Name: a chromatin immunoprecipitation assay to identify novel nfat2 target genes in chronic lymphocytic leukemia
Uploaded: 2018-12-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av DFG gi MU 3340/1-1 og Deutsche Krebshilfe gi 111134 (både til M.R.M.). Vi takker Elke Malenke for utmerket kundestøtte).

Alle eksperimentene utført med menneskelige materiale ble godkjent av den etiske komiteen på Universitetet i Tübingen og skriftlig samtykke ble innhentet fra alle pasienter som bidro å denne studien.
1. isolering og stimulering av Jurkat celler
Merk: For å optimalisere protokollen, bruke Jurkat celle linjen som er kjent for å uttrykke den høye nivået av NFAT2. Alle trinnene utføres under laminær strømning hette.
<ol><li>Forberede 50 mL av RPMI 1640 supp...

Viktige skritt for å utføre en vellykket ChIP-analysen er utvalget av et passende antistoff og optimalisering av chromatin klippe prosessen25. Valg av αNFAT2 antistoffer viste seg for å være spesielt utfordrende under utviklingen av denne protokollen. Det finnes flere αNFAT2 antistoffer kommersielt tilgjengelig og fleste av disse arbeider fin for vestlige blotting og andre programmer, var klone 7A6 bare antistoffer som kan brukes med hell for ChIP7. Selv tilsynelatend...

Kronisk lymfatisk leukemi (CLL) representerer de vanligste leukemi hos voksne i vestlige land, viser tydelig opphopning av CD19 og CD23 CD5 uttrykke modne B celler1. De fleste pasienter utstillingen en lat sykdom kurset, som ikke kreve spesifikk behandling i mange år. Derimot viser noen pasienter rask progresjon krever umiddelbar terapeutisk intervensjon med immun-kjemoterapi eller andre målrettet terapi2,3. Kjernefysiske faktor av aktivert T-celler (NFAT) er en familie av transkripsjonsfaktorer kontrollere ulike utviklingsmessige og aktivisering prosesser i mange celle typer4,5,6. Vi nylig viste overuttrykte og konstitusjonelle aktivering av NFAT2 i CLL celler fra pasienter med lat sykdom7. Her, regulerer den en unresponsive tilstand til B celle reseptor stimulering kalt anergy7. For å demonstrere at NFAT2 binder lymfocytt-spesifikke protein tyrosin kinase (LCK) selskapet og regulerer LCK uttrykk i menneskelige CLL celler, en bestemt chromatin immunoprecipitation analysen ble (ChIP) utviklet og ansatt.
Brikken er en av de flere teknikkene for å undersøke hvilken rolle transkripsjonsfaktorer i gene expression8. Genuttrykk er tett organisert på en svært komplisert måte av flere regulatorer med transkripsjonsfaktorer tar en uerstattelig del i denne prosessen9,10,11,12. Transkripsjonsfaktorer regulere genuttrykk i romlig og tidsmessige sammenheng er blitt identifisert i mange arter (f.eks for utvikling og differensiering)13,14,15, 16,17,18. Feil i intrikate kontrollmekanismer som involverer transkripsjonsfaktorer kan føre til en rekke patologisk prosesser inkludert kreft19,20. Identifikasjon av transkripsjonsfaktorer og deres respektive målene kan derfor tilby romanen terapeutiske veier21,22. For å undersøke dette spennende feltet finnes det flere metoder som ChIP, electrophoretic mobilitet Skift analysen (EMSA), ulike DNA rullegardinmenyen analyser og reporter-analyser8,11,12, 23 , 24.
For å demonstrere at en viss transkripsjon faktor samhandler med bestemte regioner i genomet er i vivo, . ChIP en ideell teknikk25. For dette formålet, er DNA og tilhørende proteiner i levende celler krysskoblet UV bestråling eller formaldehyd (krysskoblet ChIP, XChIP). Dette trinnet er utelatt å få bedre DNA og protein utvinning i den såkalte innfødte ChIP (NChIP)26. DNA-protein komplekser skråstilles senere av sonication i fragmenter av ca 200-500 base parene (bp) og immunoprecipitated fra celle rusk med et spesifikt antistoff mot transkripsjon faktoren av interesse. Tilknyttede DNA fragmenter er så renset og preget av PCR, molekylær kloning og sekvenser. Alternative teknikker bruke microarrays (ChIP-on-Chip) eller den neste generasjons sekvensering (ChIP-Seq) til å analysere immunoprecipitated DNA.
ChIP ble først introdusert av Gilmour og Lis i 1984 når de brukte UV lys til covalently krysskobling DNA og bundet proteiner i levende bakterier27. Cellen lyse og immunoprecipitation av bakteriell RNA polymerase, ble bestemte sonder av kjente gener brukt til kart i vivo distribusjon og tetthet av RNA polymerase. Metoden ble senere brukt av samme etterforskerne for å analysere fordelingen av eukaryote RNA polymerase II på varme sjokk protein gener i Drosophila28. XChIP analysen var fremme raffinert av Varshavsky og kolleger som først brukte formaldehyd cross-linking for å studere tilknytningen av histone H4 varme sjokk protein gener29,30. NChIP tilnærming, som bærer fordelen av en bedre DNA og protein utvinning på grunn av naturlig intakt epitoper og, derfor større antistoff spesifisitet, ble først beskrevet av Hebbes og kolleger i 198831.
Fordelen med ChIP i forhold til andre teknikker for å analysere DNA-protein interaksjoner er faktisk at faktiske samspillet av en transkripsjon faktor kan være undersøkt i vivo og ingen sonder eller kunstig betingelser som buffere eller gels ansatt8,11,12. Ved å kombinere ChIP med neste generasjons sekvensering, kan flere mål identifiseres samtidig.
Store begrensninger av denne teknikken er den begrenset bruksområde omfattende analyser i intakt organismer25. Analyse av differensial genet uttrykk mønstre kan også være utfordrende med ChIP teknikker hvis respektive proteiner uttrykkes bare i lave nivåer eller under smale tidsvinduer. En annen potensielt begrensende faktor er tilgjengeligheten av et passende antistoff egnet for ChIP11.
ChIP protokollen presenteres her kan være ansatt i vivo identifikasjonen av målet gener av en transkripsjon faktor av kvantitative sanntid PCR (qRT-PCR). Spesielt var målet å identifisere romanen målet gener av NFAT2 i CLL. ChIP ble valgt fordi dens potensiale direkte demonstrere binding av NFAT2 til regionene arrangøren av ulike gener under naturlige forhold i CLL pasienten menneskeceller.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 X PBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube shaker Themomixer comfort</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5355 000.011</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Bolt Sample Reducing Agent</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X Bolt MES SDS Running Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 % Formaldehyde p.a., ACS</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4979.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4X Bolt LDS Sample Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NFAT2 antibody</td>
			<td>Alexis</td>
			<td>1008505</td>
			<td>Clone 7A6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NFAT2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>8032S</td>
			<td>Clone D15F1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NFAT2 antibody ChIP Grade</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab2796</td>
			<td>Clone 7A6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>big Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804R</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19-FITC mouse Anti-human</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555412</td>
			<td>Clone &#160;HIB19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD5-PE mouse Anti-human CD5&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555353</td>
			<td>Clone &#160;UCHT2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient medium Biocoll&#160; (Density 1,077 g/ml)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>L 6115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tube 1.5 mL</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS superior</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S0615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSCalibur</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>78440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Gel Transfer Device</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IB21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Transfer Stacks, nitrocellulose, regular size</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IB23001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iDeal ChIp-seq kit for Histones</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin calcium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I3909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 680LT Donkey anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5 mg</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>926-68023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Goat anti-Mouse IgG (H + L), 0.1 mg</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>925-32210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LI-COR Odyssey Infrared Imaging System</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>B446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4729692001</td>
			<td>Can be substituted with other plates in different real-time PCR instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Solution&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; OptiLyse B</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>IM1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M220 AFA-grade water</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M220 Focused-ultrasonicator</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>500295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic rack, DynaMag-15 Magnet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12301D</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Axiovert 25</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>451200</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>520045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer improved counting chamber</td>
			<td>Karl Hecht GmbH &#38;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Co KG</td>
			<td>40442012</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4 Heparin Monovette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>02.1064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey&#174; Blocking Buffer (TBS) 500 mL</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>927-50000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 100X</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A2213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerfeCTa SYBR Green FastMix</td>
			<td>Quanta Bio</td>
			<td>95072-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer CD40L promotor region forward</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-ACTCGGTGTTAGCCAGG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer CD40L promotor region reverse</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer IL-2 promotor region forward</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer IL-2 promotor region reverse</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer LCK promotor region forward</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer LCK promotor region reverse</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit mAb IgG XP Isotype Control</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td># 3900S</td>
			<td>Clone DA1E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-time PCR instrument</td>
			<td>Roche</td>
			<td>LightCycler 480</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller mixers</td>
			<td>Phoenix Instrument</td>
			<td>RS-TR 5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>61870010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety-Multifly-needle 21G</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>851638235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>LC5925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker Duomax 1030</td>
			<td>Heidolph Instruments</td>
			<td>543-32205-00</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Heraeus Fresco 17</td>
			<td>Can be substituted with similar instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#223;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Buffered Saline (TBS-10X)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#12498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>93595-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a chromatin immunoprecipitation assay to identify novel nfat2 target genes in chronic lymphocytic leukemia

Kronisk lymfatisk leukemi (CLL) er preget av utvidelse av ondartet B-cellen kloner og representerer den vanligste leukemi i vestlige land. Fleste CLL pasienter viser en lat Sykdomsforløp samt en anergic fenotypen av leukemi celler, henviser til en B-celle reseptor slutter å svare på ytre stimulering. Vi har nylig vist at transkripsjon faktoren NFAT2 er en viktig regulator av anergy i CLL. En stor utfordring i analysen av rollen som en transkripsjon faktor i ulike sykdommer er identifikasjonen av sin bestemt mål gener. Dette er av stor betydning for utviklingen av pathogenetic mekanismer og potensielle terapeutiske tiltak. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) er en klassisk teknikk å demonstrere protein-DNA interaksjoner og kan derfor brukes til å identifisere direkte mål gener av transkripsjonsfaktorer i pattedyrceller. Her, ble ChIP brukt til å identifisere LCK som en direkte mål genet av NFAT2 i menneskeceller CLL. DNA og tilhørende proteiner er krysskoblet med formaldehyd og senere skåret av sonication i DNA fragmenter av ca 200-500 base parene (bp). Krysskoblede DNA fragmenter forbundet med NFAT2 er så selektivt immunoprecipitated fra celle rusk å bruke et αNFAT2 antistoff. Etter rensing oppdages tilknyttede DNA fragmenter via kvantitative sanntid PCR (qRT-PCR). DNA-sekvenser med tydelig berikelse representerer områder i genomet som er angitt av NFAT2 i vivo. Aktuelle klipping av DNA og valg av nødvendige antistoffer er spesielt viktig for bruk av denne metoden. Denne protokollen er ideell for demonstrasjon av direkte vekselsvirkningene av NFAT2 med mål gener. Dens stor begrensning er vanskeligheten å ansette ChIP i store analyser analysere målet genene for flere transkripsjonsfaktorer i intakt organismer.

Figur 1 viser en eksemplarisk flyt cytometri analyse av en CLL pasient utført etter farging med CD19-FITC og CD5-PE antistoffer. Figur 1a viser gating av lymfocytter, som representerer fleste cellene i blodet til CLL pasienter. Figur 1b viser andelen CD19+/CD5+ CLL celler, som representerer 89.03% av lymfocytter i dette eksemplet. Andelen CD19+/CD5- B-cell...

Watch this Scientific Journal Video about A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia at JoVE.com

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

Kronisk lymfatisk leukemi (CLL) er den vanligste leukemi i den vestlige verden. NFAT transkripsjonsfaktorer er viktig regulatorer og aktivisering i rekke celletyper. Her presenterer vi en protokoll for bruk av chromatin immunoprecipitation (ChIP) i CLL menneskeceller å identifisere romanen målet gener av NFAT2.

En Chromatin Immunoprecipitation analysen identifisere romanen NFAT2 målet gener i kronisk lymfatisk leukemi

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

Denne metoden kan bidra til å gi viktig informasjon innen onkologi som identifisering av antatte målgener og patogene mekanismer for å utvikle potensielle terapeutiske inngrep. Den største fordelen med denne teknikken er at man kan oppdage samspillet mellom NFAT2 og andre transkripsjonsfaktorer med kjente og nye målgener. Vanligvis vil personer som er nye på denne metoden slite fordi optimal fiksering og skjærforhold er vanskelige å etablere.For å begynne å fylle et 1,5-milliliter rør med en milliliter 37% formaldehyd. Fyll deretter et annet 1,5-milliliter rør med en milliliter 1,25 molarglysin i et fem milliliter rør med fire milliliter PBS. Deretter, etter stimulering av cellene spinne cellene i henhold til tekstprotokollen, og re-suspendere cellene i 500 mikroliter pbs og plassere røret i en isfylt boks.Tilsett 13,5 mikroliter med 37% formaldehyd til cellene og bland ved å pipetter opp og ned. Inkuber deretter suspensjonen ved romtemperatur. Etter dette legger du til 57 mikroliter med 1,25 molarglysin for å stoppe fikseringen.Og la suspensjonen inkubere ved romtemperatur i fem minutter. Umiddelbart etter inkubasjonsperioden plasserer cellene på is og sentrifuger cellene ved 500 ganger G i fem minutter ved fire grader Celsius. Deretter aspirerer du overnatanten.Deretter vasker cellene to ganger med en milliliter iskald PBS ved 200 ganger G i fem minutter ved fire grader Celsius og fjerner det overnaturlige. Resuspend cellepellet i fem milliliter lysis buffer en ved pipettering opp og ned. Legg deretter prøvene på is og inkuber dem med risting i 10 minutter.Etter dette sentrifuger rørene ved 500 ganger G i fem minutter ved fire grader Celsius. Bruk deretter en pipette til å forsiktig fjerne det overnaturlige. Homogenisere cellene i fem milliliter lysis buffer to og pipette opp og ned for å blande.Deretter inkubere cellene på is i 10 minutter med risting. Etter inkubasjonsperioden sentrifuger rørene ved 500 ganger G i fem minutter ved fire grader Celsius, og fjern forsiktig supernatanten. Deretter bruker du cellepelleten i klippingsbuffer en med 1X proteasehemmer.Deretter inkubere cellesuspensjonen på is i 10 minutter. Overfør 140 mikroliter av cellefjæringen til sonicatorrør som tar vare på å unngå å danne luftbobler. Plasser rørene i en fokusert ultralydsmann ved syv grader Celsius og skjær i 10 til syv og 1/ 2 minutter.Overfør cellefjæringen til 1,5 milliliter rør. Sentrifuge prøvene ved 15 700 ganger G i 10 minutter ved fire grader Celsius, og samle supernatant i et nytt rør. Først forberede 20 mikroliter protein A-belagt perler for hver nedbør i ett 1,5-milliliter rør.La perlene bosette seg på et magnetisk stativ i ett minutt, og fjern supernatanten. Vask deretter perlene med 40 mikroliter 1X chip buffer en for hver 20 mikroliter protein A-belagt perler ved å pipettere opp og ned. La perlene bosette seg på et magnetisk stativ i ett minutt og fjern det overnaturlige.Gjenta denne vaskeprosessen tre ganger til før du suspenderer perlene i sitt opprinnelige volum på 1X chIP-buffer en. Tilsett BSA proteasehemmer, 5X chIP-buffer og ChIP-seq-graders vann til perlene. Deretter legger du til det skjærte kromatinet.Bruk 10 mikrogram anti-NFAT2 antistoff for å fange NFAT2, og 2,5 mikrogram IgG antistoff som en kontroll. Inkuber blandingene over natten ved fire grader Celsius på et hjul som roterer ved seks RPM. Neste dag spinner rørene i fem sekunder ved 7000 ganger G og inkuberer dem på magnetstativet i ett minutt.Deretter aspirerer du overnaturanten og vask perlene en gang med vaskebuffere en, to, tre og fire etter hverandre. Spinn rørene i fem sekunder ved 7000 ganger G før du inkuberer rørene på magnetstativet i ett minutt. Deretter fjerner du supernatanten og legger til neste vaskebuffer.Etter siste vask spinner du rørene i fem sekunder ved 7000 ganger G.Inkubere rørene på magnetstativet i ett minutt. Fjern det overnaturlige og ta opp perlene i 100 mikroliter av elution buffer en. Inkuber deretter rørene på det roterende hjulet i 30 minutter.Deretter spinner du kort rørene og plasserer dem på et magnetisk stativ i ett minutt. Overfør det overnaturlige til et nytt 1,5-milliliter rør og legg til fire mikroliter elutionbuffer to. For å lage inngangskontrollblandingen blandes en mikroliter av det skjærte kromatinet med 99 mikroliter elutionbuffer en og fire mikroliter med elutionbuffer to.Deretter inkuber prøvene i fire timer ved 65 grader Celsius med risting. Etter dette legger du til 100 mikroliter på 100% isopropanol til rørene. Vortex og spinn prøvene i fem sekunder på 7000 ganger G.Legg deretter til 10 mikroliter magnetiske perler til hver prøve.Vortex og inkuber prøvene på et roterende hjul ved romtemperatur i en time. Deretter spinner du rørene kort og plasserer dem på et magnetisk stativ i ett minutt. Aspirer de overnaturante og resuspend perlene i 100 mikroliter vaskebuffer en.Inverter rørene for å blande og inkubere dem i fem minutter på et roterende hjul ved romtemperatur. Deretter sentrifugerer rørene kort. Plasser dem i et magnetisk stativ i ett minutt, og bruk en pipette til å fjerne supernatanten.Legg deretter til 100 mikroliter vaskebuffer to. Inverter rørene for å blande og inkubere dem i fem minutter på et roterende hjul ved romtemperatur. Etter dette sentrifuger rørene kort og plasserer dem i et magnetisk stativ i ett minutt.Fjern vaskebufferen to via aspirasjon og gjenoppusst perlene i 55 mikroliter elution buffer. For å elute det utfelte DNA inkubere prøvene i et roterende hjul ved romtemperatur i 15 minutter. Etter dette spinner du rørene kort og plasserer dem i et magnetisk stativ i ett minutt.Til slutt overfører du det overnaturlige til nye 1,5-milliliter rør. Denne protokollen ble først utført med Jurkat-celler som analyserte LCK som et potensielt NFAT2-mål. Som vist her, ble optimale resultater dokumentert ved betydelig berikelse av IL-2 positiv kontroll og LCK DNA.Suboptimal klipping eller manglende fiksering kan føre til dårlig kvalitet DNA. Til slutt ble denne protokollen utført med primære menneskelige KLL-celler med CD40L som den positive kontrollen og LCK som eksperimentelt mål. Som demonstrert av den sterke berikelsen av LCK DNA, er LCK et direkte NFAT2-mål i primære humane KLL-celler.Utilstrekkelig klipping som resulterer i dårlig kvalitet DNA kan returnere suboptimale resultater. Mens du prøver denne prosedyren er det viktig å huske at fiksering og sonikering trinnene er avgjørende for suksessen til denne metoden, og må kanskje justeres til cellene som analyseres.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Utnytte Funksjonell genom Screening for å identifisere potensielt Novel narkotika mål i Cancer Cell spheroid kulturer

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Omfattende protokoll for å prøve og prosessen benmarg for å måle målbare gjenværende sykdom og Leukemic stamceller i akutt myelogen leukemi

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Flow cytometri å anslå leukemi stamceller i primære akutt myelogen leukemi og pasient-avledet-xenografts, diagnose og følge opp

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Native Chromatin Immunoprecipitation Using Murine Brain Tumor Neurospheres

Native Chromatin Immunoprecipitation med Murine hjerne svulst Neurospheres

Epigenetic modifications may be involved in the development and progression of glioma. Changes in methylation and acetylation of promoters and regulatory ...

Immunoglobulin Gene Sequence Analysis In Chronic Lymphocytic Leukemia: From Patient Material To Sequence Interpretation

Immunglobulin Gene Sequence Analysis i kronisk lymfatisk leukemi: Fra pasienten materiale til sekvens tolkning

During B cell maturation, the complex process of immunoglobulin (IG) gene V(D)J recombination coupled with somatic hypermutation (SHM) gives rise to a ...

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

Vurdering av metabolske profilen til primære leukemi celler

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

In vitro-analysen for å studere tumor-macrophage interaksjon

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

A Data Integration Workflow to Identify Drug Combinations Targeting Synthetic Lethal Interactions

En arbeidsflyt for dataintegrering for å identifisere stoffkombinasjoner rettet mot syntetiske dødelige interaksjoner

A synthetic lethal interaction between two genes is given when knock-out of either one of the two genes does not affect cell viability but knock-out of ...

Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking

Subcellulære Fraksjonering av primær kronisk lymfatisk leukemi celler til å overvåke kjernefysisk/cytoplasmatiske protein smugling

Nuclear export of macromolecules is often deregulated in cancer cells. Tumor suppressor proteins, such as p53, can be rendered inactive due to aberrant ...

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

Analysere tumor- og vevsfordeling av målantigenspesifikt terapeutisk antistoff

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...