Name: a chromatin immunoprecipitation assay to identify novel nfat2 target genes in chronic lymphocytic leukemia
Uploaded: 2018-12-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia at JoVE.com

이 작품은 DFG에 의해 지원 되었다 뮤 3340/1-1과 도이치 Krebshilfe 111134 (둘 다 M.R.M.에 게 수 여 하는) 부여 부여. 우리 감사 Elke Malenke 우수한 기술 지원).

모든 실험 인간의 소재와 실시 튀빙겐 대학교의 윤리 위원회에 의해 승인 했다 고 서 면된 동의 샘플이이 연구에 기여 하는 모든 환자에서 얻은.
1. 격리와 자극의 Jurkat 세포
참고: 프로토콜을 최적화 하려면 사용 Jurkat 세포 라인을 표현 하는 NFAT2의 높은 수준으로 알려져 있다. 모든 단계는 층 류 두건 아래 수행 됩니다.
<ol><li>물 욕조에 37 ° C로 온난 하 ?...

성공적인 칩 분석 실험을 수행의 중요 한 단계는 적절 한 항 체의 선택과 과정25전단 chromatin의 최적화. ΑNFAT2 항 체의 선택이이 프로토콜의 개발 중 특히 어려운 것으로 판명. 상업적으로 사용할 수 있는 여러 αNFAT2 항 체와이 작품 부 럽 잘 및 다른 응용 프로그램의 대부분은, 복제 7A6 칩7성공적으로 사용 될 수 있는 유일한 항 체 했다. 도 살 일 걸 요 다른 제조 ?...

만성 림프모구 백혈병 (CLL) 나타냅니다 서방 국가 있는 성인에서 가장 흔한 백혈병,1세포 성숙 B 표현 CD19, CD23, 그리고 CD5의 고유한 축적을 전시. 대부분의 환자 들은 몇 년에 대 한 구체적인 치료를 필요로 하지 않는다는 나태 한 질병 과정을 전시 한다. 반면, 일부 환자는 면역 화학요법 또는 다른 표적으로 한 치료2,3즉각적인 치료 내정간섭을 요구 하는 빠른 진행을 보여줍니다. 활성화 된 T 세포 (NFAT)의 핵 요소는 다양 한 발달을 조절 하는 전사 인자와 수많은 셀 종류4,,56활성화 프로세스의 집합입니다. 우리가 최근에7나태 한 질병 가진 환자에서 overexpression 헌법의 및 활성화 CLL 세포에 NFAT2 보여 주었다. 여기, 그것은 라는 아7B 세포 수용 체 자극에 응답 하지 않는 상태를 조절. NFAT2에 림프 톨 특정 단백질 티로신 키 니 아 제 (LCK) 발기인 및 인간 CLL 세포, 특정 chromatin immunoprecipitation 분석 결과에서 LCK 식 조절 (칩) 개발 및 고용.
칩은 유전자 표현8에 녹음 방송 요인의 역할을 조사 하기 위해 여러 가지 기술 중 하나. 유전자 발현은 밀접 하 게이 과정9,10,,1112에 대신할 참여 하는 전사 인자와 매우 복잡 한 방식으로 여러 규제에 의해 조율 된. 공간과 시간적 맥락에서 유전자 발현을 조절 하는 전사 인자에 수많은 종 (예를 들어, 개발 및 차별화)13,,1415, 발견 되었습니다. 16,,1718. 오류와 관련 된 녹음 방송 요인 복잡 한 제어 메커니즘에 암19,20를 포함 하 여 pathologic 프로세스의 다양 한 발생할 수 있습니다. 따라서, 녹음 방송 요인 및 그들의 각각 대상의 식별 소설 치료 길21,22를 제공할 수 있습니다. 이 흥미로운 분야를 조사 하기 위해 여러 가지 방법을 칩, 전기 이동 기동성 교대 분석 실험 (EMSA), 다양 한 DNA 풀 다운 분석 실험 및 기자-분석 실험8,,1112, 처럼 사용할 수 있습니다. 23 , 24.
특정 전사 인자는 게놈의 특정 지역 상호 작용 입증을 vivo에서 칩 이상적인 기술25입니다. 이 위해 DNA와 살아있는 세포에 관련 된 단백질은 십자가 UV 방사선 조사 또는 포 름 알 데히드 (상호 연결 된 칩, XChIP)를 사용 하 여. 이 단계는 더 나은 DNA 및 단백질 복구 소위 기본 칩 (NChIP)26에서 생략 됩니다. DNA 단백질 복합물은 이후 약 200-500의 기본적인 쌍 (bp)와 관심의 녹음 방송 요인에 대 한 특정 항 체를 사용 하 여 셀에서에서 immunoprecipitated의 파편으로 쥡니다에 의해 전단. 그리고 나 서 연결 된 DNA 파편 정화 PCR, 분자 클로닝 및 시퀀싱에 의해 특징. 대체 기술을 사용 하 여 microarrays (칩-온-칩) 또는 다음-세대 시퀀싱 (칩 Seq) immunoprecipitated DNA를 분석.
칩 길모어에 의해 처음 도입 및 1984 그들은 UV를 사용 하는 경우에 Lis covalently 상호 연결 DNA 빛과 생활에 단백질을 바운드 박테리아27. 세포 세포의 용 해 및 세균성 RNA 중 합 효소의 immunoprecipitation, 알려진된 유전자의 특정 프로브는 vivo에서 유통 및 RNA 중 합 효소의 밀도 매핑하는 데 사용 되었다. 방법은 진 핵 RNA 중 합 효소 II 열 충격 단백질 유전자 초파리28의 분포를 분석 하 같은 수 사관에 의해 연속적으로 사용 되었다. XChIP 분석 결과 Varshavsky와 동료 처음 열 충격 단백질 유전자29,30와 H4 히스톤의 협회를 공부 cross-linking 포름알데히드를 사용 하 여 더 세련 되었다. 때문에 자연스럽 게 그대로 epitopes 더 나은 DNA와 단백질 복구의 이점을 운반 NChIP 접근 및, 따라서, 더 큰 항 체 특이성, 처음 Hebbes와 동료 198831에 의해 설명 되었다.
칩의 DNA 단백질 상호 작용 분석을 다른 기술에 비해 장점은 사실, 녹음 방송 요인의 실제 상호 작용 수 조사 비보에 아무 프로브 또는 버퍼 또는 젤에 의해 만들어진 인공 조건 8,,1112고용. 차세대 시퀀싱 칩을 결합 하 여 여러 개의 목표를 동시에 확인할 수 있습니다.
이 방법의 주요 한계는 그대로 생물25에 대규모 분석을 그것의 제한 적용. 도전만 수준 낮은 또는 좁은 시간 창 동안 각각 단백질 표현 됩니다 경우 칩 기술을 사용 하 여 차동 진 식 패턴의 분석 될 수 있습니다. 또 다른 잠재적으로 제한 요인은 적절 한 항 체 칩11적합의 가용성 이다.
여기에 제시 된 칩 프로토콜 양적 실시간 PCR (qRT-PCR)으로 대상 유전자의 녹음 방송 요인의 비보에 식별을 위해 사용할 수 있습니다. 특히, 목표 CLL에 NFAT2의 소설 대상 유전자를 확인 했다. 칩은 직접 인간의 CLL 환자 세포의 자연 조건 하에서 다른 대상 유전자의 발기인 지구에 NFAT2의 바인딩을 보여에 그것의 잠재력 때문에 선택 되었다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 X PBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube shaker Themomixer comfort</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5355 000.011</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Bolt Sample Reducing Agent</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X Bolt MES SDS Running Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 % Formaldehyde p.a., ACS</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4979.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4X Bolt LDS Sample Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NFAT2 antibody</td>
			<td>Alexis</td>
			<td>1008505</td>
			<td>Clone 7A6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NFAT2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>8032S</td>
			<td>Clone D15F1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NFAT2 antibody ChIP Grade</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab2796</td>
			<td>Clone 7A6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>big Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804R</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19-FITC mouse Anti-human</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555412</td>
			<td>Clone &#160;HIB19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD5-PE mouse Anti-human CD5&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555353</td>
			<td>Clone &#160;UCHT2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient medium Biocoll&#160; (Density 1,077 g/ml)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>L 6115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tube 1.5 mL</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS superior</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S0615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSCalibur</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>78440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Gel Transfer Device</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IB21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Transfer Stacks, nitrocellulose, regular size</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IB23001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iDeal ChIp-seq kit for Histones</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin calcium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I3909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 680LT Donkey anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5 mg</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>926-68023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Goat anti-Mouse IgG (H + L), 0.1 mg</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>925-32210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LI-COR Odyssey Infrared Imaging System</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>B446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729692001</td>
			<td>Can be substituted with other plates in different real-time PCR instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Solution&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; OptiLyse B</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>IM1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M220 AFA-grade water</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M220 Focused-ultrasonicator</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>500295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic rack, DynaMag-15 Magnet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12301D</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Axiovert 25</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>451200</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer improved counting chamber</td>
			<td>Karl Hecht GmbH &#38;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Co KG</td>
			<td>40442012</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4 Heparin Monovette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>02.1064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey&#174; Blocking Buffer (TBS) 500 mL</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>927-50000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 100X</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A2213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerfeCTa SYBR Green FastMix</td>
			<td>Quanta Bio</td>
			<td>95072-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer CD40L promotor region forward</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-ACTCGGTGTTAGCCAGG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer CD40L promotor region reverse</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer IL-2 promotor region forward</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer IL-2 promotor region reverse</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer LCK promotor region forward</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer LCK promotor region reverse</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit mAb IgG XP Isotype Control</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td># 3900S</td>
			<td>Clone DA1E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time PCR instrument</td>
			<td>Roche</td>
			<td>LightCycler 480</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller mixers</td>
			<td>Phoenix Instrument</td>
			<td>RS-TR 5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>61870010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety-Multifly-needle 21G</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>851638235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>LC5925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker Duomax 1030</td>
			<td>Heidolph Instruments</td>
			<td>543-32205-00</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Heraeus Fresco 17</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#223;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Buffered Saline (TBS-10X)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#12498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>93595-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a chromatin immunoprecipitation assay to identify novel nfat2 target genes in chronic lymphocytic leukemia

만성 림프모구 백혈병 (CLL) 악성 B 세포 복제품 확장 특징 이다 고 서방 국가에서 가장 흔한 백혈병을 나타냅니다. CLL 환자의 대다수는 질병의 나태 한 과정 뿐만 아니라 그들의 백혈병 세포의 anergic 형 B 세포 수용 체 외부 자극에 응답을 참조를 표시 합니다. 우리는 최근 녹음 방송 요인 NFAT2 CLL에 아의 중요 한 레 귤 레이 터가 나타났습니다. 다른 질병에서 녹음 방송 요인의 역할의 분석의 주요 과제는 그것의 특정 대상 유전자의 id입니다. 이 pathogenetic 메커니즘 및 잠재적인 치료 내정간섭의 해명에 대 한 큰 의미입니다. Chromatin immunoprecipitation (칩) 단백질 DNA 상호 작용을 설명 하는 고전적인 기법 이며 포유류 세포에 있는 녹음 방송 요인의 직접적인 대상 유전자를 식별 하는 데 따라서 수 있습니다. 여기, 칩 인간 CLL 세포에 NFAT2의 직접적인 대상 유전자로 LCK 를 식별 하기 위해 사용 되었다. DNA와 관련 된 단백질 포름알데히드를 사용 하 여 가교 된 이며 이후 쥡니다 대략 200-500의 기본적인 쌍 (bp)의 DNA 파편에 의해 전단. NFAT2와 관련 된 상호 연결 된 DNA 파편은 다음 선택적으로 αNFAT2 항 체를 사용 하 여 셀 파편에서 immunoprecipitated. 정화, 후 관련된 DNA 파편은 양적 실시간 PCR (qRT-PCR)을 통해 검색 됩니다. 분명 농축 된 DNA 시퀀스 NFAT2에서 비보에의해 타겟으로하는 게놈의 지구를 대표 한다. DNA와 필요한 항 체의 선택의 적절 한 전단 하는 것이이 방법의 성공적인 응용 프로그램에 대 한 특히 중요 합니다. 이 프로토콜은 대상 유전자와 NFAT2의 직접적인 상호 작용의 데모에 이상적입니다. 그것의 주요 한계는 그대로 생물의 여러 전사 인자 들의 대상 유전자 분석 대규모 분석에 칩을 사용 하는 데 어려움.

그림 1 에서는 CLL 환자 CD19 FITC와 CD5-PE 항 체와 얼룩 후 수행의 모범 흐름 cytometry 분석. 그림 1a 는 CLL 환자의 혈액에 있는 세포의 대부분을 대표는 림프 톨의 게이팅 보여 줍니다. 그림 1b CD19의 비율을 보여줍니다+/CD5+ CLL 세포, 림프 톨이 예에서 89.03%를 대표 하는. CD19 비율+/CD5-</s...

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A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

만성 림프모구 백혈병 (CLL)은 서방 세계에서 가장 흔한 백혈병이 이다. NFAT 녹음 방송 요인 개발 및 많은 세포 유형에 활성화의 중요 한 레 귤 레이 터는. 여기, 우리 NFAT2의 소설 대상 유전자를 식별 하기 위해 인간의 CLL 세포에 chromatin immunoprecipitation (칩)의 사용에 대 한 프로토콜을 제시.

만성 림프모구 백혈병에서 소설 NFAT2 대상 유전자를 식별 하는 Chromatin Immunoprecipitation 분석 결과

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

이 방법은 잠재적인 치료 내정간섭을 개발하기 위하여 putative 표적 유전자 및 병원성 기계장치의 확인과 같은 종양학의 필드에 있는 중요한 정보를 제공하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 NFAT2 및 알려진 및 참신한 표적 유전자와의 다른 전사 인자의 상호 작용을 감지할 수 있다는 것입니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 개인은 최적의 고정 및 전단 조건이 확립되기 어렵기 때문에 어려움을 겪게 됩니다.1.5 밀리리터 튜브를 37%의 포름알데히드1밀리리터로 채우기 시작합니다. 그런 다음 또 다른 1.5 밀리리터 튜브를 PBS 의 4 밀리리터가있는 5 밀리리터 튜브에 1.25 어어 글리신1밀리리터로 채웁니다. 다음으로, 세포의 자극 후 텍스트 프로토콜에 따라 세포를 회전시키고, PBS의 500 마이크로리터에서 세포를 다시 중단하고 튜브를 얼음으로 채워진 상자에 놓는다.세포에 37%의 포름알데히드의 13.5 마이크로리터를 넣고 위아래로 배관하여 섞는다. 그런 다음 실온에서 서스펜션을 배양합니다. 그 후, 고정을 중지 1.25 어어 글리신의 57 마이크로 리터를 추가합니다.그리고 서스펜션이 실온에서 5 분 동안 배양 할 수 있도록하십시오. 잠복기 직후 세포를 얼음에 놓고 세포를 섭씨 4도에서 5분 동안 500배 G로 원심분리합니다. 그런 다음 슈퍼 네티퍼를 흡인합니다.다음으로, 4섭씨에서 5분간 200회 G에서 얼음-차가운 PBS 1밀리리터로 셀을 두 번 씻고 상수체를 제거합니다. 셀 펠릿을 리시스 버퍼 5개에서 위아래로 피펫팅하여 다시 중단합니다. 그런 다음 샘플을 얼음에 넣고 10 분 동안 흔들어 서 배양하십시오.그 후, 4섭씨에서 5분간 500회 G로 튜브를 원심분리합니다. 그런 다음 파이펫을 사용하여 상체를 조심스럽게 제거합니다. 분해 버퍼 2의 5 밀리리터에서 세포를 균질화하고 파이펫을 위아래로 혼합합니다.그런 다음 흔들림으로 10 분 동안 얼음에 세포를 배양합니다. 인큐베이션 기간 후 튜브를 섭씨 4도에서 5분간 500회 G로 원심분리하고 상퍼를 조심스럽게 제거합니다. 다음으로, 1X 프로테아제 억제제로 전단 버퍼 1에서 세포 펠릿을 다시 중단한다.그런 다음 10 분 동안 얼음에 세포 현탁액을 배양합니다. 세포 현탁액의 140 마이크로리터를 기포 형성을 피하기 위해 주의를 기울이는 초음파 튜브로 옮기. 튜브를 7°C의 초점 초음파처리에 놓고 10~7분, 1/2분간 전단을 합니다.세포 현탁액을 1.5 밀리리터 튜브로 옮기. 샘플을 섭씨 4도에서 10분 동안 15, 700회 G로 원심분리하고 새로운 튜브에서 상퍼를 수집합니다. 먼저, 1.5밀리리터 튜브 1개당 각 강수량에 대해 20마이크로리터의 단백질 A 코팅 구슬을 준비한다.구슬이 자기 랙에 1분 동안 정착하고 상체를 제거하도록 허용합니다. 그런 다음 비드를 1X 칩 버퍼 40마이크로리터로 씻어 내고, 단백질 A-코팅 구슬 20개당 위아래로 피펫팅하여 비드를 세척합니다. 구슬이 자기 랙에 1분 동안 정착하여 상퍼를 제거하도록 허용합니다.이 세척 과정을 세 번 더 반복한 후 원래 1X chIP 버퍼 1의 구슬을 다시 일시 중단합니다. BSA 프로테아제 억제제, 5X chIP 버퍼 및 ChIP-seq 등급의 물을 구슬에 추가합니다. 다음으로, 시어드 크로마틴을 추가합니다.NFAT2 항체 10 마이크로그램을 사용하여 NFAT2를 포획하고, 2.5 마이크로그램의 IgG 항체를 대조군으로 포획한다. 6RPM에서 회전하는 바퀴에 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 혼합물을 배양합니다. 다음날 7, 000회 G에서 5초 동안 튜브를 회전시키고 자기 랙에 1분 동안 배양합니다.그런 다음 슈퍼나탄을 흡인하고 1회, 2, 3, 4회 연속 으로 세척 버퍼로 구슬을 세척합니다. 7000회 G에서 튜브를 5초 간 회전한 후 자기 랙의 튜브를 1분 동안 배양합니다. 이 후 상체를 제거하고 다음 세척 버퍼를 추가합니다.마지막 세척 후, 7000 회 G.Incubate 1 분 동안 자기 랙에 튜브를 배양5 초 동안 튜브를 회전. 상체를 제거하고 용출 버퍼 100 마이크로 리터에서 구슬을 차지합니다. 그런 다음 회전 휠의 튜브를 30 분 동안 배양합니다.다음으로, 튜브를 잠시 회전시키고 1 분 동안 자기 랙에 놓습니다. 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 상체를 옮기고 용출 버퍼 2의 4 마이크로 리터를 추가합니다. 입력 제어를 만들려면 용출 버퍼 2의 99 마이크로 리터와 시어드 크로마틴의 마이크로 리터 1 개를 혼합합니다.그런 다음 65도에서 4 시간 동안 샘플을 흔들어 보배합니다. 그 후 튜브에 100%의 이소프로판올 100마이크로리터를 추가합니다. 소용돌이와 7000회 G.에서 5초 동안 샘플을 회전합니다.다음 각 샘플에 10 마이크로리터의 마그네틱 비드를 추가합니다.소용돌이와 1 시간 동안 실온에서 회전 바퀴에 샘플을 배양. 다음으로 튜브를 짧게 회전시키고 자기 랙에 1분 동안 놓습니다. 슈퍼나티를 흡인시키고 100마이크로리터의 워시 버퍼 1개에 구슬을 재보아보세요.튜브를 혼합하고 실내 온도에서 회전 바퀴에 5 분 동안 배양하는 반전. 다음으로, 튜브를 잠시 원심 분리합니다. 자기 랙에 1분 동안 놓고 파이펫을 사용하여 상체를 제거합니다.그런 다음 세척 버퍼 2의 100 마이크로 리터를 추가합니다. 튜브를 혼합하고 실내 온도에서 회전 바퀴에 5 분 동안 배양하는 반전. 그 후, 튜브를 잠시 원심분리하고 1분 동안 자기 랙에 넣습니다.포부를 통해 세척 버퍼 2개를 제거하고 용출 버퍼55 마이크로리터에서 구슬을 다시 분리합니다. 침전된 DNA를 15분 동안 실온에서 회전하는 바퀴로 샘플을 배양한다. 그 후 튜브를 짧게 회전시키고 자기 랙에 1분 동안 놓습니다.마지막으로, 새로운 1.5 밀리리터 튜브에 상체를 전송합니다. 이 프로토콜은 LCK를 잠재적NFAT2 표적으로 분석하는 Jurkat 세포로 처음 수행되었습니다. 여기서 나타난 바와 같이, 최적의 결과는 IL-2 양성 대조군 및 LCK DNA의 유의한 농축에 의해 문서화되었다.최적이 아닌 전단 또는 누락된 고정은 나쁜 질 DNA로 이끌어 낼 수 있습니다. 마지막으로, 이러한 프로토콜은 CD40L을 실험 대상으로 서 양성 대조군 및 LCK역할을 하는 1차 인간 CLL 세포로 수행되었다. LCK DNA의 강한 농축에 의해 입증된 바와 같이, LCK는 1차 인간 CLL 세포에 있는 직접적인 NFAT2 표적입니다.품질이 좋지 않은 DNA의 결과로 부적절한 전단은 최적이 아닌 결과를 반환할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 고정 및 초음파 처리 단계는이 방법의 성공을 위해 매우 중요하며 분석되는 세포로 조정해야 할 수도 있음을 기억하는 것이 중요합니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

기능 유전체학에게 검사를 활용하여 암 세포 회전 타원체 문화에 잠재적으로 소설 약 표적을 식별하는

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

연구

암 연구학

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

샘플을 측정 하는 측정 가능한 잔여 질환과 급성 골수성 백혈병에 Leukemic 줄기 세포에 대 한 프로세스 골 포괄적인 프로토콜

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Flow Cytometry 최대 백혈병 줄기 세포 주 급성 골수성 백혈병 및 환자-파생-xenografts, 진단에 따라 추정 하

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Native Chromatin Immunoprecipitation Using Murine Brain Tumor Neurospheres

네이티브 Chromatin Immunoprecipitation Murine 뇌 종양 Neurospheres를 사용 하 여

Epigenetic modifications may be involved in the development and progression of glioma. Changes in methylation and acetylation of promoters and regulatory ...

Immunoglobulin Gene Sequence Analysis In Chronic Lymphocytic Leukemia: From Patient Material To Sequence Interpretation

만성 림프모구 백혈병에서 면역 글로불린 유전자 순서 분석: 시퀀스 해석 환자 자료에서

During B cell maturation, the complex process of immunoglobulin (IG) gene V(D)J recombination coupled with somatic hypermutation (SHM) gives rise to a ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

기본 백혈병 세포의 신진 대사 프로필의 평가

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

종양 대식 세포 상호 작용을 연구 하는 시험관 내 분석

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

A Data Integration Workflow to Identify Drug Combinations Targeting Synthetic Lethal Interactions

합성 치명적인 상호 작용을 대상으로 하는 약물 조합을 식별 하기 위해 데이터 통합 워크플로우

A synthetic lethal interaction between two genes is given when knock-out of either one of the two genes does not affect cell viability but knock-out of ...

Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking

핵/세포질 단백질 인신 매매를 모니터링하기 위한 1차 만성 림프구성 백혈병 세포의 세포 분열

Nuclear export of macromolecules is often deregulated in cancer cells. Tumor suppressor proteins, such as p53, can be rendered inactive due to aberrant ...

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

표적 항원 특이적 치료 항체의 종양 및 조직 분포 분석

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...