に、この方法に新しい個人は、最適な固定と剪断条件を確立することが困難であるため、苦労します。1.5ミリリットルのチューブを1ミリリットル37%ホルムアルデヒドで満たします。その後、別の1.5ミリリットルチューブに1.25モルグリシンの1ミリリットルを5ミリリットルのチューブに4ミリリットルのPBSで充填します。次に、細胞の刺激がテキストプロトコルに従って細胞を回転させ、500マイクロリットルのPBSで細胞を再懸濁し、氷で満たされた箱にチューブを入れた。細胞に37%ホルムアルデヒドの13.5マイクロリットルを加え、上下にピペットで混ぜます。その後、懸濁液を室温でインキュベートする。この後、57マイクロリットルの1.25モルグリシンを加えて固定を止める。そして、懸濁液を室温で5分間インキュベートする。インキュベーション期間の直後に細胞を氷の上に置き、細胞を摂氏4度で5分間5分間Gの500倍に遠心します。その後、上清を吸引します。次に、200倍Gの氷冷PBSを1ミリリットルで摂氏4度で5分間洗浄し、上清を取り除きます。細胞ペレットを5ミリリットルのリシスバッファー1つに再懸濁し、上下にピペット処理します。その後、氷の上にサンプルを置き、10分間振ってそれらをインキュベートします。この後、チューブを500倍Gで摂氏4度で5分間遠心する。その後、慎重に上清を除去するためにピペットを使用しています。5ミリリットルのリシスバッファー2とピペットを上下に均質化して混合します。その後、氷の上の細胞を揺れで10分間インキュベートします。インキュベーション期間の後、チューブを500倍Gで摂氏4度で5分間遠心し、上清を慎重に取り除きます。次に、1Xプロテアーゼ阻害剤を有する剪断緩衝液中の細胞ペレットを再懸濁する。その後、氷上の細胞懸濁液を10分間インキュベートする。気泡を形成しないように注意を払って、細胞懸濁液の140マイクロリットルを超音波管に移します。チューブを摂氏7度の焦点を合わせ、10~7分と1/2分間せん断します。細胞懸濁液を1.5ミリリットルのチューブに移します。試料を摂氏4度で10分間10分間15、700倍Gで遠心分離し、新しいチューブに上清を集める。まず、1つの1.5ミリリットルチューブの各沈殿物に対して20マイクロリットルのタンパク質Aコーティングビーズを調製します。ビーズを磁気ラックに1分間落ち着かせ、上清を取り外します。次に、40マイクロリットルの1Xチップバッファーでビーズを10マイクロリットルで洗浄し、タンパク質Aコーティングビーズの20マイクロリットルごとに、上下にピペット処理します。ビーズを磁気ラックに1分間落ち着かせ、上清を取り外します。この洗浄プロセスをさらに3回繰り返してから、ビーズを元の体積1X chIPバッファー1に再中断します。BSAプロテアーゼ阻害剤、5X chIPバッファー、およびChIP-seq等級水をビーズに加えます。次に、シアドクロマチンを加えます。10マイクログラムの抗NFAT2抗体を使用してNFAT2を捕捉し、IgG抗体を2.5マイクログラムのコントロールとして使用します。6 RPMで回転する車輪の4°Cで一晩混合物をインキュベートする。翌日、Gの7,000倍で5秒間チューブを回転させ、磁気ラックに1分間インキュベートします。その後、上清を吸引し、1、2、3、および4連続して洗浄バッファーでビーズを1回洗浄します。磁性ラックのチューブを1分間インキュベートする前に、7000倍Gで5秒間チューブを回転させます。その後、上清を取り出し、次の洗浄バッファーを追加します。最後の洗浄後、磁性ラックのチューブを1分間、7000回G.Incubateで5秒間回転させます。上清を取り除き、溶出バッファー 1 の 100 マイクロリットルでビーズを取ります。その後、回転ホイールのチューブを30分間インキュベートします。次に、チューブを短く回転させ、磁気ラックに1分間置きます。上清を新しい1.5ミリリットルチューブに移し、溶出バッファー2の4マイクロリットルを加えます。入力制御を作成するために、1マイクロリットルのシアドクロマチンと溶出バッファー19マイクロリットルと溶出バッファー2の4マイクロリットルを混合する。その後、摂氏65度で4時間、サンプルを振ってインキュベートします。この後、チューブに100%イソプロパノールの100マイクロリットルを加えます。渦を回し、サンプルを7000倍のG.で5秒間回転させ、各サンプルに10マイクロリットルの磁気ビーズを加えます。室温で回転ホイール上のサンプルを1時間インキュベートします。次に、チューブを短く回転させ、磁気ラックに1分間置きます。上清を吸引し、100マイクロリットルの洗浄バッファー1にビーズを再懸濁する。チューブを反転して、室温で回転ホイールで5分間混合してインキュベートします。次に、チューブを少し遠心分離します。磁気ラックに1分間置き、ピペットを使用して上清を取り除きます。その後、100マイクロリットルの洗浄バッファーを2個加えます。チューブを反転して、室温で回転ホイールで5分間混合してインキュベートします。この後、チューブを短く遠心分離し、1分間磁気ラックに入れてください。吸引によって洗浄緩衝液2を取り外し、溶出バッファーの55マイクロリットルにビーズを再懸濁させる。沈殿したDNAを室温で回転する車輪の中で15分間インキュベートする。この後、チューブを短く回転させ、1分間磁気ラックに入れてください。最後に、上清を新しい1.5ミリリットルチューブに移します。このプロトコルは、最初に、潜在的なNFAT2標的としてLCKを分析するJurkat細胞で行われた。ここに示すように、最適な結果はIL-2陽性対照およびLCK DNAの有意な濃縮によって文書化された。最適でないせん断または欠損固定は、質の悪いDNAにつながる可能性があります。最後に、このプロトコルは、実験対象として陽性対照として機能するCD40LとLCKを有する一次ヒトCLL細胞で行われた。LCK DNAの強い濃縮によって示されるように、LCKは、初原ヒトCLL細胞における直接NFAT2標的である。不十分な剪断は、質の悪いDNAをもたらすと、最適でない結果を返すことができます。この手順を試みる間、固定と超音波処理のステップは、この方法の成功のために重要であり、分析される細胞に調整する必要があることを覚えておくことが重要です。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

癌細胞スフェロイド培養における潜在的に新規薬剤標的を同定するためのスクリーニング機能ゲノミクスを利用

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

サンプルおよび測定可能な残存病変と急性骨髄性白血病の白血病幹細胞を測定するプロセス骨髄に対する包括的なプロトコル

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

フローサイトメトリーを診断とフォローで主に急性骨髄性白血病、白血病幹細胞患者由来異種での見積もりに

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Native Chromatin Immunoprecipitation Using Murine Brain Tumor Neurospheres

マウスの脳腫瘍細胞を使用してネイティブのクロマチン免疫沈降

Epigenetic modifications may be involved in the development and progression of glioma. Changes in methylation and acetylation of promoters and regulatory ...

Immunoglobulin Gene Sequence Analysis In Chronic Lymphocytic Leukemia: From Patient Material To Sequence Interpretation

慢性リンパ性白血病の免疫グロブリン遺伝子のシーケンス解析: シーケンスの解釈に患者材料から

During B cell maturation, the complex process of immunoglobulin (IG) gene V(D)J recombination coupled with somatic hypermutation (SHM) gives rise to a ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

主な白血病細胞の代謝プロファイルの評価

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

腫瘍マクロファージ相互作用を研究するインビトロアッセイ

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

A Data Integration Workflow to Identify Drug Combinations Targeting Synthetic Lethal Interactions

合成致死的相互作用を対象とした薬剤の組み合わせを特定するためのデータ統合ワークフロー

A synthetic lethal interaction between two genes is given when knock-out of either one of the two genes does not affect cell viability but knock-out of ...

Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking

核/細胞質タンパク質の密売を監視する原発性慢性リンパ球性白血病細胞の細胞分画

Nuclear export of macromolecules is often deregulated in cancer cells. Tumor suppressor proteins, such as p53, can be rendered inactive due to aberrant ...

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

標的抗原特異的治療抗体の腫瘍と組織分布の分析

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...